Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Innsamling og analyse av doi: 10.3791/51111 Published: October 23, 2013

Summary

Kunnskap om sammensetningen av barken saft, samt mekanismen for dens lasting og langtransport er vesentlig betydning for forståelsen av langdistanse signalering i planteutvikling og stress / patogen respons og av assimilere transport. Dette manuskriptet beskriver samlingen av barken exudates ved hjelp av EDTA-tilrettelagt metode.

Abstract

Anlegget barken er viktig for langtransport av (foto-) assimilerer samt av signaler formidle biotiske eller abiotiske stress. Den inneholder sukkerarter, aminosyrer, proteiner, RNA, lipider og andre metabolitter. Mens det er en stor interesse for å forstå sammensetningen og funksjonen av barken, rollen av mange av disse molekyler og dermed deres betydning i planteutvikling og stressrespons er ennå ikke bestemt. En barriere for å phloem analysen ligger i det faktum at barken tetter seg ved såret. Som et resultat er antallet planter som phloem sevje kan oppnås begrenset. En metode som gjør det mulig samling av barken exudates fra flere plantearter uten tilsatt utstyr er EDTA-tilrettelagt phloem eksudat samling beskrevet her. Mens det er lett å bruke, gjør det føre til såret av celler og omsorg må tas for å fjerne innholdet i skadede celler. I tillegg til flere kontroller bevise renheten av eksudater nødvendig. Fordi det er en utsvetting og ikke en direkte samling av barken SAP (ikke mulig i mange arter) bare relativ kvantifisering av dens innhold kan forekomme. Fordelen med denne metode fremfor andre er at det kan brukes i mange urteaktige eller treaktige plantearter (perilla, Arabidopsis, poppel, etc.) og krever minimalt utstyr og opplæring. Det fører til rimelig store mengder av eksudater som kan brukes for påfølgende analyse av proteiner, sukker, lipider, RNA, virus og metabolitter. Det er enkelt nok til at det kan brukes i både forskning så vel som i et laboratorium undervisning.

Introduction

Planter kan ikke flytte til unnslippe ugunstige forhold. Derfor måtte de utvikle mekanismer for å oppdage miljømessige belastninger, lokke fram og overføre et beslektet signal gjennom hele anlegget, og justere utviklingen deretter. To transportsystemer eksisterer for distribusjon av vann, næringsstoffer og andre (signalering) forbindelser. Den første er den xylem; som typisk transporterer vann og mineraler tatt opp med røttene gjennom hele anlegget. Den andre er barken. Visningen av barken har endret seg fra en enkel assimilere transportsystem til en kanal for RNA, proteiner, virus, lipider og andre små molekyler. Det spiller en viktig rolle i å assimilere og næringsstoff transport, respons til biotiske og biotiske stress, samt i plante-vekst og utvikling. Det er nå kalt "informasjonen motorvei" av anlegget 18 år.

Barken består av flere celletyper: phloem parenchyma, samt spesialiserte ledsager ceLLS og sil elementer. Silen element er stedet for langdistanse bevegelse. For å tillate fri langsgående strømning, blir sil elementer som mangler de fleste organeller samt kjerner og er antatt å inneholde i beste fall en begrenset translasjons-maskineri 21, 33.. Det antas at ledsager celler syntetisere proteiner og andre stoffer, som reiser i barken stream. Disse forbindelser blir deretter transportert inn i sil element via plasmodesmata og kan fungere som langdistanse-signaler 4,16.

