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Biology

के संग्रह और विश्लेषण Published: October 23, 2013 doi: 10.3791/51111
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State Universtiy

Summary

फ्लोएम रस की रचना के साथ ही इसकी लदान और लंबी दूरी की परिवहन की व्यवस्था का ज्ञान संयंत्र विकास और तनाव / रोगज़नक़ प्रतिक्रिया में और परिवहन आत्मसात की लंबी दूरी के संकेत को समझने के लिए आवश्यक है. यह पांडुलिपि ईडीटीए-मदद की पद्धति का उपयोग फ्लोएम exudates के संग्रह का वर्णन करता है.

Abstract

संयंत्र फ्लोएम की लंबी दूरी की परिवहन (फोटो) के रूप में अच्छी तरह से जैविक या अजैव तनाव की सूचना के संकेत के रूप में assimilates के लिए आवश्यक है. यह शक्कर, अमीनो एसिड, प्रोटीन, आरएनए, लिपिड और अन्य मेटाबोलाइट्स होता है. इस प्रकार की संरचना और समारोह फ्लोएम की, इन अणुओं में से कई की भूमिका और समझने में एक बड़ी रुचि नहीं है, संयंत्र विकास और तनाव में उनके महत्व प्रतिक्रिया अभी तक निर्धारित किया गया है. फ्लोएम विश्लेषण करने के लिए एक बाधा पर फ्लोएम जवानों खुद घायल हो गए हैं कि इस तथ्य में निहित है. नतीजतन, फ्लोएम रस प्राप्त किया जा सकता है, जहां से पौधों की संख्या सीमित है. जोड़ा उपकरणों के बिना कई प्रजातियों के पौधे से फ्लोएम exudates के संग्रह की अनुमति देता है कि एक विधि ईडीटीए-मदद की फ्लोएम पीब संग्रह यहाँ वर्णित है. यह प्रयोग करने में आसान है, यह कोशिकाओं के लोग घायल हो गए करने के लिए नेतृत्व करता है और देखभाल क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की सामग्री को हटाने के लिए लिया जाना है. इसके अलावा, कई नियंत्रण पीब की पवित्रता साबित करने के लिएजरूरी हैं. यह बल्कि उसकी सामग्री का केवल रिश्तेदार मात्रा का ठहराव हो सकता फ्लोएम रस (कई प्रजातियों में संभव नहीं) के एक प्रत्यक्ष संग्रह से एक रसकर बहना है. दूसरों पर इस विधि का लाभ यह है कि कई घास या वुडी पौधों की प्रजातियों (Perilla, Arabidopsis, चिनार, आदि) में प्रयोग किया जाता है और कम से कम उपकरण और प्रशिक्षण की आवश्यकता हो सकती है. यह प्रोटीन, शर्करा, लिपिड, शाही सेना, वायरस और मेटाबोलाइट्स के बाद के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि exudates की काफी बड़ी मात्रा में होता है. यह दोनों एक शोध में और साथ ही एक शिक्षण प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा सकता है कि काफी सरल है.

Introduction

पौधों को प्रतिकूल परिस्थितियों से बचने के लिए कदम नहीं कर सकते. नतीजतन, वे, पर्यावरण तनाव का पता लगाने के लिए तंत्र विकसित प्रकाश में लाना और संयंत्र भर में एक संबंधित संकेत संचारित, और तदनुसार विकास को समायोजित करने के लिए किया था. दो परिवहन व्यवस्था पानी, पोषक तत्वों और अन्य (संकेत) यौगिकों के वितरण के लिए मौजूद हैं. पहले जाइलम है, आम तौर पर पानी के परिवहन और खनिजों संयंत्र भर जड़ों से ऊपर ले लिया है. दूसरी फ्लोएम है. फ्लोएम के मद्देनजर शाही सेना के लिए एक सरल आत्मसात परिवहन प्रणाली से एक नाली के लिए बदल गया है, प्रोटीन, वायरस, लिपिड और अन्य छोटे अणुओं. यह करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है आत्मसात और पोषक तत्व परिवहन, जैविक और अजैविक तनाव की प्रतिक्रिया है, साथ ही पौधों की वृद्धि और विकास के रूप में. अब यह संयंत्र 18 के "सूचना सुपर हाइवे" कहा जाता है.

फ्लोएम पैरेन्काइमा, साथ ही विशेष साथी CE: फ्लोएम कई प्रकार की कोशिकाओं के शामिल हैऔर LLS चलनी तत्वों. चलनी तत्व लंबी दूरी की आंदोलन की साइट है. अबाधित अनुदैर्ध्य प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए, चलनी तत्वों के साथ नाभिक के रूप में सबसे organelles याद कर रहे हैं और सबसे अच्छे रूप में एक सीमित अनुवादकीय मशीनरी 21, 33 को रोकने के लिए लगा रहे हैं. यह साथी की कोशिकाओं को प्रोटीन और फ्लोएम धारा में यात्रा जो अन्य यौगिकों, synthesize माना जाता है. इन यौगिकों तो plasmodesmata के माध्यम से चलनी तत्व में ले जाया जाता है और लंबी दूरी के संकेत 4,16 के रूप में कार्य कर सकते हैं.

