Protocol
Hayvanları kapsayan tüm işlemler uygun hayvan kullanımı ile onaylanmasını sağlayın ve vücut bakımı.
1. Advance Stok Tamponlar hazırlayın
- 2 L'stok Ca2 + içermeyen Tyrode (Tablo 1) hazırlayın. NaOH ile 7.4 'e pH ayarlayın.
- 2 L'stok ve 1.2 mM Ca2 + Tyrode (Tablo 2) hazırlayın. NaOH ile 7.4 'e pH ayarlayın.
Deney gününde 2. Perfüsvonun, Transferi ve Sindirim Tamponlar hazırlayın
- Ca 2 + Tyrode (Tablo 3), 150 ml perfüzyon tamponu hazırlayın ve bir 0.2 mikron filtre içinden süzme.
- 35 ml hazırlayın Ca 2 + bedelsiz "Tampon A" "Tampon B" (Tablo 5) içeren (Tablo 4) ve 25 ml Ca 2 +. 0.2 mikron filtre aracılığıyla her filtre.
- 0 çözümler hazırlayın.06, 0.24, 0.6, ve karıştırma Tampon A 1.2 mM Ca 2 + ve B Tablo 6 başına.
- Fare vücut ağırlığı (BW) göre 25 mi perfüzyon tamponu (Tablo 7) olarak sindirim enzimleri eritilerek 25 mi sindirim tamponu hazırlayın. Kullanılmadan önce bir 0.2 mikron filtre içinden süzme.
3. Deney Düzeneği
- Mevcut piyasada bulunan ya da 3 ml'lik bir akış oranı izin vermek için bir peristaltik pompa, boru ve bir ısı değiştirici sargı kullanılarak, sabit bir akış Langendorff cihazına monte / 37 ° C'ye kadar ısıtıldı perfüzyon dak. Basit şematik Bell tarafından 2011 gözden sağlanan, ark 18 edilir.
- Kanül dışarı akış 3 mL / dakikalık bir akış hızında 37 ° C üstünde olacak şekilde, Langendorff aparatındaki dolaşan su banyosu sıcaklığı (~ 47 ° C) ayarlayın.
- Ultra saf tip I, 100 ml su, ardından 15 dakika boyunca perfüzyon sistemine,% 70 etanol ile çalıştırın. Sistemli Run perfüzyon tampon5 dakika boyunca m hava kabarcıklarını ortadan kaldırılmaktadır.
- İstediğiniz bir yöntem ile tüm cerrahi aletleri sterilize.
- Bir 23 G Luer adaptörü saplama ucu PE-50 boru kısa bir parça (yaklaşık 3 mm) takılarak kanül oluşturun. Boru ısı ucu aort yerleştirilmiş olacak, üzerinde bir dudak oluşturmak için.
4. kardiyomiyosit İzolasyon
- Intraperitoneal enjeksiyon ile, 0.2 ml heparin solüsyonu (1000 lU / ml) ile fare enjekte edilir.
- 5 dakika sonra, izofluoran fare uyutmak. Tam (güçlü ayak tutam hiçbir yanıt) anestezi yaparken,% 70 etanol ile göğüs püskürtün. , Göğüs açın çabuk 4 ° C perfüzyon tamponunda aorta ve yer zarar vermemek için dikkatli olmak, kalbini kesip. Kavramak ve kalp altında kaldırmak için kavisli bir forseps kullanın. Bu ince makas ile kalbin arkasında ekleri kırpmaya alan oluşturur.
- Yavaşça ince forseps iki çift aort tutup ve dikkatli bir şekilde openi çekerek kalp Cannulatekanülün dudak aort ng. Bu koroner damar yoluyla kalbin perfüzyon inhibe gibi, kanül ucu aort kapağı geçmiş ve ventrikül içine olmadığından emin olun.
- Hemen kanülün dudak üzerinde aorta çevresinde 5-0 ipek sütür bir döngü bağlayarak kanüle aorta edin.
- Not: 4.4 ile 4.2 mümkün olduğunca çabuk en kaliteli sindirim için tamamlanmalıdır Adımlar.
