איסוף וניתוח של Published: October 23, 2013 doi: 10.3791/51111

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Olena Tetyuk¹, Urs F. Benning¹, Susanne Hoffmann-Benning¹

¹Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State Universtiy

Summary

ידע של ההרכב של SAP השיפה כמו גם את המנגנון של התחבורה והטעינה למרחקים ארוכים שלה הוא חיוני להבנה של איתות למרחקים ארוכים בפיתוח ומתח / תגובת פתוגן צמח ולהטמיע תחבורה. כתב יד זה מתאר את האוסף של פליטות השיפה בשיטה EDTA-הקל.

Abstract

השיפה המפעל חיונית להובלה למרחקים ארוכים של (צילום) מטמיע כמו גם שינוע של אותות מתח יוטיים או אביוטי. הוא מכיל סוכרים, חומצות אמינו, חלבונים, RNA, שומנים ומטבוליטים אחרים. אמנם יש לו עניין גדול בהבנה את ההרכב והתפקוד של השיפה, התפקיד של רב מהמולקולות האלה וכך, חשיבותם בהתפתחות מפעל ואת לחץ תגובה טרם נקבעה. מכשול אחד לניתוח השיפה טמון בעובדה שאת החותמות השיפה עצמו על פצע. כתוצאה מכך, מספר הצמחים שממנו ניתן להשיג השיפה SAP הוא מוגבל. שיטה אחת המאפשרת לאוסף של פליטות השיפה ממספר מיני צמחים ללא צורך בציוד נוסף היא אוסף EDTA-הקל השיפה exudate שתואר כאן. אמנם קל לשימוש, היא עושה להוביל לפציעתם של תאים ויש לו טיפול שיש לנקוט כדי להסיר את התוכן של תאים פגועים. בנוסף, מספר פקדים להוכיח טוהר exudateהם הכרחיים. בגלל זה הוא דיות ולא כאוסף ישיר של SAP השיפה (לא אפשרי במינים רבים) כימות יחסי היחיד של התוכן שלה יכול להתרחש. היתרון של שיטה זו על פני אחרים הוא שניתן להשתמש בו בעשבוני רבים או מיני צמחים עציים (perilla, ארבידופסיס, צפצפה, וכו ') ודורש ציוד והכשרה מינימאלי. זה מוביל לכמויות גדולות למדי של פליטות שיכולים לשמש לניתוח שלאחר מכן של חלבונים, סוכרים, שומנים, רנ"א, וירוסים ומטבוליטים. זה די פשוט, כי זה יכול להיות בשימוש גם במחקר וגם בהוראה במעבדה.

Introduction

צמחים לא יכולים לזוז להימלט תנאים קשים. כתוצאה מכך, הם היו צריכים לפתח מנגנונים כדי לזהות לחצים סביבתיים, לעורר ולשדר אותות הקשורים בכל המפעל, ולהתאים פיתוח בהתאם. שתי מערכות תחבורה קיימות לחלוקת מים, חומרים מזינים וחומרים אחרים (איתות). העצה הראשונה הוא, אשר בדרך כלל מעביר מים ונלקחו על ידי השורשים ברחבי מפעל מינרלים. השני היא השיפה. התצוגה של השיפה השתנתה ממערכת תחבורה להטמיע פשוט צינור לרנ"א, חלבון, וירוסים, שומנים ומולקולות קטנות אחרות. זה ממלא תפקיד חשוב בהטמעה והובלת חומרי מזון, בתגובה ללחץ יוטיים ואביוטי, כמו גם בגידול צמחים ופיתוח. עכשיו זה נקרא "אוטוסטרדת המידע" של הצמח ^18.

השיפה מורכבת מכמה סוגי תאים: השיפה parenchyma, כמו גם לוויה מיוחדת לספירהlls ואלמנטים מסננות. האלמנט המסננת הוא האתר של תנועה למרחקים ארוכים. כדי לאפשר זרימת אורך בלא הפרעה, אלמנטים מסננות חסרים רוב האברונים כמו גם גרעינים והם חשבו להכיל במקרה טוב מכונות translational מוגבלות ^{21, 33.} הוא האמין כי תאים נלווים לסנתז חלבונים ותרכובות אחרות, הנע בזרם השיפה. תרכובות אלו מועברים לאחר מכן לאלמנט דרך מסננת plasmodesmata ויכולות לתפקד כאותות למרחקים ארוכים ^4,16.