यौगिकों के कई समूहों फ्लोएम exudates में पाया जा सकता है:

  • शुगर्स अक्सर प्रकाश संश्लेषण के उत्पादों रहे हैं और भंडारण के लिए संयंत्र के अन्य भागों के लिए "ऊर्जा ले जा" अणुओं के रूप में या ब्लॉकों इमारत के रूप में ले जाया जाता है. हालांकि, वे भी एंटीफ्ऱीज़र के रूप में या यौगिकों के संकेत के रूप में कार्य कर सकते हैं.
  • प्रोटीन भी फ्लोएम exudates में पाया जा सकता है. वे चयापचय एंजाइमों शामिल हैं, लेकिन यह भी समारोह में संकेत दिया है. एक exampविकास के संकेत के रूप में कार्य करता है जो एक प्रोटीन के ले फूल के शामिल होने के साथ ही पौधों में मौसमी पत्ती अलगाव का संकेत है जो फूल ठिकाना टी प्रोटीन है. 6
  • न्यूक्लिक एसिड mRNA, छोटे और माइक्रो आरएनए, और वायरल RNAs के रूप में फ्लोएम exudates में मौजूद हैं. वे काफी हद तक संकेत 27, 28, 39 में शामिल होना दिखाई देते हैं. इसी समय, rRNA और लगभग सभी अमीनो एसिड के लिए tRNAs cucurbits 42 के फ्लोएम रस में मनाया गया है. वे चुनिंदा चलनी ट्यूब प्रणाली में स्थानांतरित किया जा दिखाई देते हैं. tRNAs अनुवादकीय तंत्र को अमीनो एसिड हस्तांतरण करने की क्षमता के लिए आवश्यक संशोधनों दिखा. फिर भी, बजाय अनुवाद में भाग लेने से, वे इस प्रक्रिया को बाधित करने के लिए दिखाई देते हैं. वैकल्पिक रूप से, वे cytokinin के एक स्रोत के रूप में सेवा या संयंत्र 42 की चयापचय की स्थिति का संकेत हो सकता.
  • फैटी एसिड होता है, oxylipins, और अन्य लिपिड भी फ्लोएम exudates 3, 13, 14, 23 में पाया गया है. Jasmoएनआईसी एसिड, रोगज़नक़ संक्रमण 22, 29, 31, 32 के लिए प्रतिक्रिया के हिस्से के रूप में फ्लोएम के माध्यम से एक oxylipin चलता रहता है. सबसे फ्लोएम लिपिड की भूमिका अभी स्पष्ट नहीं है, उनमें से कुछ की संभावना समारोह 4 संकेत है.

संयंत्र फ्लोएम के साथ काम करने में चुनौती लोग घायल हो गए पर ही सील करने के लिए अपनी क्षमता में निहित है. वहाँ फ्लोएम exudates इकट्ठा किया चार प्रमुख तरीके हैं, फिर भी वे चुनिंदा प्रजातियों में ही काम करते हैं:

1) cucurbits में यह डंठल की कटौती के माध्यम से फ्लोएम पीब का उचित मात्रा में प्राप्त करने के लिए संभव है. घायल कोशिकाओं के संक्रमण के साथ प्रारंभिक बूंद निकाल दिया जाता है एक बार, यह शुद्ध फ्लोएम रस 1, 15 की काफी बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए संभव है. हालांकि, बढ़ती संग्रह समय के साथ, तरल क्रोमैटोग्राफी दृष्टिकोण (अप्रकाशित) के लिए यह तेजी से अनुपयुक्त इस पीब गाढ़ा बना रही है. हाल के प्रकाशनों प्रजातियों पर निर्भर करता है, इस फ्लोएम रस eithe से प्राप्त होता है, सुझावयह चलनी तत्वों (एफपी) से "मोबाइल" फ्लोएम रस को नियंत्रित करता है, जबकि आर स्तबकीय (एफपी) या extrafascicular फ्लोएम (ईपी) और कहा कि, यह भी जाइलम 40 सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं, 41 से संक्रमण होने का खतरा है .

2) एक दूसरा दृष्टिकोण स्टेम या डंठल में उथले कटौती या छिद्र के माध्यम से फ्लोएम रस प्राप्त करने के लिए है. इस विधि वृक 17, 25, cucurbits 36, और ब्रेसिका napus 12 में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. यहां घायल कोशिकाओं से प्रदूषण को कम से कम है और बहुत शुद्ध exudates. हालांकि, पौधों के लिए यह बहुत ही चुनिंदा पंचर बस चलनी तत्वों को चुनौती दे रहा है, क्योंकि स्वस्थ और अच्छी तरह से पानी पिलाया होने की जरूरत है. जाइलम वाहिकाओं nicked रहे हैं, सभी पीब जाइलम धारा में तैयार की है. यह बहुत ही कमजोर या अत्यधिक lignified पर्णवृन्त या तनों के साथ पौधों के लिए अनुपयुक्त विधि बनाता है.