- Not: Kalp daha önce perfüzyon tampon akan Langendorff cihazına takılı bir kanül üzerine direkt olarak monte edilebilir. Bununla birlikte, bir teşhir mikroskopu altında perfüzyon tamponu küçük bir şınngaya bağlanmış bir kanül üzerine kalp asılı çok başarılı olduğu bulunmuştur. Bu perfüzyon tamponu bir miktar koroner arterlerin temizlenmesi için takip ve güvenli bir şekilde kanül bağlı kalp sağlanması vasıtasıyla itilmesine izin verir. Sonra kanül perfüzyon tampon çalışan Langendorff'a asılır.
- Perfuse2-3 dakika boyunca 3 ml / dakikalık bir akış hızında serbest Ca2 + perfüzyon tamponu ile kalp.
- Sindirim tampon enzim ve 7-10 dakika boyunca serpmek geçmek, kalp renkli yumuşak ve hafif olacak.
- Not: Sindirim zaman enzim aktivitesi ve kalp büyüklüğüne göre ayarlanabilir.
- Kalp palpably sarkık sonra, Tampon A (Ca 2 + bedelsiz tamponu) ile steril bir p60 çanak kanül ve yerden kalp kaldırmak.
- Atriumlarm ve büyük damarları çıkarın. İsterseniz sağ ventrikül çıkarın. Forseps ile, küçük parçalar halinde ventrikül ayrı. 5 ml steril bir transfer pipet ile birkaç kez pipet başka hücreleri dağıtmak için.
- 250 um naylon ağ filtre içerisinden 50 ml konik tüp içine hücre süspansiyonu filtre edin.
- Süspansiyon, yaklaşık 10 dakika boyunca pelet izin verin.
- 0.06 mM Ca 2 + çözeltisi içine pelet aktarın. Hücreler, 10 dakika boyunca pelet izin verin. En ölü hücreler yüzer olurken Sağlıklı hücreler, pelet olacaktır. Süpernatanı havalandırın, ve 0.24 mM Ca 2 + çözeltisine pelet aktarın.
- 10 dakika inkübasyon, aspirasyon tekrarlayın ve hücreler 1.2 mM çözelti haline gelene kadar kalan iki Ca 2 + çözümleri ile aktarın. Bu noktada, hücrelerin çoğunluğunun çubuk şekilli miyositler olmalıdır.
5. Ölçme Kasılma ve Kalsiyum Geçişler
- Not: kontraklil ve kalsiyum geçici Hem eş zamanlı olarak ölçülebilir.
- 1 mg / ml arasında bir konsantrasyonda susuz DMSO içinde yeniden süspanse edilerek Fura-02:00 çözelti hazırlayın. Fura-02:00 solüsyonu, -20 ° C'de bir desikatör içinde saklanabilir.
- Yük 1 ul Fura-02:00 ile suspensiyon halindeki hücreler 1 ml. Hücreler koyu 10 dakika sonra aspire yüzer oturmak için izin verin. Hücreler yıkandı ve yıkamalar arasında 10 dakika boyunca karanlıkta pelet sağlayan, Ca 2 + Tyrode çözeltisi ile iki kez yıkayın.
- Isıtmalı pe sağlayan bir sahne prospektüste bir cam lamelBir miyositlerdeki alan uyarıcı ile volta rfusion / aspirasyon ve elektrot. Ters mikroskop yerleştirin sahne insert bir immersiyon yağı hedefi kullanıyorsanız lens petrol bir damla ekleyerek, floresan ölçümü için ayarlanmış.
- 1.2 mM Ca 2 + tirod çözeltisi ısıtmalı yerçekimi perfüzyon kurmak sahnede çözelti 37 ° C ulaşır böylece. Vakum aspirasyon takın. Elektrotlar takın.
- Mikroskop sistemi açın ve rasyometrik floresan ve hücre boyutlandırma veri toplama yazılımı açın.
- An perfüzyon engelleme sağlıklı hücreleri yerleşmek için izin, sahne inserte Fura-02:00 yüklü hücrelerin birkaç damla ekleyin.