Flere grupper av forbindelser kan finnes i barken eksudater:

  • Sukker er ofte produkter av fotosyntese og transporteres som "energi-bærer" molekyler til andre deler av anlegget for lagring eller som byggesteiner. Imidlertid kan de også fungere som frostvæske eller som signaliserer forbindelser.
  • Proteiner kan også bli funnet i barken exudates. De inkluderer metabolske enzymer, men også har signaliserer funksjon. En example av et protein som fungerer som en utviklingsmessig signal er Blomstrende locus T protein, som signaliserer induksjon av blomstring, samt sesongmessige blad abscission i planter. 6
  • Nukleinsyrer er til stede i eksudater barken i form av mRNA, små og svært små RNA, og er virale RNA'er. De synes å være i stor grad involvert i 27 signalering, 28, 39. Samtidig har rRNA og tRNA for nesten alle aminosyrer blitt observert i barken saft av cucurbits 42. De ser ut til å bli selektivt overført inn i sil rør-systemet. De tRNA viser modifikasjoner som er nødvendige for evnen til å overføre aminosyrer til den translasjonelle apparat. Likevel, i stedet for å delta i oversettelse, synes de å hemme denne prosessen. Alternativt kan de tjene som en kilde for cytokinin eller signalisere den metabolske status av anlegget 42..
  • Fettsyrer, oxylipins og andre lipider er også funnet i barken 3 eksudater, 13, 14, 23.. Jasmonic syre, AN oxylipin beveger seg gjennom barken som en del av responsen til patogen infeksjon 22, 29, 31, 32. Mens den rollen de fleste phloem lipider er fortsatt uklart, noen av dem sannsynligvis har signaliserer funksjon 4.

Utfordringen i å jobbe med anlegget phloem ligger i dens evne til å tette seg selv på såret. Det er fire store metoder som brukes for å samle phloem exudates, men de fungerer bare i utvalgte arter:

1) I cucurbits er det mulig å få rimelige mengder phloem eksudat gjennom kutt i petiole. Når begynnelsesfallet med forurensning av skadde celler er fjernet, er det mulig å oppnå rimelig store mengder av rent phloem en saft, 15.. Men med økende samling tid, dette eksudat blir tykkere, slik at det i økende grad uegnet for væskekromatografi framgangsmåter (upublisert). Nyere publikasjoner antyder, at avhengig av art, er dette phloem saft avledet fra either den fascicular (FP) eller extrafascicular phloem (EP), og at, mens det ikke inneholder "mobile" phloem saft fra silen elementer (FP), er det også utsatt for forurensning fra andre celletyper, inkludert Margen 40, 41 .

2) En annen tilnærming er å få phloem saft gjennom grunt kutt og punkteringer i stammen eller petiole. Denne metoden har vært brukt med hell i 17 lupin, 25, 36 cucurbits, og Brassica napus 12. Her er forurensning fra skadde celler er minimal og exudates svært ren. Men plantene trenger for å være sunn og godt vannet siden det er svært utfordrende å selektivt punktering bare sil elementer. Hvis xylem skip bretter, alt eksudatet trukket inn i xylem stream. Dette gjør metoden uegnet for planter med svært skjøre eller svært lignified petioles eller stengler.

3) Aphid stylectomy tillater bladlus å sette inn sine stylet inn i sil elementer in fjerne aphid med en laser. Phloem sevjen utstrålte gjennom de resterende to stilett, 9, 10, 35, 38. I teorien kan hvilken som helst plante som kan være infisert med bladlus skal brukes for denne tilnærming. Imidlertid vil de fleste drivhus eller vekstkammeret ledere ikke støtter bruk av et patogen. I tillegg bladlus innføre flere proteiner inn i barken med spytt 19, 33.. Dette fører til en begrenset transcriptional omprogrammering 30 og har potensial til å endre phloem sammensetning 26.