3) Aphid stylectomy एफिड्स चलनी तत्वों में अपने ख़ंजर डालने के लिए अनुमति देता हैn एक लेजर के साथ एफिड हटा. फ्लोएम रस शेष ख़ंजर 2, 9, 10, 35, 38 के माध्यम से जताया है. सिद्धांत रूप में, एफिड से संक्रमित हो सकता है कि किसी भी संयंत्र इस दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, सबसे ज्यादा ग्रीन हाउस या विकास कक्ष प्रबंधकों को एक रोगज़नक़ के उपयोग का समर्थन नहीं करेंगे. इसके अलावा, एफिड्स उनके लार 19, 33 के साथ फ्लोएम में कई प्रोटीन का परिचय. यह 30 reprogramming एक सीमित ट्रांसक्रिप्शनल की ओर जाता है और फ्लोएम रचना 26 बदलने की क्षमता है.

4) यहाँ वर्णित विधि फ्लोएम रस के ईडीटीए-मदद की स्त्राव है. इस विधि फ्लोएम 20 की सीलिंग रोकने के लिए ईडीटीए कार्यरत हैं. EDTA के सीए 2 + अन्यथा फ्लोएम सील कि प्रक्रियाओं में भाग लेंगे कि आयनों chelates. EDTA के सेल नुकसान 30 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, कई समूहों सेल फैटी पर या phloe पर 20 मिमी के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया और 10 मिमी से ईडीटीए सांद्रता का कोई प्रतिकूल प्रभाव देखा हैमीटर लदान और परिवहन 5, 24. किसी भी हानिकारक प्रभाव के साथ ही क्रोमैटोग्राफी और जेल वैद्युतकणसंचलन साथ EDTA के हस्तक्षेप को कम करने के लिए, पौधों 1 घंटे के बाद पानी में चले गए हैं और पीब के केवल बाद के हिस्से 14 प्रयोग किया जाता है. इस प्रकार, बल्कि ईडीटीए में रिसाव से, फ्लोएम पानी (EDTA-मदद की स्त्राव) में exudated है. यह फ्लोएम exudates के संग्रह के लिए एक सीधे आगे, कम लागत, और कम तकनीकी विधि है. फ्लोएम रस इस तरह प्रोटीन, छोटे अणुओं, लिपिड, और RNAs का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्राप्त की और कई पौधों में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. प्रयोगों की एक सीमित मात्रा में monocots 11 में प्रदर्शन किया गया है, वहीं विधि डाइकोटों (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, चिनार 7) के लिए अधिक उपयुक्त प्रतीत होता है. Exudates का संग्रह स्वेद के माध्यम से exudates के नुकसान से बचने के लिए एक नम वातावरण में होती है. संयंत्र पर निर्भर करता है, एक से दो घंटे के लिए EDTA में ऊष्मायन हैफ्लोएम / चलनी तत्वों की सीलिंग रोकने के लिए पर्याप्त. संग्रह फिर पानी में हो सकता है. इस ईडीटीए सेल संरचना और स्थिरता पर है नकारात्मक प्रभाव को रोकने का लाभ दिया है. यह भी HPLC या एसडीएस पृष्ठ जैसे तरीकों के साथ EDTA के हस्तक्षेप को समाप्त. यह Arabidopsis पर लागू होता है के रूप में यह दिखाया गया है. बड़े पौधों के लिए, EDTA और पीब संग्रह में ऊष्मायन को बढ़ाया जाना है और नहीं बल्कि 1.7 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में से बीकर में किया जाता है.

Protocol

1. पौधों की तैयारी

  1. Arabidopsis बीज सीधे धरती पर या एमएस प्लेट पर अंकुरित किया जा सकता है. एक 12 घंटा photoperiod (22 डिग्री सेल्सियस दिन, 15 डिग्री सेल्सियस रात 14) के साथ विकास कक्षों में चार से छह सप्ताह के लिए पौधों को विकसित. पानी के पौधों को एक बार के लिए सप्ताह में दो बार. पानी के लिए नीचे ट्रे का प्रयोग करें, ऊपर से नहीं पानी पौधों है, ट्रे फिर से पानी से पहले सूखे की अनुमति. पौधों फसल के समय में अच्छी तरह से हाइड्रेटेड हैं सुनिश्चित करें.