- Istenen hücreyi bulmak için 40X objektif kullanın. Sağlıklı bir hücre çubuk şeklinde ve kendiliğinden sözleşme olmamalıdır. Bu gözle görülür ve eşit sözleşme cep 5-20 V'de tempolu gerektiği zaman
- Not: Fizyolojik analizi, yüksek kaliteli parçalanıp sindirilmesi gerekmektedir. Bu sağlıklı görünüyorsun ama pa yok hücrelere sahip olmaları mümkündür fizyolojik analizi için de ce. Sindirim protokol, yüksek kaliteli, sağlıklı miyositleri almak için arıtma gerekebilir. Ayrıca, mutant veya hastalıklı kalpleri protokol değişiklikleri gerektirebilir.
- Objektif rotasyon ve değişim diyafram böylece istenilen hücre ekran ve arka plan üzerinde yatay dizilmiş olan Ayarı görünür değil.
- Miyositinin her sonuna kadar kenar algılama barlar hizalayın ve eşiği ayarlayın. Düzgün sarkomer ile hücrenin bir kısmı üzerinde sarkomer algılama hizalayın. Artık size bu bar yapabilirsiniz, sarkomer uzunluğunun daha doğru matematiksel model bu kadar uzun sarkomer iki popülasyonları üzerinde değil gibi olacaktır.
- Pace hücreleri 2 Hz ve kayıt önce 10-15 saniye boyunca 5-20 V.
- Kayıt izleme. Ortam ışığı iyi kalsiyum geçici kayıt için minimize edilmelidir.
6. Analiz
- Rasyometrik floresan ve hücre boyutlandırma veri toplama yazılımı kullanarak izlerini analiz edin.
- Fiksasyon ve immün, doğrudan ilaç etkileri, kısa vadeli kültürü ve atomik kuvvet mikroskobu değerlendirirken: Bu protokol dahil olmak üzere diğer deneyler çeşitli için kullanılabilir fazla hücreleri sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kontraklil ve geçici kopyalamaları (Şekil 2) toplandığında, verileri kolayca uygun yazılım ile analiz edilir. Bütün izleme, veya bunların kısımları (Şekil 3) ortalama edilebilir. Kasılma çeşitli yollarla analiz edilebilir. Sistolik fonksiyonu için, bir kısalma zirve fraksiyonel kısalma, ya da zamanla daralma hızı ile kasılma büyüklüğünü ve daralma hızı değerlendirmek. Diyastolik fonksiyon% 50 kısalma ve gevşeme hızı zaman ile benzer şekilde analiz edilebilir. Kalsiyum geçişlerini, benzer veri taban ve tepe Fura-2 oranları ve zaman zirve ya da başlangıca (Tablo 8) dahil olmak üzere mukayese edilebilir. Bu analizler benzer tüm organ disfonksiyonu olan bir kalp değişmiş olabilir herhangi biri sistolik ve diyastolik hücresel kasılma fonksiyonu WT ve KO kalpler, yanı sıra kalsiyum akı, karşılaştırılabilir veriler sağlamaktadır. Ayrıca, aynı izolasyonu hücresi olabilirimmunohistokimyasal lekeleme (Şekil 4) da dahil olmak üzere, protokolde sıralanan diğer deneyler için de kullanılabilir.
| Ca2 + içermeyen Tyrode | mM | FW / yoğunlaştırma | Miktar, 2 L çözeltisi için |
| NaCl | 135 | 58.44 g | 15.8 g |
| KCl | 4 | 74.56 g | 0.596 g |
| MgCI2 | 1 | 1 M | 2 mi |
| Hepes | 10 | 238.31 g | 4.77 g |
| NaH'den 2 PO 4 | 0.33 | 141.96 g | 0.094 gr |
Tablo 1. Kalsiyum içermeyen Tyrode çözeltisi - ReageHisse senedi Ca 2 + -ücretsiz Tyrode çözeltisi 2 L NTS.
