المعرفة من تكوين اللحاء SAP فضلا عن آلية التحميل والنقل لمسافات طويلة لها أمر ضروري لفهم الإشارات لمسافات طويلة في تطوير المصنع والإجهاد / استجابة الممرض واستيعاب وسائل النقل. يصف هذا المخطوط جمع الإفرازات اللحاء باستخدام طريقة EDTA-يسر.
اللحاء المصنع هو ضروري لنقل لمسافات طويلة من (الصور) تستوعب وكذلك من الإشارات نقل الإجهاد الحيوية أو غير الحيوية. أنه يحتوي على السكريات والأحماض الأمينية والبروتينات والحمض النووي الريبي، والدهون والأيض الأخرى. بينما هناك اهتمام كبير في فهم تركيبة ووظيفة اللحاء، ودور كثير من هذه الجزيئات، وبالتالي، أهميتها في تطوير المصنع والإجهاد استجابة لديه لم يتحدد بعد. واحد عائقا أمام تحليل اللحاء تكمن في حقيقة أن الأختام اللحاء نفسه على جرح. ونتيجة لذلك، فإن عدد النباتات التي يمكن الحصول عليها اللحاء SAP محدودة. أسلوب واحد الذي يسمح مجموعة من الإفرازات اللحاء من عدة أنواع النباتات دون معدات المضافة هي اللحاء جمع الافرازات EDTA التي يسهلها وصفها هنا. في حين أنه من السهل الاستخدام، وأنها لا تؤدي إلى جرح الخلايا والرعاية يجب أن يؤخذ لإزالة محتويات الخلايا التالفة. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الضوابط لإثبات نقاء الافرازاتضرورية. لأنها تحلب بدلا من التحصيل المباشر من اللحاء SAP (غير ممكن في كثير من الأنواع) يمكن أن يحدث الكمي النسبي فقط من محتوياته. وميزة هذا الأسلوب مقارنة مع الآخرين هو أنه يمكن استخدامها في العديد من الأنواع النباتية العشبية أو الخشبية (بريلا، نبات الأرابيدوبسيس، الحور، الخ) ويتطلب الحد الأدنى من المعدات والتدريب. أنه يؤدي إلى كميات كبيرة من الإفرازات معقولة التي يمكن استخدامها لتحليلها لاحقا من البروتينات، والسكريات، والدهون، والحمض النووي الريبي والفيروسات ونواتج الأيض. انها بسيطة بما فيه الكفاية أنه يمكن أن تستخدم في كل من البحث وكذلك في مختبر التدريس.
النباتات لا يمكن أن تتحرك إلى الفرار من الظروف المعاكسة. ونتيجة لذلك، كان لديهم لتطوير آليات للكشف عن الضغوط البيئية، وانتزاع إرسال إشارة ذات الصلة في جميع أنحاء المصنع، وضبط التنمية وفقا لذلك. توجد نظم النقل اثنين لتوزيع المياه والمواد الغذائية وغيرها من المركبات (إشارات). الأول هو الخشب؛ الذي ينقل عادة الماء والمعادن تناولها من قبل الجذور في جميع أنحاء المصنع. والثاني هو اللحاء. لقد تغيرت وجهة نظر اللحاء من استيعاب نظام النقل بسيطة لقناة لRNA والبروتين، والفيروسات، والدهون والجزيئات الصغيرة الأخرى. انها تلعب دورا هاما في استيعاب ونقل المواد الغذائية، استجابة للضغوط الحيوية وغير الحيوية، وكذلك في نمو وتطور النبات. ويطلق الآن عليها اسم "طريق المعلومات السريع" من النبات 18.