מספר קבוצות של תרכובות ניתן למצוא בפליטות השיפה:

• סוכרים הם לרוב מוצרים של פוטוסינתזה ומועברים כמולקולות נושאות "אנרגיה" לחלקים אחרים של הצמח לאחסון או כאבני בניין. עם זאת, הם יכולים גם לתפקד כנוזל לרדיאטור או כאיתות תרכובות.
• ניתן למצוא גם חלבונים בפליטות השיפה. הם כוללים אנזימים מטבוליים אך גם איתות לתפקד. examp אחדLe של חלבון המשמש כאות התפתחותית הוא חלבון T מוקד הפריחה, מה שמסמן את האינדוקציה של פריחה, כמו גם כריתה עלה עונתית בצמחים. ⁶
• חומצות גרעין נמצאות בפליטות השיפה בצורה של mRNA, RNA הקטן ומיקרו, וRNAs הנגיפי. הם מופיעים להיות מעורבים במידה רבה באיתות ^{27, 28, 39.} במקביל, rRNA וtRNAs עבור כמעט כל חומצות אמינו כבר נצפו בSAP השיפה של cucurbits ^42. הם מופיעים שיועברו באופן סלקטיבי למערכת הצינור המסננת. את tRNAs להראות שינויים הדרושים ליכולת להעביר חומצות אמינו למנגנון translational. עם זאת, במקום להשתתף בתרגום, הם מופיעים כדי לעכב את התהליך הזה. לחלופין, הם יכולים לשמש כמקור לציטוקינין או לאותת מצב מטבולי של המפעל ^42.
• חומצות שומן, oxylipins, ושומנים אחרים יש גם נמצאים בהשיפה ^{3 פליטות, 13, 14, 23.} JasmoNIC חומצה, כ מהלכי oxylipin דרך השיפה כחלק מהתגובה לזיהום הפתוגן ^{22, 29, 31, 32.} אמנם התפקיד של רוב השומנים השיפה עדיין לא ברור, חלקם עשוי להיות איתות פונקציה ^4.

האתגר בעבודה עם השיפה צמח טמון ביכולתה לאטום את עצמו על פציעה. ישנן ארבע שיטות עיקריות המשמשות לאיסוף פליטות השיפה, ובכל זאת הם עובדים רק במינים נבחרים:

1) בcucurbits זה אפשרי כדי להשיג כמויות סבירות של exudate השיפה דרך חתכים של הפטוטרת. ברגע שהוא הסיר את הירידה הראשונית עם זיהום של תאים פגועים, זה אפשרי כדי להשיג כמויות גדולות למדי של השיפה הטהורה ^{1 SAP, 15.} עם זאת, עם זמן אוסף גדל והולך, exudate מתעבה זה, מה שהופך אותו מתאים יותר לגישות כרומטוגרפיה נוזליות (לא פורסם). הפרסומים אחרונים מראים, שבהתאם למין, השיפה SAP זו נגזר מeither שfascicular (FP) או השיפה extrafascicular (EP), ובזמן שהיא עושה מכילה "ניידת" השיפה SAP מהאלמנטים מסננות (FP), הוא גם נוטה זיהום מסוגים אחרים של תאים, כולל העצה ^{40, 41} .

2) גישה שנייה היא להשיג השיפה SAP דרך חתכים רדודים או נקבים בגזע או פטוטרת. שיטה זו שימש בהצלחה ^{ב17 תורמוס, 25, 36} cucurbits, וBrassica ¹² napus. כאן הזיהום מהתאים פגועים הוא מינימאלי והפליטות מאוד טהור. עם זאת, צמחים צריכים להיות בריא ומושקה היטב שכן הוא מאוד מאתגר באופן סלקטיבי רק את האלמנטים לנקב המסננת. אם צינורות העצה הם חתוכות, כל exudate נשאב לתוך זרם העצה. זה הופך את השיטה אינה מתאימה לצמחים עם פטוטרות או גבעולים מאוד שבירים או lignified מאוד.