4) Metoden som beskrives her er EDTA-tilrettelagt exudation av barken saft. Denne fremgangsmåten anvender EDTA for å forhindre tetning av barken 20.. EDTA chelatene Ca 2 +-ioner som ellers ville delta i prosesser som forsegle barken. Mens EDTA kan føre til celleskade 30, har flere grupper brukt denne metoden og observert noen ugunstig effekt av EDTA-konsentrasjoner fra 10 mM til 20 mM i celler ultrastructure eller på phloem lasting og transport 5, 24. For å redusere noen skadelig virkning så vel som forstyrrelser av EDTA med kromatografi og gel-elektroforese, er planter beveget over i vann etter 1 time og bare den siste del av eksudatet benyttes 14.. Således, i stedet for eksudasjon inn EDTA, blir barken exudated i vann (EDTA-tilrettelagt utsvetting). Det er en rett-fram, rimelig, og low-tech metode for innsamling av barken exudates. Phloem saft oppnådd på denne måten kan brukes for å analysere proteiner, små molekyler, lipider, og RNA'er og har vært brukt med hell i mange planter. Selv om et begrenset antall forsøk har vært utført i monocots 11, vises metoden til å være mer egnet for dicots (17 perilla, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, 7 Poplar). Innsamling av exudates må skje i et fuktig miljø for å unngå tap av exudates gjennom transpirasjon. Avhengig av anlegget, er inkubasjon i EDTA i en til to timertilstrekkelig til å hindre forsegling av barken / sil-elementer. Samlingen kan da forekomme i vann. Dette har fordelen av å forhindre den negative effekten EDTA har på celle-struktur og stabilitet. Det eliminerer også forstyrrelser av EDTA med metoder som HPLC eller SDS-Page. Det er vist som det gjelder for Arabidopsis. For større anlegg, har inkubasjon i EDTA og eksudat samlinger å bli skalert opp og blir utført i stedet for begre i 1,7 ml reaksjonsrør.

Protocol

En. Utarbeidelse av Planter

  1. Arabidopsis frø kan spire direkte på jord eller på MS plater. Dyrke planter i fire til seks uker i vekstkamre med en 12-timers daglengde (22 ° C dag, 15 ° C natt 14). Vannplanter gang til to ganger i uken. Bruk nederste skuffen for vanning, ikke vannplanter fra toppen, la brettene tørke før re-vanning. Sørg for at plantene er godt hydrert på tidspunktet for innhøsting.

2. Utarbeidelse av løsninger og Retter

  1. K 2-EDTA-løsning: Lag en 100 mM K 2-EDTA-løsning lager løsning, som kan oppbevares i kjøleskap. På dagen for innsamling, fortynne løsningen 1-5 (en del EDTA-oppløsning, fire deler vann) for å oppnå en 20 mM K-2-EDTA-oppløsning.
  2. Fyll et glass eller petriskål (diameter 7-15 cm) halvveis med 20 mM K 2-EDTA-løsning. Hvis samle prøver fra ulike behandlinger (for exgod kontroll og salt-stressede planter eller ulike genotyper), utarbeide egne retter for hver behandling.
  3. Fyll ønsket antall 1,7 ml reaksjonsrør med 1,4 ml av 20 mM K 2-EDTA-oppløsning. Fylle et tilsvarende antall reaksjonsrør med 1,4 ml autoklavert deionisert eller Millipore-vann.
  4. Sett papirhåndklær på benken for å sette plantene på, få en ny barberblad og satt på hansker.