| 1.2 mM Ca 2 + Tirod | mM | FW / yoğunlaştırma | Miktar, 2 L çözeltisi için |
| NaCl | 137 | 58.44 g | 16 g |
| KCl | 5.4 | 74.56 g | 0.805 gr |
| MgCI2 | 0.5 | 1 M | 1 mi |
| Hepes | 10 | 238.31 g | 4.77 g |
| CaCl2 · 2H 2 O | 1.2 | 147.01 g | 0.353 gr |
Tablo 2. 1.2 mM Kalsiyum Tirode çözümü - stokunun 1.2 mM Ca 2 L Reaktifler 2+Çözelti.
| Perfüzyon Tampon | mM | FW | 150 ml Ca miktarı 2 + ücretsiz Tirod |
| Glikoz | 10 | 180.16 g | 0.27 gr |
| 2,3-Butandion-monoxime (BDM) | 10 | 101.11 g | 0.152 g, |
| Taurin | 5 | 125.16 g | 0.094 gr |
Tablo 3. Perfüzyon Tamponu - Reaktifler deney gününde perfüzyon tamponu hazırlamak için.
| Tampon A | Perfüzyon tamponu 35 mi |
| Sığır serum albümini (BSA) | 0.175 g |
Tablo 4. Tampon A - Reaktifler deney gününde Tampon A hazırlamak.
| Tampon B | mM | FW | Ca 2 + 25 mi Tyrode tamponu |
| Glikoz | 5 | 180.16 g | 0.0225 g |
Tablo 5. Tampon B - Reaktifler deney gününde Tampon B hazırlamak.
| Buffer Transferi | Tampon A (mi) | Tampon B (mi) |
| 0.06 mM Ca 2 + | 9.5 | 0.5 |
| 0,24 mM Ca 2 + | 8 | 2 |
| 0.6 mM Ca 2 + | 5 | 5 |
| 1.2 mM Ca 2 + | 0 | 10 |
Tablo 6. Aktarım Tamponu - Reaktifler deney gününde transfer tamponu hazırlamak.
| Enzim Sindirim Tampon | Perfüzyon tamponu 25 mi |
| Kolajenaz B | 0.4 mg / g vücut ağırlığı |
| Kolajenaz D | , 0.3 mg / g vücut ağırlığı |
| Proteaz XIV | 0,05 mg / g vücut ağırlığı |
Tablo 7. Enzim Sindirim Tampon - Reaktifler enzim di hazırlamakDeney gününde gestion tamponu.
| Kasılma | |
| Baseline | 1.73 mikron |
| Tepe | 1.64 mikron |
| Fraksiyonel kısaltılması | 4.70% |
| Zaman zirve | 0.056 sn |
| % 50 başlangıca Zaman | 0.043 sn |
| Kalsiyum geçici | |
| Baseline | 1.18 |
| Tepe | 1.32 |
| Zaman zirve | 0.021 sn |
| % 50 başlangıca Zaman | 0.083 sn |
Tablo 8. Kasılma ve kalsiyum geçici analiz eder. K = 5.
Deneysel tasarım 1. Genel bakış Şekil. A) Kalp enzim sindirim tamponu. B) koroner perfüzyon yoluyla sindirilir Hücreleri bireysel, sağlıklı miyositlere dağıtılır. Hücreleri kalsiyum hoşgörülü. Ge böylece haline C) Hücreler sırasıyla artan kalsiyum konsantrasyonları ile aktarılır) Hücreler bağımlı kalsiyum ile yüklenir boya, Fura-2 AM düzenlenmiştir. D) Yüklü hücreleri elektrik sarkomer uzunluğu, hücre boyu, ve floresan kaydedilir ise tempolu. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. A) Örnek contracinfertilitedir vs zamanı. vs zaman Fura-2 oranı tarafından temsil B) Örnek kalsiyum geçici sarkomer uzunluğu ile temsil trasesin. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. A) analizi. B'den sonra Ortalama kontraktilitesi izleme) analizinden sonra kalsiyum geçici ortalaması. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kardiyomyosit sitoiskeleti (α-aktinin) Şekil 4. Immunofluorescent boyama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalite kardiyomiyositlerin izolasyonu uygulama ve optimizasyon bazı düzeyi gerektirir. Bu protokol büyük ölçüde sindirim sonucunu etkileyecek önemli adımları içermektedir. Performans ve protokol giderirken bu dikkatle düşünülmelidir. Kanülasyon ve perfüzyon için kalp kaldırılması süre az, ideal olarak, beş dakikadan daha aza düşürülmesi gerekmektedir. Buz soğukluğunda tamponda kalp fare çıkarılması ve kesme ve kanüle sonra buz soğukluğunda perfüzyon tampon maddesi içinde hemen kalp durulama da kaliteli bir sindirim şansını arttıracaktır. Kanülasyon kendisi kritik bir adımdır. Bu koroner arterlerin perfüzyonu önleyecek şekilde kanül ucu değil, ventrikül içine aort kapağı içinden aortun ilk dalları altına yerleştirilmelidir. Koroner perfüzyon kaliteli bir sindirim için gereklidir. Bu laboratuvarda, kanül perfüzyon tamponu ile doldurulmuş bir şırınga takılır. Yavaşça bir küçük enjekteMontaj ve kan net koroner arterler kanül yeterliliğini test edebilirsiniz izledikten sonra perfüzyon tamponu l miktarı.