ويتكون اللحاء من عدة أنواع من الخلايا: لحمة اللحاء، وكذلك رفيق المتخصصة CELLS وعناصر غربال. العنصر غربال هو موقع الحركة لمسافات طويلة. للسماح لتدفق طولية دون عائق، وعناصر غربال مفقودة معظم العضيات وكذلك النوى والتي يعتقد أنها تحتوي في أحسن الأحوال محدودة الآلات متعدية 21، 33. ويعتقد أن الخلايا رفيق تجميع البروتينات وغيرها من المركبات التي تسافر في تيار اللحاء. ثم يتم نقل هذه المركبات إلى عنصر غربال عبر رابطات هيولية ويمكن أن تعمل كإشارات لمسافات طويلة 4،16.
يمكن العثور على عدة مجموعات من المركبات في الإفرازات اللحاء:
ويتمثل التحدي في العمل مع اللحاء النبات تكمن في قدرته على عزل نفسه عند اصابة. هناك أربعة أساليب رئيسية تستخدم لجمع الإفرازات اللحاء، ولكنها تعمل فقط في الأنواع حدد:
1) في القرعيات أنه من الممكن الحصول على كميات معقولة من اللحاء الافرازات من خلال تخفيضات للسويقات. بمجرد إزالة الانخفاض الأولي مع التلوث من الخلايا المصاب، فمن الممكن الحصول على كميات كبيرة من الذهب الخالص معقول اللحاء SAP 1، 15. ومع ذلك، مع زيادة وقت جمع، هذه الافرازات يثخن، مما يجعلها غير صالحة على نحو متزايد لنهج اللوني السائل (غير منشورة). المنشورات الأخيرة تشير إلى أن تبعا للأنواع، ويستمد هذا اللحاء SAP من eitheص حزمي (FP) أو extrafascicular اللحاء (EP) والتي، في حين أنها لا تحتوي على "المحمول" اللحاء SAP من العناصر غربال (FP)، بل هو أيضا عرضة للتلوث من أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك الخشب 40، 41 .
2) والنهج الثاني هو الحصول على اللحاء SAP من خلال تخفيضات الضحلة أو ثقوب في الساق أو سويقات. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح في الترمس 17، 25، 36 القرعيات، والكرنب napus 12. هنا التلوث من الخلايا المصاب هو الحد الأدنى والإفرازات نقية جدا. ومع ذلك، النباتات تحتاج إلى أن تكون صحية وجيدة تسقى منذ انها صعبة للغاية لثقب انتقائي فقط العناصر غربال. إذا رصدت سفن الخشب، ويوجه كل الافرازات في مجرى الخشب. هذا يجعل طريقة غير مناسبة للنباتات مع أعناق أو سيقان هشة للغاية أو lignified للغاية.
3) stylectomy المن المن يسمح لإدراج مرود بهم في عناصر غربالن إزالة أولا بأول مع ليزر. وناضح اللحاء SAP من خلال ما تبقى من مرود 2، 9، 10، 35، 38. من الناحية النظرية، أي النباتات التي يمكن أن تصاب المن يمكن استخدامها لهذا النهج. ومع ذلك، فإن معظم الدفيئة أو مديري غرفة نمو لا يعتمد استخدام الممرض. وبالإضافة إلى ذلك، المن إدخال العديد من البروتينات في اللحاء مع لعابهم 19، 33. وهذا يؤدي إلى إعادة برمجة النسخي محدودة 30 و لديه القدرة على تغيير التركيبة اللحاء 26.