2. समाधान और व्यंजन की तैयारी

  1. कश्मीर 2-EDTA समाधान: फ्रिज में रखा जा सकता है जो एक 100 मिमी कश्मीर 2-EDTA समाधान शेयर समाधान, बनाओ. संग्रह के दिन, एक से पांच (एक हिस्सा EDTA समाधान, चार भागों पानी) एक 20 मिमी कश्मीर 2-EDTA समाधान प्राप्त करने के लिए समाधान पतला.
  2. आधे रास्ते कश्मीर 2-EDTA समाधान 20 मिमी के साथ एक गिलास या पेट्री डिश (व्यास 7-15 सेमी) भरें. यदि अलग उपचार (पूर्व से नमूने एकत्रितपर्याप्त नियंत्रण और नमक पर बल दिया पौधों या अलग जीनोटाइप), प्रत्येक उपचार के लिए अलग व्यंजन तैयार करते हैं.
  3. 20 मिमी कश्मीर 2-EDTA समाधान के 1.4 मिलीलीटर के साथ 1.7 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों की वांछित संख्या भरें. 1.4 मिलीलीटर के साथ प्रतिक्रिया ट्यूबों की संख्या बराबर भरें विआयनीकृत या Millipore पानी autoclaved.
  4. पर पौधों को स्थापित करने के लिए बेंच पर कागज तौलिए रखो, एक नई धार मिल और दस्ताने पर डाल दिया.

3. फ्लोएम exudates का संग्रह (चित्र 1 में फ़्लोचार्ट में चित्रित)

  1. हार्वेस्ट थाली थाली के केंद्र के डंठल करीब के आधार पर धार के साथ उन्हें काटने से 4-6 सप्ताह पुराने पौधों से पत्ते.
  2. इसके तत्काल बाद 2 ईडीटीए कश्मीर 20 मिमी युक्त व्यंजन में पत्तियों जगह है. डंठल की कटौती अंत (चित्रा 2) के समाधान में डूबे हुए है सुनिश्चित करें.
  3. एक बार 15 पत्ते धीरे एक दूसरे को इस तरह के टी के शीर्ष पर पत्ते ढेर, (सी ए 3-4 पौधों) एकत्र किया गया हैटोपी कटौती पर्णवृन्त एक दूसरे के साथ जुड़ रहे हैं. पर्णवृन्त (सी ए 1 मिमी) के आधार recut और तुरंत कश्मीर 2-EDTA समाधान 20 मिमी के साथ प्रतिक्रिया ट्यूबों में से एक में पत्तियों हस्तांतरण. वे थोड़ा ऊपर लुढ़का कर रहे हैं तो पत्तियों सबसे आसान फिट. यह कोशिकाओं की चोट और, इस प्रकार, पत्ता सेल सामग्री का संग्रह करने के लिए सुराग का कारण हो सकता है के बाद में पत्तियों फैलाएंगे से बचें.
  4. अधिक सामग्री की जरूरत है, तो धीरे एक गीला कागज तौलिया के साथ नमूनों को कवर किया. अगर अलग उपचार या जीनोटाइप से नमूनों के संग्रह के लिए बर्तन का एक नया सेट का उपयोग करें.
  5. एक बार सभी नमूनों या तो अंधेरे में या प्रकाश में exudates इकट्ठा, प्रतिक्रिया ट्यूबों में तैनात हैं.
  6. अंधेरा, लाइन गीला कागज तौलिये के साथ एक बड़े उथले डिश के तल में संग्रह के लिए. पत्ता से भरे प्रतिक्रिया पकवान में ट्यूब और गीला कागज तौलिये के साथ कवर के साथ या तो रैक रखें या वेंटिलेशन के लिए slits के साथ एक काले रंग की प्लास्टिक की पीठ में डाल दिया. एक कैबिनेट में पूरे सेटअप या एक अंधेरे कमरे रखें.
  7. प्रकाश में संग्रह के लिए, गीला कागज तौलिये के साथ एक स्पष्ट plexiglass कंटेनर के नीचे की रेखा. कंटेनर में पत्ती से भरे प्रतिक्रिया ट्यूबों के साथ रैक प्लेस और इसे बंद.
  8. 1 घंटा बाद, हटायें कंटेनर और प्रतिक्रिया ट्यूबों से धीरे पत्ते और सभी ईडीटीए दूर करने के लिए, आसुत विआयनीकृत या Millipore के पानी से अच्छी तरह धो लें. यह कदम तीन उद्देश्य होते हैं: (1) यह कोशिकाओं को कम से कम नुकसान के लिए ईडीटीए को हटा (2) यह एसडीएस पृष्ठ और क्रोमैटोग्राफी साथ EDTA के हस्तक्षेप को समाप्त, और (3) में कटौती से जमा / क्षतिग्रस्त हो गए हैं कि किसी भी यौगिकों को हटा कोशिकाओं. तुरंत autoclaved पानी युक्त तैयार प्रतिक्रिया ट्यूबों में हस्तांतरण और exudates के संग्रह के लिए humidified संग्रह कंटेनरों के लिए वापसी. पीब शाही सेना निकासी के लिए इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है इस बिंदु पर, RNase अवरोध जोड़ने. वैकल्पिक: प्रोटीन विश्लेषण वांछित है अगर proteinase अवरोध जोड़ा जा सकता है.
  9. इरादा संग्रह समय के बाद, बाहर खींचने के लिए और discaतीसरी पत्तियों और आगे उपयोग के लिए तरल एन 2 में फ्लोएम exudates फ्रीज. विस्तारित भंडारण की जरूरत है, तो -80 में नमूने और दुकान डिग्री सेल्सियस lyophilize
  10. Arabidopsis के मामले में, मेटाबोलाइट्स पहले से ही 1 घंटे के लिए exudates इकट्ठा करने के बाद पता लगाया जा सकता है. कम प्रचुर मात्रा में घटकों का विश्लेषण की योजना बनाई है लेकिन, अगर 5-8 घंटे के लिए संग्रह सलाह दी जाती है. Perilla जैसे बड़े पौधों के लिए, अब संग्रह बार (8 घंटा) की सिफारिश की है.
    15 पत्तों से एकत्र पीब एक mRNA निकासी के लिए एसडीएस पृष्ठ जेल (प्रोटीन), जीसी एमएस (शर्करा और मेटाबोलाइट्स) पर एक लेन के लिए आमतौर पर पर्याप्त है. लिपिड विश्लेषण के लिए 2-3 नमूनों की पूलिंग (30-45 पत्तियों से पीब) की सिफारिश की है और स्पष्ट परिणाम होता है.