3. Innsamling av barken Exudates (Avbildet i Flytskjema i figur 1)

  1. Harvest-rosett blader fra fire til seks uker gamle planter ved å kutte dem med barberbladet i bunnen av bladstilken nær sentrum av rosetten.
  2. Umiddelbart plassere bladene i rettene inneholder 20 mM K 2-EDTA. Kontroller at den kappede enden av bladstilken er neddykket i løsningen (figur 2).
  3. Når bladene 15 er blitt samlet opp (ca. 3-4 planter), forsiktig stable bladene på toppen av hverandre slik tlue på snitt petioles er på linje med hverandre. Skjæres på bunnen av petioles (ca. 1 mm) og umiddelbart føre bladene i en av reaksjonsrørene med 20 mM K-2-EDTA-oppløsning. Bladene passer lettest hvis de er svakt rullet opp. Unngå å klemme bladene i siden dette kan føre til skade på cellene, og dermed fører til oppsamling av blad celleinnhold.
  4. Hvis mer materiale er nødvendig, forsiktig dekke prøvene med et vått papirhåndkle. Bruk et nytt sett av retter hvis for innsamling av prøver fra ulike behandlinger eller genotyper.
  5. Når alle prøver er plassert i reaksjonsrør, samle de eksudater enten i mørke eller i lys.
  6. For samling i mørket, linje gulvet i et stort grunt fat med våte papirhåndklær. Sett risten med blad-fylt Reaksjonsrørene i fatet og enten dekke med våte papirhåndklær eller satt i en svart plast tilbake med åpninger for lufting. Plasser hele oppsettet i et skap eller et mørkt rom.
  7. For samling i lyset, linje bunnen av en klar plexiglass container med våte papirhåndklær. Sett risten med blad-fylt Reaksjonsrørene i beholderen og lukk den.
  8. Etter 1 time, etterlater fjern forsiktig fra beholderen og reaksjonsrørene og vask grundig med destillert, avionisert eller Millipore vann for å fjerne EDTA. Dette trinnet tjener tre formål: (1) det fjerner EDTA til minimaliseres skaden på cellene, (2) den eliminerer forstyrrelser av EDTA med SDS-PAGE og kromatografi, og (3) fjerner eventuelle forbindelser som har akkumulert fra kutt / skadet celler. Umiddelbart overføre til oppkjørte reaksjon rør som inneholder autoklaverte vann og gå tilbake til de fuktede containere for innsamling av exudates. På dette punktet, tilsett RNase inhibitor hvis sårsekret må brukes for RNA-ekstraksjon. Valgfritt: Proteinase hemmer kan legges til hvis protein analyse er ønskelig.
  9. Etter den tiltenkte samling tid, trekk ut og discard bladene og fryse barken exudates i flytende N 2 for videre bruk. Hvis utvidet lagring er nødvendig, lyophilize prøvene og oppbevar ved -80 ° C.
  10. I tilfelle av Arabidopsis, kan metabolitter allerede påvises etter oppsamling av eksudater i 1 time. Imidlertid er samling for 5-8 timers tilrådelig hvis analyse av mindre rikelig komponenter er planlagt. For større anlegg som Perilla, lengre samling ganger (8 timer) anbefales.
    Oppsamlet fra 15 bladene er typisk nok til ett kjørefelt på en SDS-PAGE-gel (proteiner), til mRNA-ekstraksjon, GC-MS (sukkere og metabolitter). For lipid analyse pooling av 2-3 prøver (eksudat 30-45 blader) er anbefalt og fører til klarere resultater.

4. Påfølgende analyse (kun for video Vi viser 4,4)

  1. For proteinanalyse, resuspender prøven i 15 pl vann og 30 pl Lämmli buffer, varme til 95 ° C i 5 min, raskt spinne ned en hvilken som helst precipitates og laste hele utvalget på en SDS-PAGE gel (45 mL lasting lommer). Prøver bør være farget med kolloidalt Coomassie eller andre sensitive flekker siden protein overflod er svært lav.
  2. For sukker og liten metabolitt-analyse, tilsett derivatiseringsmiddel-midler på den tørkede prøven, som beskrevet i litteraturen 14.
  3. mRNA kan analyseres ved hjelp av RT-PCR, microarray eller RNA-Seq analyse.
  4. For lipid analyse umiddelbart basseng 2-3 prøver og skillevegger mot kloroform: metanol (1:1) i avtrekksskap som følger: tilsett samme mengde av kloroform: metanol til hver prøve, vortex i noen sekunder, og sentrifuger i 4 min ved 400 x g. Samle bunnen (organiske) fase i et glassrør med teflonkork og gjenta skillevegg med den øverste fase tre ganger til. Tørk de kombinerte organiske faser under en strøm av N2 og sender til videre analyse (tynnsjiktskromatografi: 14 TLC, 37; Væskekromatografi-Massespektrometri: LC MS-14).

Representative Results

Det har blitt klart i løpet av de siste årene at kompleksiteten i barken saft kan være svaret på spørsmålet om hvordan planter sende varierende utviklingsmessige og stress signaler for optimal respons. Ved hjelp av EDTA-tilrettelagt phloem exudation kan gi mulighet til å analysere phloem exudates fra planter som ikke er egnet for andre tilnærminger, men kan være av økonomisk eller fysiologisk interesse.