4) وصف الأسلوب هنا هو نضح EDTA-سهلت من اللحاء SAP. هذا الأسلوب يستخدم EDTA لمنع تسرب من اللحاء 20. EDTA يخلب كا 2 + الأيونات التي ستشارك خلاف ذلك في العمليات التي ختم اللحاء. بينما EDTA يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا 30، وقد استخدمت عدة مجموعات هذا الأسلوب، ويلاحظ أي تأثير سلبي من تركيزات EDTA من 10 ملم إلى 20 ملم على التركيب الدقيق خلية أو على phloeم التحميل والنقل 5، 24. للحد من أي تأثير ضار وكذلك التدخل من EDTA مع اللوني وهلام الكهربائي، يتم نقل النباتات الى الماء بعد 1 ساعة، ويستخدم فقط في جزء لاحق من الافرازات 14. وهكذا، بدلا من نضح في EDTA، وexudated اللحاء في الماء (EDTA-سهلت نضح). بل هو مستقيم إلى الأمام، وانخفاض التكلفة، ومنخفضة التقنية طريقة لجمع الإفرازات اللحاء. الحصول على اللحاء SAP بهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لتحليل البروتينات والجزيئات الصغيرة، والدهون، والرنا واستخدمت بنجاح في العديد من النباتات. في حين قد تم تنفيذ كمية محدودة من التجارب في ذوات الفلقة 11، الأسلوب يبدو أن أكثر ملاءمة لdicots (بريلا 17، 20، نبات الأرابيدوبسيس 8، 13، 14، الحور 7). مجموعة من الإفرازات أن تحدث في بيئة رطبة لتجنب فقدان الإفرازات من خلال النتح. اعتمادا على النبات، الحضانة في EDTA ل1-2 ساعات هوكافية لمنع ختم العناصر اللحاء / غربال. ويمكن بعد ذلك تحدث جمع في الماء. وهذا له فائدة من منع التأثير السلبي EDTA لديه على بنية الخلية والاستقرار. كما أنه يزيل التدخل من EDTA مع طرق مثل HPLC أو SDS-الصفحة. ويرد عليه كما ينطبق على نبات الأرابيدوبسيس. للنباتات أكبر، الحضانة في EDTA والافرازات مجموعات لابد من زيادتها، ويتم تنفيذها في الأكواب بدلا من 1.7 في أنابيب رد فعل مل.
جمع EDTA-سهلت من اللحاء الإفرازات بسيطة جدا، ويحتاج الحد الأدنى من المعدات، وينطبق على معظم النباتات. وعموما، هذا الأسلوب يمتد القدرة على تحليل الإفرازات اللحاء من أكثر الأنواع. على الرغم من أن الافرازات غير المخفف، فمن السهل أن جمع العديد من عينات مختلفة أو من العديد من النباتات لزيادة لكمية كبيرة من المواد. هذا ثم يسمح للكشف عن المركبات الرواية التي هي في وفرة منخفضة جدا وولاها يمكن تجاهلها.
هذه الطريقة يمكن استخدامها لأنواع النباتات متعددة ويعمل كما هو موضح لتلك المذكورة في هذه المخطوطة. إذا يتم استكشاف أنواع جديدة، واثنين من الجوانب التي قد تحتاج إلى تعديل هي عدد الأوراق المستخدمة والوقت من نضح. في معظم الحالات، ينبغي أن يكون نضح 5-8 ساعة مناسبة. للتأكد من استخدام هذه الطريقة للحصول على الأنواع النباتية الجديدة، الافرازات يحتاج إلى جمع واحد أو أكثر من تحليل لاحقة كما هو موضح في البروتوكول جزء 4 نeeds التي يتعين القيام بها. اعتمادا على شدة إشارة لوحظ، قد تحتاج إلى جمع حجم زيادتها. بشكل عام، سوف الدهون والبروتين تحليل تتطلب المزيد من المواد من السكر والأيض تحليل منذ السابق هي أقل وفرة في الإفرازات اللحاء.
لأن جمع الافرازات EDTA-سهلت ينطوي على السطوح قطع فضلا عن تأثير المدمر المحتمل لEDTA، عدة نقاط يجب النظر فيها: (1) بعد الحضانة ساعة واحدة مع EDTA، وأعناق يجب غسلها جيدا. هذا يزيل أي المركبات التي تم الحصول عليها من خلايا الجرحى فضلا عن EDTA نفسها، والتي يمكن أن تضر خلايا أو تتداخل مع الاستخراج. (2) بحاجة الضوابط الإيجابية والسلبية التي ستدرج لضمان وتستمد البيانات التي تم الحصول عليها من اللحاء SAP وليس من خلايا المصاب (انظر الخطوات الحاسمة أدناه). (3) اللحاء SAP لا تحتوي على العديد من الإنزيمات، والتي يمكن أن تكون نشطة خلال جمع الافرازات. وبالتالي، في بعض الحالات، قد يكون من المفيد جمع FOR كميات مختلفة من الوقت. (4) منذ الأسلوب تشارك نضح في الماء، وهو الكمي المطلق من المركبات غير ممكن.