Bu protokolü Sorun Giderme dikkatle yukarıda belirtilen kritik adımları değerlendirilmesini içermektedir. Kalp, sindirim sırasında hissedilir yumuşak hale gelmezse, birkaç potansiyel nedenleri vardır. İlk olarak, kanülasyon sırasında kanülün ucunun, koroner arterlerin ile perfüzyon önlenmesi, aort kapağı çok ötesine olabilir. Bu Langendorff cihazı üzerine kalp asılı ancak bir şırınga ile, kanül yoluyla, perfüzyon tamponuna bir miktar itme kan ve berrak, koroner arterlerin dikkatle takip önce değerlendirilebilir. Perfüzyon yeterli ama eğer kalp, iyi sindirmek enzimlerin farklı partileri satın dikkate almaz. Enzimler aslında karışımlar olduğundan, bir sürü aynı hareket yok. Her enzimin küçük miktarlarda satın öneririz. Çok, purc iyi sindirmek olduğu tespit edildiğindeileride kullanmak için bu çok büyük miktarlarda hase. Tartışıldığı gibi kalp diseksiyonu ve kanulasyonun daha uzun 5-10 dakika sürer, eğer sindirilmiş hücrelerin kalitesi kötü olabilir. Nakavt veya tedavi edilen hayvanlarla geçmeden önce diseksiyonu master yabani türü veya tedavi edilmemiş hayvanlar ile tamamlayan izolasyonların düşünün. Sindirimden sonra, hücreler kalsiyum yavaşça dayanıklı yapılmalıdır gerekir. Hücreler, kalsiyum çözeltinin her birinde en az 10 dakika harcamak gerekir. Bu adımları acele hücrelerin verimini ve yaşayabilirliğini de azaltabilir.
Tekrarlanabilir de, fizyolojik ölçümler kaliteli bir sindirme ile başlayan bağlıdır. Ölçmek için hücreleri seçerken, kendiliğinden bir sızdıran, hasarlı hücre zarı gösterir, sözleşme değildir hücreleri seçin. Tempolu zaman Hücreler eşit sözleşme olmalıdır. Kasılma tutarlılığı sağlamak için ölçümler kayıt önce 10-15 sn için hücreleri kalp pili düşünün. Hücre görünürse eşit daralan, fakat CO 'ölçümlerintraction büyüklüğü büyük ölçüde zamanla, ilk tanımlanan ilgi bölgesi sarkomer sadece bir nüfusu kapsayan emin olmak için kontrol edin değişir. Bazen iki hücre birbirine grubu ve faiz (ROI) bölgelerinden birisi olarak sarkomerinde iki farklı popülasyonlarını ölçmeye olabilir. Uygun bir ROI seçilmiş fakat büzülme tek bir hücre içinde değişken ise, hücre boyama olabilir ve bir başka hücre seçilmelidir. Kalsiyum geçici için, su işlevsel mevcuttur Fura-02:00 miktarını değiştirir gibi kurutulur susuz DMSO Fura-02:00 sulandırmak için kritik öneme sahiptir. Yükleme işleminden sonra, bütün Fura-02:00 hücre içinde de-esterleştirmek izin vermek için birinci yıkama ve ölçüm geçici arasında en az 20 dakika izin verir. Herhangi bir floresan boya gibi, sırasında ve yüklemeden sonra ışıktan hücreleri korumak. Bazı hücreler, böylece arada bir kalsiyum geçici ölçülü bir hücrede gözlenecektir boya, alıma olmayacaktır. Kontraklil ve kalsiyum geçici kopyalamaları "görünsedüzenleme hızı, büyük ölçüde (0.5-1 Hz) azalır temiz "ölçümler yakın fare kalp atış hızı, tercih edilen en azından 2 Hz, böylece bir hızda bir hızda daha fazla fizyolojik bulunmaktadır.