Denne metoden gjør det mulig for høsten på nok phloem exudates å identifisere phloem-lokaliserte proteiner og oppdage endringer i deres nivå som svar på utviklingen eller stress (figur 3). Som figuren viser, proteiner er i svært lav overflod, men likevel, er deres nivå høyt nok for de påfølgende proteomikk eksperimenter med LC-MS/MS eller for Western blot analyse. Funn i cucurbits antyder at kuttingen av stammen fører til en forstyrrelse av vann potensial balanse og en etterfølgende tilførsel av vann ogmulige forurensninger fra apoplast 41. Likevel samling for tiden fra én til åtte timer påvirker ikke phloem protein profil / komposisjon i Arabidopsis (. Bare den absolutte mengden varierer Guelette et al), mengden av protein innsamlet og mønsteret av proteiner som finnes varierer mellom arter (Arabidopsis: På; Perilla, lane I og NI) og behandlinger (Perilla vokst på forskjellige dag lengder, lane I og NI). Som et resultat proteinholdige signaler kan visualiseres, identifisert og fulgt.

mRNA og mikro RNAer kan også identifiseres i barken eksudater ved denne metoden. Imidlertid er behandling med RNase inhibitor nødvendig for å hindre degradering av mRNA'et i den forlengede svetteflate tid. Fordi silen elementene ikke inneholder funksjonelle kloroplaster, Rubisco liten eller stor subenhet (RBCs eller RbcL, henholdsvis) mRNAer kan benyttes som negative kontroller, mens kjent phloem-MRNA lokalisert like Ubiquitin-konjugering av enzymet kan bli brukt som en positiv kontroll (figur 4).

På samme måte kan sukkere eller små metabolitter analyseres enten ved hjelp av GC-MS eller LC-MS. Her bør det nevnes at barken eksudater inneholde en lang rekke funksjonelle enzymer, herunder nesten hele glykolysen 12.. Det kan således ved hjelp av flere tidspunkter avsløre metabolske prosesser i løpet av eksudat samling. Et eksempel er vist i figur 5: I alle eksudater, er sukrose den vanligste metabolitten, og dette er mest åpenbare etter en samling i 1 time. Men etter fem timer sukrose til fruktose forholdet er noe redusert. Hvis den samme eksudat samles i én time og igjen på benken for de neste fire timene, er sukrose til fruktose ratio redusert til en mye større grad, noe som tyder på at aktive enzymer i barken exudates føre til en degradering av sukrose ved romtemperaturtemperatur (for flere peak tolkninger se 14). Dette er konsistent med funn som phloem lasting og transport av molekyler fra følgesvenn celler i silen elementene kan fortsette under exudation til systemet mister sin vitalitet 34.

Lipider i barken exudates og, i forlengelsen av, langdistanse lipid signalering er en ganske nylig felt av interesse i anlegget vitenskap. På grunn av deres hydrofobe natur lipider er bare til stede i lave konsentrasjoner, og kan være bundet til andre molekyler for solubilisering. Likevel lar det EDTA-tilrettelagt eksudasjon for innsamling av tilstrekkelig materiale til å visualisere (TLC, Fig. 6) og identifisere (LC-MS, Fig. 7) phloem lipider fra flere plantearter. Som figuren viser er det mulig å identifisere og skille ut en rekke lipid-arter. LC-MS gjør det mulig å identifisere ulike lipid arter og for å overvåke endringer i lipid profiler av different genotyper eller behandlinger. Dette gjør det mulig for studiet av rollen lipider under plante utvikling og stress respons.

Figur 1
Figur 1. Flow diagram av samlingen av barken exudates av Arabidopsis eller Perilla. Ulike veier fører til ulike sluttprodukter, som er markert med blått. For fremstillingen av RNA, RNAse inhibitor (100 E / ml, Roche) blir tilsatt til vann som den i barken eksudat oppsamlet.
Klikk her for å se større bilde .