4. बाद के विश्लेषण (वीडियो के लिए हम केवल 4.4 दिखाएँ)

  1. प्रोटीन विश्लेषण के लिए, 15 μl पानी और 30 μl Lämmli बफर में resuspend नमूना, 95 को गर्मी डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए, जल्दी से किसी भी पी नीचे स्पिनrecipitates और एक एसडीएस पृष्ठ जेल (45 μl लोड जेब) पर पूरे नमूना लोड. प्रोटीन बहुतायत बहुत कम है क्योंकि नमूने कोलाइडयन Coomassie या अन्य संवेदनशील दाग के साथ दाग होना चाहिए.
  2. चीनी और छोटे मेटाबोलाइट विश्लेषण के लिए, साहित्य 14 में वर्णित के रूप में सूखे नमूने के एजेंटों derivatizing जोड़ें.
  3. mRNA के RT-पीसीआर, माइक्रोएरे या आरएनए Seq विश्लेषण का उपयोग का विश्लेषण किया जा सकता है.
  4. लिपिड विश्लेषण के लिए तुरंत पूल 2-3 नमूने और क्लोरोफॉर्म के खिलाफ विभाजन इस प्रकार है: धूआं हुड में मेथनॉल (1:1): 4 मिनट के लिए प्रत्येक नमूने के मेथनॉल, कुछ सेकंड के लिए भंवर, और अपकेंद्रित्र: एक बराबर क्लोरोफॉर्म की राशि जोड़ 400 x जी पर. Teflon टोपी और शीर्ष चरण के साथ फिर से विभाजन अधिक तीन बार के साथ एक ग्लास ट्यूब में नीचे (जैविक) चरण लीजिए. 2 एन की एक धारा के तहत संयुक्त जैविक चरणों सूखी और (पतली परत क्रोमैटोग्राफी आगे के विश्लेषण के लिए प्रस्तुत: टीएलसी 14, 37, लिक्विड क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री: एलसी एम एस 14).

Representative Results

यह फ्लोएम रस की जटिलता पौधों इष्टतम प्रतिक्रिया के लिए विकास और तनाव का संकेत बदलती भेजने के सवाल का जवाब हो सकता है कि पिछले कई वर्षों से स्पष्ट हो गया है. ईडीटीए-मदद की फ्लोएम स्त्राव का उपयोग अन्य तरीकों के लिए उपयुक्त नहीं हैं, लेकिन आर्थिक या शारीरिक ब्याज की हो सकती है कि पौधों से फ्लोएम exudates का विश्लेषण करने का अवसर प्रदान कर सकता है.

पर्याप्त फ्लोएम की फसल फ्लोएम स्थानीयकृत प्रोटीन की पहचान और (चित्रा 3) के विकास या तनाव के जवाब में अपने स्तर में परिवर्तन का पता लगाने के लिए exudates के लिए इस विधि की अनुमति देता है. आंकड़े से पता चलता है, प्रोटीन बहुत कम बहुतायत में हैं, अभी तक, अपने स्तर LC-MS/MS का उपयोग कर बाद में प्रोटिओमिक्स प्रयोगों के लिए या पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए काफी अधिक है. Cucurbits में निष्कर्ष स्टेम के काटने के पानी संभावित संतुलन के विघटन और पानी की एक बाद बाढ़ की ओर जाता है और सुझाव है किapoplast 41 से संभव contaminants. : अभी तक एक से आठ घंटे से लेकर समय के लिए संग्रह फ्लोएम प्रोटीन प्रोफाइल / रचना Arabidopsis में (. केवल पूर्ण राशि Guelette एट अल भिन्न होता है), एकत्र प्रोटीन की मात्रा और पाया प्रोटीन के पैटर्न को प्रभावित नहीं करता प्रजातियों (Arabidopsis के बीच होती है पर, Perilla, लेन मैं और एनआई) और उपचार (Perilla अलग दिन लंबाई से बढ़ी, लेन मैं और एनआई). नतीजतन प्रोटीन संकेत देखे जा सकते हैं, पहचान और पीछा किया.