3) stylectomy הכנימה מאפשר כנימות להכניס stylet לאלמנטים מסננותn הסרת הכנימה עם לייזר. השיפה SAP הוא הקרין דרך ² stylet ^{הנותר, 9, 10, 35, 38.} בתאוריה, כל צמח שיכול להיות נגוע על ידי כנימות יכול לשמש לגישה זו. עם זאת, רוב מנהלי חממה או חדר צמיחה לא יתמכו בשימוש במחולל מחלה. בנוסף, כנימות להציג כמה חלבונים לתוך השיפה עם הרוק שלהם ^{19, 33.} זה מוביל למוגבל תעתיק תכנות מחדש ³⁰ ויש לו את הפוטנציאל לשנות את הרכב השיפה ^26.

4) השיטה שתוארה כאן היא דיות EDTA-הנחייתם של השיפה SAP. שיטה זו מעסיקה EDTA כדי למנוע אטימה של השיפה ^20. EDTA chelates Ca ^{2 +} יונים שאחרת משתתפים בתהליכים האוטמים השיפה. בעוד EDTA יכול להוביל לתא נזק ^30, מספר קבוצות השתמשו בשיטה זו וציינו אין השפעה שלילית של ריכוזי EDTA מ -10 מ"מ ועד 20 מ"מ בתא או על ultrastructure phloeמ 'טוען והובלה ^{5, 24.} כדי להפחית את השפעה מזיקה כלשהי, כמו גם התערבות של EDTA עם כרומטוגרפיה וג'ל אלקטרופורזה, צמחים עברו למים לאחר שעות 1 ורק חלק מאוחר יותר של exudate משמש ^14. כך, במקום דיות לEDTA, השיפה היא exudated לתוך מים (EDTA-הקל דיות). זוהי עלות ישר קדימה, נמוכה ונמוך טק שיטה לאיסוף פליטות השיפה. השיפה SAP הושג בדרך זו ניתן להשתמש בו כדי לנתח את החלבונים, מולקולות קטנות, שומנים, וRNAs ושמש בהצלחה בצמחים רבים. אמנם כמות מוגבלת של ניסויים שבוצעה בmonocots ^11, השיטה שנראה מתאים יותר לdicots ^{(17 perilla, 20,} ארבידופסיס ^{8, 13, 14,} צפצפה ^7). אוסף של פליטות צריך להתרחש בסביבה לחה כדי למנוע אובדן של פליטות באמצעות דיות. בהתאם לצמח, בדגירת EDTA לשעה עד שעות היאמספיק כדי למנוע איטום של האלמנטים השיפה / מסננת. לאחר מכן האוסף יכול להתרחש במים. זו יש את היתרון של מניעת ההשפעה השלילית יש EDTA על מבנה תא ויציבות. זה גם מבטל את ההפרעה של EDTA עם שיטות כמו HPLC או-SDS. הוא הראה שהוא חל על ארבידופסיס. לצמחים גדולים יותר, יש דגירה באוספי EDTA וexudate כדי להיות מדורגת ומתבצעת בכוסות ולא בצינורות תגובת 1.7 מ"ל.

Protocol

1. הכנת הצמחים

1. ניתן ניבטו זרעי ארבידופסיס ישירות על קרקע או על צלחות של טרשת נפוצה. לגדל את הצמחים לארבעה עד שישה שבועות בתאי צמיחה עם photoperiod של 12 שעות (22 ° C יום, 15 מעלות צלזיוס בלילה ^14). צמחי מים פעמיים פעם אחת עד שבוע. השתמש במגש תחתון להשקיה, אין צמחי מים מלמעלה; לאפשר את המגשים לייבוש לפני מחדש השקיה. ודא שצמחים שתו מספיק בזמן קציר.