Figur 2
Figur 2. Oppsett av materialer for phloem eksudat samleion. Oppsettet viser alle materialer som trengs for protokollen trinn 03.01 til 03.04.
Klikk her for å se større bilde .

Figur 3
. Figur 3 proteiner som finnes i barken exudates av to forskjellige plantearter, Arabidopsis (På) og Perilla (jeg og NI; forskjellige dagen lengder), MW: molekylvekt markør (kjørefelt 2). Proteiner ble separert ved hjelp av en 10-20% gradient SDS-PAGE.
Klikk her for å se større bilde .

Figur 4
Figur 4. Analysisav tilstedeværelse av mRNA for Rubisco liten og stor subenhet (RBC-er og RbcL, henholdsvis) og ubiquitin-konjugering av enzym (UBC). mRNA ble samlet inn fra Arabidopsis blader (L), petioles (P), og barken exudates (Ph), reversere transkriberte og spesifikke transkripsjoner visualisert ved hjelp av PCR. Figuren ble endret fra Guelette et al. 14..
Klikk her for å se større bilde .

Figur 5
Figur 5. GC-MS profilen til phloem Exudates samlet for ulike antall ganger. Legg merke til hvordan den relative mengden av sukrose endringer fra 1 time samling (A) til 5 timer etter innsamling tid (B). Eksudat profil etter oppsamling i 1 time etterfulgt av "inkubasjon" på plass temperatur (RT) i fire timer (C). Blad metabolitt profil (D).
Klikk her for å se større bilde .

Figur 6
Figur 6. Thin-lags kromatogram sammenligne lipider fra Perilla (til venstre) og Arabidopsis (høyre) blader og barken exudates. Stjernene viser lipider spesifikke for phloem exudates. DGDG: digalactosyldiacylglycerol; PG: fosfatidylglycerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; Den delen av figuren viser Arabidopsis lipider har blitt forandret fra Guelette et al 14..
Klikk her for å se større bilde .

nt "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 7
Figur 7. Lipid profil av barken exudates av Arabidopsis (Kloroformfasen) ved hjelp av LC-MS / negativ ion modus. Grafer i toppen (mutant, A) og bunn (vill-type, B) viser forskjellene i lipidprofil mellom to ulike genotyper (markert med piler).
Klikk her for å se større bilde .

Discussion

EDTA-tilrettelagt samling av barken exudates er veldig enkel, krever minimal utstyr, og gjelder for de fleste planter. Totalt, utvider denne fremgangsmåte evnen til å analysere phloem eksudater fra flere arter. Skjønt den eksudat er fortynnet, er det lett å samle mange forskjellige prøver eller fra mange planter å skalere opp til en stor mengde materiale. Dette tillater deretter for påvisning av nye forbindelser som er i meget lav overflod og ville ellers bli oversett.

Denne metoden kan brukes til flere plantearter og fungerer som beskrevet for de som er nevnt i dette manuskriptet. Dersom nye arter er utforsket, de to aspekter som kanskje trenger modifisering er antall blader brukt og tidspunktet for exudation. I de fleste tilfeller bør fem til åtte timers utsvetting være egnet. For å bekrefte at bruken av denne metoden for en nye plantearter, må eksudat som skal samles inn og ett eller flere av de etterfølgende analyse som beskrevet i protokoll del 4 needs som skal utføres. Avhengig av intensiteten av signalet observert, kan oppsamlingsvolum trenger å bli oppskalert. Generelt vil lipid og protein analyse krever mer materiale enn sukker og metabolitt analyse siden det tidligere er mindre rikelig i barken exudates.