mRNA और माइक्रो आरएनए भी इस विधि द्वारा फ्लोएम exudates में पहचाना जा सकता है. हालांकि, RNAse अवरोध करनेवाला के साथ इलाज के विस्तारित स्त्राव के समय के दौरान mRNA की गिरावट को रोकने के लिए आवश्यक है. चलनी तत्वों कार्यात्मक क्लोरोप्लास्ट, Rubisco छोटे या बड़े सबयूनिट (क्रमशः लाल रक्त कोशिकाओं या RbcL,) शामिल नहीं है के बाद से फ्लोएम में जाना जाता है, जबकि mRNAs, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैस्थानीयकृत ubiquitin-conjugating एंजाइम की तरह mRNA के एक सकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 4) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

इसी तरह, शक्कर या छोटे मेटाबोलाइट्स जीसी एमएस या नियंत्रण रेखा एमएस या तो उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है. यहाँ यह फ्लोएम exudates लगभग पूरे glycolytic मार्ग 12 सहित कार्यात्मक एंजाइमों की एक बड़ी संख्या में होते हैं कि उल्लेख किया जाना चाहिए. इसलिए, कई बार अंक का उपयोग कर पीब संग्रह के दौरान चयापचय की प्रक्रिया को बता सकते हैं. एक उदाहरण चित्रा 5 में दिखाया गया है: सभी exudates में, सूक्रोज सबसे प्रचुर मात्रा में metabolite है, यह 1 घंटे के लिए एक संग्रह के बाद सबसे स्पष्ट है. हालांकि, पांच घंटे बाद फ्रुक्टोज अनुपात को सुक्रोज से थोड़ा कम है. एक ही पीब अगले चार घंटे के लिए एक घंटे के लिए एकत्र और बेंच पर छोड़ दिया जाता है, तो अनुपात fructose को सुक्रोज फ्लोएम में सक्रिय एंजाइमों कमरा मंदिर में सुक्रोज की गिरावट के लिए नेतृत्व exudates, सुझाव है कि एक बहुत बड़ी हद तक कम हो जाता हैतापमान (अधिक शिखर व्याख्याओं के लिए 14 देखें). यह प्रणाली अपने जीवन शक्ति 34 खो देता है जब तक फ्लोएम लोडिंग और चलनी तत्वों में साथी कोशिकाओं से अणुओं के परिवहन स्त्राव के दौरान जारी रख सकते हैं कि निष्कर्षों के साथ संगत है.