2. הכנת פתרונות ומנות

1. פתרון _2-EDTA K: בצע פתרון 100 מ"מ _K-2 EDTA פתרון מניות, שיכול להישמר במקרר. ביום של האוסף, לדלל פתרון אחד לחמישה (חלק אחד EDTA פתרון, מים חלקים ארבעה) כדי להשיג 20 מ"מ פתרון _K-2 EDTA.
2. למלא כוס או צלחת פטרי (7-15 ס"מ קוטר) באמצע הדרך עם 20 מ"מ פתרון _K-2 EDTA. אם איסוף דגימות מטיפולים שונים (ללשעברשליטה בשפע וצמחי מלח לחוץ או גנוטיפים שונים), להכין מנות נפרדות לכל טיפול.
3. מלא מספר רצוי של 1.7 צינורות תגובת מ"ל עם 1.4 מ"ל של 20 מ"מ פתרון _K-2 EDTA. מלאו מספר שווה של צינורות תגובה עם 1.4 מיליליטר מים מזוקק או autoclaved Millipore.
4. שים מגבות נייר על הספסל להגדיר צמחים ב; לקבל סכין גילוח חדש אחד ולשים את כפפות.

3. אוסף של השיפה exudates (מתואר בתרשים זרימה באיור 1)

1. שושנת קציר משאירה משישה עד שמונה צמחי בני שבוע על ידי חיתוכם עם סכין הגילוח בבסיס הקרוב לפטוטרת מרכז שושנה.
2. מייד למקם את העלים במאכלים המכילים 20 מ"מ _K-2 EDTA. ודא שקצה החתך של הפטוטרת הוא שקוע בפתרון (איור 2).
3. לאחר 15 עלים כבר נאספו (צמחי 03:57 בקירוב), בעדינות לערום עלים זה על גבי זה לא כזה אחרפטוטרות חתוכות כובע מיושרות אחד עם השני. חתך מחדש את הבסיס של הפטוטרות (1 מ"מ בקירוב) ולהעביר באופן מיידי את עלים לאחד מצינורות התגובה עם 20 מ"מ פתרון _K-2 EDTA. את העלים שיתאימו הקלים ביותר אם הם הפשילו מעט. הימנע לסחוט את העלים שבכן זה עלול לגרום לפגיעה בתאים, ובכך, מוביל לאוסף של תוכן תא עלה.
4. אם יש צורך בחומר, בעדינות לכסות את הדגימות עם מגבת נייר רטובה. השתמש בסט חדש של כלים אם לאיסוף דגימות מטיפולים שונים וגנוטיפים.
5. ברגע שכל הדגימות ממוקמות בצינורות תגובה, לאסוף את הפליטות גם בחושך או באור.
6. לאוסף בחושך, קו רצפת צלחת שטוחה גדולה עם מגבות נייר רטובות. הנח את המדף עם צינורות תגובה המלאים עלים בצלחת וגם מכסה במגבות נייר רטובות או להכניס חזרה פלסטיק שחור עם חריצים לאוורור. הנח את כל ההתקנה בארון או בחדר חשוך.
7. לאוסף באור, בשורה התחתונה של המכל פרספקס שקוף עם מגבות נייר רטובות. הנח את המדף עם צינורות תגובה מלא עלים במכל ולסגור אותו.
8. לאחר שעה 1, להסיר עלים בעדינות מיכל וצינורות התגובה ולשטוף ביסודיות עם מים מזוקקים, deionized או Millipore כדי להסיר את כל EDTA. צעד זה משרת שלוש מטרות: (1) הוא מסיר EDTA כדי למזער נזק לתאים, (2) שהוא מבטל את ההפרעה של EDTA עם-SDS וכרומטוגרפיה, ו (3) מסיר את כל תרכובות שהצטברו מחתך / פגומה תאים. מייד להעביר לתוך צינורות התגובה המוכנים המכילים מים autoclaved ולחזור למכלי האיסוף humidified לאוסף של פליטות. בשלב זה, להוסיף מעכב RNase אם exudate צריך לשמש להפקת RNA. אופציונלי: ניתן להוסיף מעכב proteinase אם ניתוח של חלבון הוא רצוי.
9. לאחר זמן האוסף המיועד, לשלוף וdiscaRd העלים ולהקפיא את הפליטות השיפה בנוזל N ₂ לשימוש נוסף. אם יש צורך באחסון ממושך, Lyophilize הדגימות ולאחסן ב -80 ° C.
10. במקרה של ארבידופסיס, יכולים כבר להתגלות מטבוליטים אחרי האוסף של פליטות במשך שעה 1. עם זאת, אוסף עבור 5-8 שעות מומלץ אם הניתוח של רכיבים פחות שפע מתוכנן. לצמחים גדולים כמו perilla, זמני איסוף ארוכים יותר (8 שעות) מומלצים.
    Exudate נאסף 15 עלים הוא בדרך כלל מספיק לנתיב אחד על ג'ל SDS-PAGE (חלבונים), להפקת ה-mRNA, GC-MS (סוכרים ומטבוליטים). לניתוח שומנים איגום של 2-3 דגימות (exudate 30-45 עלים) מומלץ ומוביל לתוצאות ברורות יותר.