الخطوات الحاسمة: إن مفتاح نجاح استخدام هذا الأسلوب هو استخدام الحذر أثناء التعامل مع العينة أن لا تجرح أي الخلايا وكذلك استخدام الضوابط المناسبة (انظر المرجع 14). واحد للتحكم مناسبة هو مجموعة من الإفرازات اللحاء دون معالجة مسبقة مع EDTA. في هذه الحالة سوف اللحاء عزل نفسه ويمكن جمع أي الافرازات. سوف يتم الكشف عن أي تلويث المركبات القادمة من خلايا الجرحى هنا. ومن شأن التحكم الثاني يكون تحليل السكريات في الافرازات. في نبات الأرابيدوبسيس، ينبغي أن يكون السكروز السائد الأيض داخل اللحاء SAP، مع الفركتوز إلى نسبة السكروز من 1:04 حتي 01:08 (المرجع 8، 14).
لاستخراج الحمض النووي الريبي استخدام مثبط ريبونوكلياز هو ضروري. وبالإضافة إلى ذلك، تحكم إيجابية من describ سابقاإد مرنا اللحاء المترجمة (UBC9: اليوبيكويتين انزيم التصريف 9، At4g27960، 8، 14) والسيطرة السلبية من على سبيل المثال مرنا بلاستيدات الخضراء (Rubisco LSU) هي الأفضل.
لأن الافرازات تحتوي على خمائر نشطة، وينصح دورة الوقت لإجراء تغييرات في التشكيل الجانبي متأكد من اللحاء ليست ببساطة بسبب الاختلافات في وقت جمع. في بعض الحالات، قد يكون من المفيد استخدام مثبطات بروتين. ومع ذلك، فإن المحققين بحاجة إلى أن نضع في اعتبارنا، أن الافرازات التي تم جمعها سوف تتركز والتي سوف تتركز إلى حد كبير أي مركبات المضافة. والخطوة الثانية الحاسمة ضمن البروتوكول هو recutting من سويقات تحت EDTA. هذه الخطوة تخدم غرضا مزدوجا: أولا، أنه يزيل أي لوحات غربال مختومة في حين منع تشكيل جديد المقابس وبالتالي السماح للتدفق الحر للاللحاء SAP. الثاني، فإنه يزيل فقاعة التجويف في الخشب ولدت في حين خفض وبالتالي يسمح للنقل الخشب. حجم الخفض الثاني تعتمدق على النباتات المستخدمة. في النباتات مع أعناق أكبر ينبغي أن يكون عدة مليمترات (ما يصل إلى 1 سم) فوق قطع الأول، في النباتات مثل نبات الأرابيدوبسيس، مم 1-2 تكفي.
ويمكن استخدام هذه الطريقة تؤدي إلى اكتشاف مركبات جديدة في الإفرازات اللحاء التي كان يمكن أن يشير، والآثار التنموية أو الطب الحيوي. وقد دفع ذلك أكثر نظرة متعمقة في إشارة الدهون لمسافات طويلة، والذي كان حقل القليل المدروسة ضمن علوم النبات ويرجع ذلك إلى عدم الوصول إلى اللحاء.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم NSF-IOS المنحة الوطنية # 1144391 إلى البنك السعودي الهولندي.
K2-EDTA | Sigma-Aldrich | ED2P-500G | |
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm) | PYREX or Corning | Any clean, shallow dish will work | |
Chloroform | EMD | CX1054-1 | Only open containers in fume hood |
Methanol | J.T.Baker | 9070-03 | |
Screw cap tubes | VWR International | 53283-800 | |
Screw cap tubes | Sun Sri | 13-425 | |
Eppendorf tubes | Denville | C2170 |