फ्लोएम exudates में लिपिड और विस्तार के द्वारा, लंबी दूरी की लिपिड संकेत संयंत्र विज्ञान के क्षेत्र में ब्याज की एक काफी हाल ही क्षेत्र हैं. उनके हाइड्रोफोबिक प्रकृति लिपिड के कारण कम मात्रा में ही मौजूद हैं और solubilization के लिए अन्य अणुओं के लिए बाध्य किया जा सकता है. फिर भी, EDTA-मदद की स्त्राव कल्पना करने के लिए पर्याप्त सामग्री के संग्रह के लिए अनुमति देता है (टीएलसी, चित्रा 6) और (नियंत्रण रेखा एमएस, चित्रा 7) की पहचान कई प्रजातियों के पौधे से फ्लोएम लिपिड. आंकड़े से पता चलता है के रूप में यह कई लिपिड प्रजातियों की पहचान और अलग करने के लिए संभव है. नियंत्रण रेखा एमएस अलग लिपिड प्रजातियों की पहचान करने के लिए और विभिन्न के लिपिड प्रोफाइल में बदलाव पर नजर रखने के लिए अनुमति देता हैNT के जीनोटाइप या उपचार. इस संयंत्र विकास और तनाव प्रतिक्रिया दौरान लिपिड की भूमिका का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Arabidopsis या Perilla के फ्लोएम exudates के संग्रह का फ्लो चार्ट. विभिन्न रास्तों नीले रंग में संकेत कर रहे हैं, जो अलग अंत उत्पादों के लिए नेतृत्व. शाही सेना, RNAse अवरोध (100 यू / एमएल, रॉश) की तैयारी के लिए फ्लोएम पीब एकत्र किया जाता है जो पानी को जोड़ा जाता है.
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चित्रा 2
चित्रा 2. इकट्ठा फ्लोएम पीब के लिए सामग्री का सेटअपआयन. सेटअप प्रोटोकॉल कदम 3.1-3.4 के लिए आवश्यक सभी सामग्री को प्रदर्शित करता है.
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चित्रा 3
. वजन आणविक मार्कर (2 लेन): मेगावाट, फ्लोएम में पाया चित्रा 3 प्रोटीन दो विभिन्न प्रजातियों के पौधे, Arabidopsis (कम) और Perilla (; अलग दिन लंबाई मैं और एनआई) की exudates. प्रोटीन एक 10-20% ढाल एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर अलग हो गए थे.
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चित्रा 4
चित्रा 4. विश्लेषणRubisco छोटे और बड़े सबयूनिट के लिए mRNA (क्रमशः लाल रक्त कोशिकाओं और RbcL,) और ubiquitin-conjugating एंजाइम (यूबीसी) की उपस्थिति की. mRNA के Arabidopsis पत्ते (एल), पर्णवृन्त (पी), और फ्लोएम exudates (पीएचडी) से एकत्र किया गया था, पीसीआर का उपयोग कल्पना लिखित और विशिष्ट टेप को उल्टा. आंकड़ा Guelette एट अल से संशोधित किया गया था. 14.
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चित्रा 5
फ्लोएम के चित्रा 5. जीसी एमएस प्रोफ़ाइल बार की अलग राशि के लिए एकत्र exudates. नोट कैसे संग्रह समय (बी) के 5 घंटे के लिए 1 घंटे संग्रह (ए) से सूक्रोज परिवर्तन के रिश्तेदार राशि. कमरे में "ऊष्मायन" के बाद 1 घंटे के लिए संग्रह के बाद प्रोफाइल पीब चार घंटे के लिए तापमान (आर टी) (सी). पत्ता मेटाबोलाइट प्रोफाइल (डी).
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चित्रा 6
चित्रा 6. पतली परत Perilla (बाएं) और Arabidopsis (दाएं) पत्तियों और फ्लोएम exudates से लिपिड की तुलना वर्णलेख. सितारे फ्लोएम exudates के लिए विशिष्ट लिपिड संकेत मिलता है. DGDG: digalactosyldiacylglycerol, पीजी: phosphatidylglycerol, MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; Arabidopsis लिपिड प्रदर्शित आंकड़ा का हिस्सा Guelette एट अल से संशोधित किया गया है 14..
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चित्रा 7. नियंत्रण रेखा एमएस / नकारात्मक आयन मोड का उपयोग Arabidopsis के फ्लोएम exudates (क्लोरोफॉर्म चरण) के लिपिड प्रोफाइल. शीर्ष में रेखाचित्र (उत्परिवर्ती, ए) और नीचे (जंगली प्रकार, बी) दो अलग जीनोटाइप (तीर द्वारा संकेत) के बीच लिपिड प्रोफाइल में अंतर दिखा.
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Discussion

फ्लोएम exudates की ईडीटीए-सुगम संग्रह बहुत सरल है, न्यूनतम उपकरणों की जरूरत है, और सबसे अधिक पौधों के लिए लागू है. कुल मिलाकर, इस विधि से अधिक प्रजातियों से फ्लोएम exudates विश्लेषण करने की क्षमता प्रदान करता है. पीब पतला है, यह सामग्री की एक बड़ी राशि के लिए पैमाने पर करने के लिए कई अलग अलग नमूने लेने या कई पौधों से करने के लिए आसान है. यह तो बहुत कम बहुतायत में हैं और अन्यथा की अनदेखी हो जाएगा कि उपन्यास यौगिकों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है.

यह विधि कई प्रजातियों के पौधे के लिए इस्तेमाल किया और इस पांडुलिपि में सूचीबद्ध लोगों के लिए वर्णित के रूप में काम करता है हो सकता है. नई प्रजातियों का पता लगाया जाता है, तो संशोधन की आवश्यकता हो सकती है कि दो पहलुओं इस्तेमाल किया पत्तियों और स्त्राव के समय की संख्या में हैं. ज्यादातर मामलों में, पांच को आठ घंटे स्त्राव उपयुक्त होना चाहिए. एक नए संयंत्र प्रजातियों के लिए इस विधि का उपयोग की पुष्टि करने के लिए, पीब प्रोटोकॉल भाग 4 n में वर्णित के रूप में एकत्र की है और बाद के विश्लेषण के लिए एक या अधिक होने की जरूरतeeds प्रदर्शन किया जाएगा. मनाया संकेत की तीव्रता पर निर्भर करता है, संग्रह की मात्रा को बढ़ाया जा करना पड़ सकता है. पूर्व फ्लोएम exudates में कम प्रचुर मात्रा में होते हैं, सामान्य में, लिपिड और प्रोटीन विश्लेषण चीनी और metabolite विश्लेषण से अधिक सामग्री की आवश्यकता होगी.