Arzu edildiği takdirde yalıtım kendisi değiştirilebilir. Bu laboratuar perfüzyon sırasında sabit bir akış yöntemi (fareler için 3 ml / dakika) kullanır. Bazı gruplar bir yerçekimi daha etkili akış bulduk. Sindirim daha kolay kalp gibi akış hızı artar sindirilir olarak görselleştirilebilen için yerçekimi akış perfüzyon sağlar.
Bahsedildiği gibi, bu teknikler sınırlamaları taşırlar yapmak. Fizyolojik ölçümler kalitesi sindirim kalitesine bağlı olduğundan, her deney koşulu için birden fazla kalp miyositleri ölçmek için akıllıca olur. Her kalp ölçmek için birçok miyositleri sağlayacaktır, fakat tekrar sindirimler sonuçları kalpler arasında tutarlı olmasını sağlayacaktır. Deney tasarımı foll içeriyorsa İzolasyon, böylece, bir terminal işlemdirzamanla bir hayvanın kalp fonksiyonu nedeniyle yalnızca bir kez kardiyomiyositlerde hasat edilebilir. Daha farenin yüzden gerekli bireysel farenin kardiyomiyositlerin analiz kurban ederken bir kohort uzunlamasına takip edilebilir.
Bizim odak bir nakavt fare kontraktiliteyi ve hücre iskeleti yapısı okuyor olmuştur, ancak, izole kardiyomiyositler farmakolojik etkilerini inceleyen, basınç veya hacim aşırı farelerden kardiyomiyositlerin okuyan, t-tübülleri için canlı hücre boyama gibi diğer deneyler çeşitli için kullanılabilir Tedavi, immunofloresan, transfeksiyon 9 ve transkripsiyonel 19 profilleme. Bu çok yönlü bir tekniktir kalp yetmezliği incelemek için kullanılan diğer yöntemlere göre, sayısız avantajlar sağlar. Tek tek hücrelerin incelenmesi fizyolojisi tüm organ f eşlik hücresel değişiklikler içgörü sağlayarak, bu tür ekokardiyografi veya elektrokardiyografi gibi tüm organ çalışmalar tarafından sunulan değildir bilgi verirailure. Bütün hücre kolayca boyanmış ve görüntüsü olabilir Buna ek olarak, izole edilmiş hücreler, görüntüleme alt-hücresel yapılar için daha üstündür. Kontraktilite, kalsiyum geçici ve immünofloresans analizi için kardiyomiyositlerin Ayırma deneysel tasarımlar çok çeşitli değerli bilgiler sunan çok yönlü bir tekniktir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Hücre ve Gelişim Biyolojisi çekmesi ekipman Bölümü kullanımı Marc Wozniak.
Vanderbilt Üniversitesi Hücre Görüntüleme Paylaşımlı Kaynak.