4. ניתוח שלאחר מכן (לוידאו אנו הצג 4.4 בלבד)

1. לניתוח חלבונים, מדגם resuspend ב 15 מים μl ו30 חיץ Lämmli μl, חום עד 95 צלזיוס למשך 5 דקות, לסובב במהירות במורד מעלות כל precipitates ולטעון מדגם כולו על גבי ג'ל SDS-PAGE (45 כיסי טעינת μl). דוגמאות יש מוכתמות בכתמי Coomassie קולואיד או רגישים אחרים שכן שפע חלבון הוא נמוך מאוד.
2. לסוכר וניתוח המטבוליט קטן, להוסיף derivatizing סוכנים למדגם המיובש כפי שמתואר בספרות ^14.
3. ניתן לנתח mRNA באמצעות RT-PCR, microarray או ניתוח RNA-Seq.
4. לניתוח שומנים בדם באופן מיידי בריכת 2:58 דגימות ומחיצה נגד כלורופורם: מתנול (1:1) במנדף כדלקמן: להוסיף כמות שווה של כלורופורם: מתנול לכל דגימה, מערבולת למשך כמה שניות, וצנטריפוגות במשך 4 דקות ב 400 x גרם. לאסוף תחתית השלב (אורגני) בשפופרת זכוכית עם פקק טפלון וחזור על פעולה עם מחיצת השלב העליון שלוש פעמים נוספות. ייבש את השלבים האורגניים המשולבים תחת זרם של N ₂ ולהגיש לניתוח נוסף (Thin-שכבת כרומטוגרפיה: ^{14 TLC, 37;} כרומטוגרפיה נוזלית-Mass: LC-MS ^14).

Representative Results

זה הפך להיות ברור בשנים האחרונות כי המורכבות של SAP השיפה עשויות להיות התשובה לשאלה כיצד צמחים שונים לשלוח אותות התפתחותיים ומתח לתשובה אופטימלית. באמצעות EDTA-הקלו דיות השיפה עשויה לספק ההזדמנות לנתח פליטות השיפה מצמחים כי הם אינם מתאימים לגישות אחרות, אך עשוי להיות עניין כלכלי או פיסיולוגי.

שיטה זו מאפשרת לקציר של השיפה exudates מספיק כדי לזהות חלבוני השיפה-מקומיים ולזהות שינויים ברמה שלהם בתגובה לפיתוח או מתח (איור 3). כפי שעולה מהדמות, הם בשפע חלבונים נמוך מאוד, ובכל זאת, רמתם גבוהה מספיק לניסויי proteomics שלאחר מכן באמצעות LC-MS/MS או לניתוח כתם מערבי. ממצאים מראים כי בcucurbits החיתוך של הגזע מוביל להפרת איזון פוטנציאל המים וזרם של מים ולאחר מכןמזהמים אפשריים מapoplast ^41. עם זאת, אוסף לפעמים בטווח של אחת לשמונה שעות אינו משפיע על פרופיל השיפה החלבון / הרכב בארבידופסיס (. רק הסכום המוחלט משתנה Guelette ואח'), את כמות החלבון שנאסף ואת התבנית של חלבונים הנמצאים משתנה בין מינים (ארבידופסיס: ב; perilla, ליין אני וNI) וטיפולים (perilla גדל באורכי יום שונים, נתיב ואני NI). כאותות חלבוניים תוצאה יכולים להיות דמיינו שנוצר, ואחריו.