ईडीटीए-मदद की पीब संग्रह कटौती सतहों के साथ ही EDTA के एक संभावित हानिकारक प्रभाव शामिल है, कई बिंदुओं पर विचार किया जाना है: (1) EDTA के साथ एक घंटे ऊष्मायन के बाद, पर्णवृन्त अच्छी तरह से धोया जाना है. इस घायल कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं को नुकसान या निकासी के साथ हस्तक्षेप कर सकता है जो ईडीटीए ही है, से प्राप्त किसी भी यौगिकों को हटा. (2) सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्राप्त आंकड़ों फ्लोएम रस से प्राप्त कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए और न घायल कोशिकाओं से (नीचे महत्वपूर्ण कदम देखें). (3) फ्लोएम रस पीब संग्रह के दौरान सक्रिय हो सकता है जो कई एंजाइमों, नियंत्रित करता है. इसलिए, कुछ मामलों में यह के लिए इकट्ठा करने के लिए उपयोगी हो सकता हैसमय के आर विभिन्न मात्रा. विधि पानी में रिसाव शामिल के बाद से (4), यौगिकों की एक पूर्ण मात्रा का ठहराव संभव नहीं है.

महत्वपूर्ण कदम: (. रेफरी देख 14) उचित नियंत्रण के किसी भी कोशिकाओं के रूप में भी उपयोग चोट पहुंचाना नहीं करने के लिए नमूना से निपटने जबकि इस विधि का सफल प्रयोग करने के लिए महत्वपूर्ण सतर्कता का इस्तेमाल होता है. एक उपयुक्त नियंत्रण EDTA के साथ पूर्व इलाज के बिना फ्लोएम exudates का संग्रह है. इस मामले में फ्लोएम ही सील होगा और कोई पीब एकत्र किया जा सकता है. घायल कोशिकाओं से आने वाले किसी भी contaminating यौगिकों यहाँ पता लगाया जाएगा. एक दूसरा नियंत्रण पीब में शर्करा का विश्लेषण किया जाएगा. Arabidopsis में, सूक्रोज 1:04 और 1:08 (रेफरी 8, 14) के बीच की sucrose के अनुपात को फ्रुक्टोज के साथ, फ्लोएम रस के भीतर प्रमुख मेटाबोलाइट होना चाहिए.

शाही सेना निकासी के लिए एक RNase अवरोध का उपयोग आवश्यक है. पहले describ के अलावा, एक सकारात्मक नियंत्रणएड फ्लोएम स्थानीयकृत mRNA (UBC9: Ubiquitin conjugating एंजाइम 9, At4g27960, 8, 14) और उदाहरण के लिए की एक नकारात्मक नियंत्रण एक क्लोरोप्लास्ट mRNA (Rubisco LSU) की सलाह दी जाती हैं.

पीब सक्रिय एंजाइम होता है, क्योंकि एक समय पाठ्यक्रम संग्रह समय में बदलाव करने के लिए बस की वजह से नहीं कर रहे हैं फ्लोएम प्रोफ़ाइल में यकीन बदलाव करने की सलाह दी है. कुछ मामलों में, यह proteinase अवरोधकों का उपयोग करने के लिए फायदेमंद हो सकता है. हालांकि, जांचकर्ताओं एकत्र पीब ध्यान केंद्रित किया है और किसी भी जोड़ा यौगिकों मोटे तौर पर ध्यान केंद्रित किया जाएगा कि हो जाएगा कि, मन में रखने की जरूरत है. प्रोटोकॉल के भीतर एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम EDTA के तहत डंठल की recutting है. यह कदम एक दोहरे उद्देश्य में कार्य करता है: नई इस प्रकार फ्लोएम रस के मुक्त प्रवाह की अनुमति के लिए प्लग के गठन को रोकने, जबकि सबसे पहले, यह किसी भी सील चलनी प्लेटें निकाल देता है. दूसरा, यह जबकि काटने उत्पन्न जाइलम में cavitation बुलबुले को निकालता है और इस प्रकार जाइलम परिवहन के लिए अनुमति देता है. दूसरी कट का आकार निर्भरइस्तेमाल पौधों पर है. बड़ा पर्णवृन्त साथ पौधों में यह Arabidopsis जैसे पौधों में पहली कट, ऊपर कई मिलीमीटर (1 सेमी) होना चाहिए, 1-2 मिमी के लिए पर्याप्त हैं.

इस विधि का उपयोग, विकास या जैव चिकित्सा निहितार्थ संकेत हो सकता है कि फ्लोएम exudates में उपन्यास यौगिकों की खोज करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यह फ्लोएम लिए उपयोग की कमी के कारण संयंत्र विज्ञान के भीतर एक छोटे से अध्ययन क्षेत्र था जो लंबी दूरी लिपिड संकेत, पर में गहराई से देखो एक अधिक प्रेरित किया है.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन NSF-आईओएस अनुदान # 1144391 तक SHB द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K2-EDTA Sigma-Aldrich ED2P-500G  
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15cm) PYREX or Corning Any clean, shallow dish will work
Chloroform EMD CX1054-1 Only open containers in fume hood
Methanol J.T.Baker 9070-03  
Screw cap tubes VWR International 53283-800  
Screw cap tubes Sun Sri 13-425  
Eppendorf tubes Denville C2170  

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Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method. J. Vis. Exp. (80), e51111, doi:10.3791/51111 (2013).

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