Bu çalışma DMB için ERP AHA hibe 12PRE10950005, DMB için AHA hibe 11GRNT7690040, NIH hibe R01 HL037675 tarafından desteklenmektedir. DMB Kardiyovasküler Araştırma Gladys P. Stahlman Başkanıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| KCl | Sigma | P-3911 | |
| MgCl2 | Sigma | M-8266 | |
| HEPES | EM Science | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2·2H2O | Fisher | C79 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
| 2,3-Butanedione-monoxime (BDM) | Sigma | B-0753 | |
| Taurine | Sigma | T-0625 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A-7030 | |
| Collagenase B | Roche Diagnostics | 1-088-823 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| Protease XIV | Sigma | P-5147 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals, LLC | 401586D | |
| Isofluorane | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO – anhydrous | Sigma | 276855 | |
| IonOptix cell pacing and fluorescent analysis system | IonOptix | ||
| 250 μm nylon mesh filter | Sefar America | Lab Pak 03-250/50 | |
| 23 G Luer-stub adaptor | Becton Dickinson | 1482619E | |
| PE-50 tubing | Becton Dickinson | 427410 |
References
- Babick, A. P., Dhalla, N. S. Role of Subcellular Remodeling in Cardiac Dysfunction due to Congestive Heart Failure. Medical Principles and Practice. 16, 81-89 (2007).
- Nogami, A. Purkinje-Related Arrhythmias Part I: Monomorphic Ventricular Tachycardias. Pacing and Clinical Electrophysiology. 34, 624-650 (2011).
- Clancy, R. M., Kapur, R. P., Molad, Y., Askanase, A. D., Buyon, J. P. Immunohitologic Evidence Supports Apoptosis, IgG Deposition, and Novel Macrophage/Fibroblast Crosstalk in the Pathologic Cascade Leading to Congenital Heart Block. Arthritis and Rheumatism. 50, 173-182 (2004).
- Splawski, I., et al. CaV1.2 Calcium Channel Dysfunction Causes a Multisystem Disorder Including Arrhythmia and Autism. Cell. 119, 19-31 (2004).
- Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. Morphology and Metabolism of Intact Muscle Cells Isolated from Adult Rat Heart. Circulation Research. 26, 679-687 (1970).
- Fang, F., et al. Luteolin Inhibits Apoptosis and Improves Cardiomyocyte Contractile Function through the PI3K/Akt pathway in Simulated Ischemia/Reperfusion. Pharmacology. 88, 149-158 (2011).
- Feng, W., et al. Coordinated Regulation of Murin Cardiomyocyte Contractility by Nanomolar (-)-Epigallocatechin-3-Gallate the Major Green Tea Catechin. Molecular Pharmacology. 82, 993-1000 (2012).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: A cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Science. 95, 2979-2984 (1998).
- Kaestner, L., et al. Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging. J Vis Exp. (31), e1433 (2009).
- Vainio, L., et al. Neronostatin, a Novel Peptide Encoded by Somatostatin Gene, Regulates Cardiac Contractile Function and Cardiomyocytes Survival. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4572-4580 (2012).
- Park, M., et al. Novel mechanisms for caspase inhibition protecting cardiac function wth chronic pressure overload. Basic Research in Cardiology. , 108 (2013).
- Novaes, R. D., et al. Effects of Trypanosoma cruzi infection on myocardial morphology, single cardiomyocyte contractile function and exercise tolerance in rats. International Journal of Experimental Pathology. 92, 299-307 (2011).
- Weltman, N. Y., Wang, D., Redetzke, R. A., Gerdes, A. M. Longstanding Hyperthyroidism is Associated with Normal or Enhanced Intrinsic Cardiomyocyte Function despite Decline in Global Cardiac Function. PLoS One. 7, e46655 (2012).
- Papanicolaou, K. N., et al. Preserved heart function and maintained response to cardiac stresses in a genetic model of cardiomyocyte-targeted deficiency of cyclooxygenase-2. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49, 196-209 (2010).
- Despa, S., Lingrel, J. B., Bers, D. M. Na+/K+-ATPase a2-isoform preferntially modulates Ca2+ transients and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in cardiac myocytes. Cardiovascular Research. 95, 480-486 (2012).
- Touchberry, C. D., et al. FGF23 is a novel regulator of intracellular calcium and cardiac contractility in addition to cardiac hypertophy. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. , (2013).
- Helmes, M., et al. Titin Determines the Frank-Starling Relation in Early Diastole. The Journal of General Physiology. 121, 97-110 (2003).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 940-950 (2011).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302 (2011).