יכול גם להיות מזוהה RNAs mRNA ומיקרו ובפליטות השיפה בשיטה זו. עם זאת, טיפול במעכבי RNAse נחוץ כדי למנוע השפלה של mRNA בזמן הדיות המורחב. מאז האלמנטים מסננות אינם מכילים כלורופלסטים פונקציונליים, מקטע קטן או גדול RuBisCO (RBCs או RbcL, בהתאמה) יכול לשמש כmRNAs בקרות שליליות, בעוד ידוע השיפההמקומי-mRNA כמו אנזים יוביקוויטין-conjugating עשוי לשמש כביקורת חיובית (איור 4).

באופן דומה, ניתן לנתח סוכרים או מטבוליטים קטנים או באמצעות GC-MS או LC-MS. כאן ראוי לציין, כי הפליטות השיפה מכילות מספר גדול של אנזימים פונקציונליים, כולל כמעט כל מסלול ¹² glycolytic. לפיכך, שימוש במספר נקודות זמן עשויה לחשוף תהליכי חילוף חומרים באוסף exudate. דוגמה לכך היא שמוצגת באיור 5: בכל הפליטות, סוכרוז הוא מטבוליט הנפוץ ביותר, זה ברור ביותר לאחר אוסף במשך שעה 1. עם זאת, לאחר חמש שעות סוכרוז יחס פרוקטוז מצטמצם מעט. אם אותו exudate נאסף במשך שעה אחת והשאיר על הספסל במשך ארבע שעות הבאות, סוכרוז לפרוקטוז יחס מצטמצם במידה ניכרת, מה שמרמז כי אנזימים פעילים בהשיפה exudates להוביל לפירוק של סוכרוז בחדר TEMperature (לעוד פרשנויות שיא לראות ^14). זה עולה בקנה האחד עם ממצאים שטעינה והובלה של מולקולות מתאי נלווים לאלמנטים מסננות השיפה עשויה להימשך בדיות עד שהמערכת מאבדת את החיוניות שלו ^34.

שומנים בפליטות השיפה, ובהרחבה, שומני איתות למרחקים ארוכים הם תחום חדש יחסית של עניין במדע במפעל. בשל טבע השומנים הידרופובי נמצאים רק בריכוזים נמוכים ועשויים להיות מחויב למולקולות אחרות לsolubilization. ובכל זאת, דיות EDTA-הקל מאפשרת האיסוף של חומר מספיק כדי להמחיש (TLC; איור 6) ולזהות (LC-MS; איור 7) שומנים השיפה מכמה מיני צמחים. כדמות מראה את זה ניתן לזהות ולהפריד בין כמה מיני שומנים בדם. LC-MS מאפשר לזהות מיני שומנים שונים ולעקוב אחר שינויים במסגרת פרופיל השומנים של differeגנוטיפים NT או טיפולים. זה מאפשר ללימוד התפקיד של שומנים בהתפתחות צמח ותגובה ללחץ.

איור 1. תרשים זרימה של האוסף של פליטות השיפה של ארבידופסיס או perilla. מסלולים שונים יובילו למוצרי קצה שונים, שמסומנים בכחול. להכנה של רנ"א, RNAse מעכב (100 U / מ"ל, רוש) הוא הוסיף למים שלתוכו exudate השיפה נאסף.
לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2. התקנה של חומרים לexudate השיפה לאסוףיון. ההתקנה מציגה את כל החומרים הדרושים לפרוטוקול צעדים 3.1-3.4.
לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

. חלבונים איור 3 נמצאו בהשיפה פליטות של שני מינים שונים, צמח ארבידופסיס (AT) וperilla (אני וNI; אורכי יום שונים); MW: סמן משקל מולקולרי (מסלול 2). חלבונים הופרדו באמצעות שיפוע 10-20%-SDS.
לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4. ניתוחלנוכחות של mRNA למקטע קטן וגדול RuBisCO (RBCs וRbcL, בהתאמה) ואנזים היוביקוויטין-conjugating (UBC). mRNA נאסף מעלי ארבידופסיס (L), פטוטרות (P), ולפליטות השיפה (pH), להפוך תמלילים עיבד וספציפיים דמיינו באמצעות PCR. הדמות שונה מGuelette et al. ^14.
לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

פרופיל GC-MS 5. דמותו של השיפה exudates נאסף לכמות פעמים שונה. שים לב איך את הכמות היחסית של שינויי סוכרוז מאוסף 1 שעה () עד 5 שעות של זמן אוסף (ב '). Exudate פרופיל לאחר איסוף במשך שעה 1 ואחריו "דגירה" בחדר טמפרטורה (RT) במשך ארבע שעות (C). פרופיל המטבוליט ליף (ד ').
לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 6. דק שכבת הכרומתוגרמה השוואת שומנים מperilla (משמאל) ועלים (מימין) וארבידופסיס exudates השיפה. כוכביות מצביעות שומנים ספציפיים לפליטות השיפה. DGDG: digalactosyldiacylglycerol; PG: phosphatidylglycerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; חלק מהצגת דמות שומני ארבידופסיס שונה מGuelette ואח' ^14..
לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

NT "עבור: לשמור-together.within עמודים =" תמיד ">
איור 7. פרופיל שומנים של פליטות השיפה של ארבידופסיס (כלורופורם שלב) באמצעות מצב יון שלילי LC-MS /. גרפים בחלק העליון (מוטציה,) ותחתונה (wild-type, ב ') מראים את ההבדלים בפרופיל השומנים בין שני גנוטיפים שונים (מסומן בחצים).
לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

אוסף EDTA-הנחייתם של השיפה פליטות הוא פשוט מאוד, זקוק לציוד מינימאלי, והיא חלה על רוב הצמחים. בסך הכל, בשיטה זו מרחיבה את היכולת לנתח ופליטות מהשיפה יותר מינים. למרות exudate הוא מדולל, זה קל לאסוף דגימות רבות ושונות או מתחנות רבות בהיקף של עד לכמות גדולה של חומר. אז זה מאפשר לזיהוי של תרכובות רומן שנמצאות בשפע נמוך מאוד והיו מעלימים בדרך אחרת.

שיטה זו יכולה לשמש למספר רבים של מיני צמחים ועובדת כפי שתוארה עבור אלה המפורטים בכתב היד הזה. אם מינים חדשים הם בחנו שני ההיבטים העשויים לדרוש שינוי הם במספר העלים המשמשים את הזמן של דיות. ברוב המקרים, 07:55 דיות שעה צריכה להיות מתאימות. כדי לאשר את השימוש בשיטה זו עבור מיני צמחים חדשים, exudate צריך להיות שנאסף ואחד או יותר מהניתוח שלאחר מכן, כמתואר בפרוטוקול חלק 4 needs שיש לבצע. בהתאם לעוצמת האות ציינה, היקף הגבייה ייתכן שיהיה הצורך לשנותם. באופן כללי, שומנים בדם וניתוח חלבון ידרשו יותר חומר מאשר סוכר והמטבוליט ניתוח שכן לשעבר, הנן פחות נפוצים בפליטות השיפה.

בגלל אוסף exudate EDTA-הקל כרוך משטחים לחתוך, כמו גם השפעה שעלול להזיק של EDTA, כמה נקודות יש לקחת בחשבון: (1) לאחר הדגירה שעה אחת עם EDTA, הפטוטרות צריכים לשטוף ביסודיות. זו מסירה את כל תרכובות המתקבלות מהתאים פצועים, כמו גם את EDTA עצמו, אשר יכול לגרום נזק לתאים או להפריע לחילוץ. (2) בקרות חיוביות ושליליות צריכים להיות כלולות כדי להבטיח נתונים המתקבלים נגזרים מהשיפה SAP ולא מהתאים פגועים (ראה שלבים קריטיים בהמשך). (3) השיפה SAP עושה מכיל אנזימים שונים, אשר יכול להיות פעיל במהלך איסוף exudate. לפיכך, במקרים מסוימים זה יכול להיות שימושי כדי לאסוף עבורסכומים שונים r של זמן. (4) מאחר שהשיטה מעורבת דיות למים, כימות של התרכובות מוחלטת אינה אפשרית.

שלבים קריטיים: המפתח לשימוש המוצלח של שיטה זו הוא השימוש בזהירות בעת טיפול במדגם לא לפגוע בכל תאים, כמו גם את השימוש בבקרות מתאימות (ראה נ"צ ^14.). שליטה אחת מתאימה היא האוסף של פליטות השיפה ללא טיפול מוקדם עם EDTA. במקרה זה תהיה השיפה לאטום את עצמו ויכול להיות שנאסף לא exudate. כל תרכובות מזהמות המגיעות מהתאים הפצועים תזוהה כאן. שליטה שנייה תהיה הניתוח של סוכרים בexudate. בארבידופסיס, סוכרוז צריך להיות המטבוליט העיקרי בתוך מוהל השיפה, עם פרוקטוז לסוכרוז יחס של 1:04-01:08 (נ"צ ^{8, 14).}

להפקת RNA השימוש במעכבי RNAse הוא הכרחי. בנוסף, שליטה חיובית של describ העברmRNA השיפה-מקומי אד (UBC9: אנזים יוביקוויטין conjugating 9, At4g27960; ^{8, 14)} ובקרה שלילית של למשל mRNA הכלורופלסט (RuBisCO LSU) הם מומלץ.

בגלל exudate מכיל אנזימים פעילים, כמובן זמן מומלץ לבצע שינויים בטוחים בפרופיל השיפה הן לא פשוט עקב שינויים בזמן האיסוף. במקרים מסוימים, זה עשוי להיות מועיל להשתמש במעכבי proteinase. עם זאת, החוקרים צריכים לזכור, שנאסף exudate יהיה מרוכז ושכל תרכובות נוספות תהיה מרוכזות במידה רבה. שלב קריטי שני בתוך הפרוטוקול הוא recutting של הפטוטרת תחת EDTA. צעד זה משרת מטרה כפולה: ראשית, הוא מסיר את כל צלחות מסננת אטומות תוך מניעת היווצרות של הפקקים חדשים ובכך מאפשר זרימה החופשית של SAP השיפה. שנית, זה מסיר את בועת הבקעות בעצה שנוצרה בעת חיתוך ובכך מאפשר לתחבורת עצה. גודלו של הקיצוץ השני תלויים על הצמחים בשימוש. בצמחים עם פטוטרות גדולות יותר שהוא צריך להיות כמה מילימטרים (עד 1 ס"מ) מעל החתך הראשון, בצמחים כמו ארבידופסיס, 1-2 מ"מ מספיקים.

השימוש בשיטה זו יכולה להוביל לגילוי של תרכובות רומן בפליטות השיפה שהיה יכולים להיות איתות, השלכות התפתחותיות או ביו. זה גרם ליותר במבט מעמיק באיתות שומנים למרחקים ארוכים, מה שהייתה שדה קטן בתוך-למד מדעי צמח בשל היעדר הגישה לשיפה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K2-EDTA	Sigma-Aldrich	ED2P-500G
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15cm)	PYREX or Corning		Any clean, shallow dish will work
Chloroform	EMD	CX1054-1	Only open containers in fume hood
Methanol	J.T.Baker	9070-03
Screw cap tubes	VWR International	53283-800
Screw cap tubes	Sun Sri	13-425
Eppendorf tubes	Denville	C2170