På grunn av at EDTA-tilrettelagt eksudat samling innebærer snitt-flatene, så vel som en potensielt skadelig virkning av EDTA, flere punkter må vurderes: (1) etter en times inkubasjon med EDTA, petioles må vaskes grundig. Dette fjerner eventuelle oppnådde forbindelser fra såret celler samt EDTA selv, som kan skade cellene eller forstyrre ekstraksjonen. (2) positive og negative kontroller må være med for å sikre at data innhentet er avledet fra barken og sevjen ikke fra skadede celler (se kritiske trinn under). (3) phloem saft faktisk inneholder flere enzymer, som kan være aktive under eksudat samling. Derfor, i noen tilfeller kan det være hensiktsmessig å samle for ulik tid. (4) Siden metoden er involvert eksudasjon i vann, er en absolutt kvantifisering av forbindelsene ikke er mulig.

Kritiske trinn: Nøkkelen til vellykket bruk av denne metoden er bruk av forsiktighet ved håndtering av prøven for å ikke skade noen celler samt bruk av hensiktsmessige kontroller (se ref. 14.). En passende styring er samlingen av barken eksudater uten forutgående behandling med EDTA. I dette tilfelle barken vil tette seg selv og uten eksudat kan samles opp. Eventuelle forurensende stoffer som kommer fra de sårede cellene vil bli oppdaget her. En andre kontroll ville være analyse av sukker i eksudatet. I Arabidopsis, bør sukrose være den dominerende metabolitten innenfor barken saft, med fruktose sukrose forhold på 01:04 til 01:08 (ref. 8, 14).

For RNA-ekstraksjon ved bruk av en RNAse-inhibitor er nødvendig. I tillegg er en positiv kontroll av tidligere described phloem-lokaliserte mRNA (UBC9: Ubiquitin Conjugating enzym 9, At4g27960, 8, 14) og en negativ kontroll med for eksempel en kloroplast mRNA (Rubisco LSU) er tilrådelig.

Fordi eksudat inneholder aktive enzymer, er et tidsforløp anbefales å sørge for at endringer i barken profil er ikke bare på grunn av variasjoner i gang samling. I noen tilfeller kan det være fordelaktig å bruke proteinaseinhibitorer. Men etterforskerne trenger å huske på, at de innsamlede eksudat vil bli konsentrert og at noen lagt forbindelser vil i hovedsak være konsentrert. Et annet kritisk punkt i protokollen er recutting av petiole henhold EDTA. Dette trinnet tjener et dobbelt formål: Først fjerner det noen forseglede sil plater mens hindre dannelsen av nye plugger og dermed gir for fri flyt av barken saft. Sekund, fjerner det kavitasjon boble i xylem generert mens kutte og dermed åpner for xylem transport. Størrelsen av det andre snitt avhenges på planter som brukes. I planter med større petioles bør det være flere millimeter (opp til 1 cm) over det første kuttet, i planter som Arabidopsis, 1-2 mm er tilstrekkelig.

Bruken av denne metode kan føre til oppdagelse av nye forbindelser i barken eksudater som kunne ha signalering, utviklings-eller biomedisinske implikasjoner. Det har ført til en mer inngående titt på langdistanse lipid signalering, som var en lite studert felt innen plantevitenskap på grunn av mangel på tilgang til barken.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation NSF-IOS stipend # 1144391 til SHB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K2-EDTA Sigma-Aldrich ED2P-500G  
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15cm) PYREX or Corning Any clean, shallow dish will work
Chloroform EMD CX1054-1 Only open containers in fume hood
Methanol J.T.Baker 9070-03  
Screw cap tubes VWR International 53283-800  
Screw cap tubes Sun Sri 13-425  
Eppendorf tubes Denville C2170  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balachandran, S., Xiang, Y., Schobert, C., Thompson, G. A., Lucas, W. J. Phloem sap proteins from Cucurbita maxima and Ricinus communis have the capacity to traffic cell to cell through plasmodesmata. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 14150-14158 (1997).
  2. Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Aston, P., Jones, A., Pritchard, J. Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry. J. Exp. Bot. 55, 1473-1481 (2004).
  3. Behmer, S. T., Grebenok, R. J., Douglas, A. E. Plant sterols and host plant suitability for a phloem feeding insect. Functional Ecology. (2010).
  4. Benning, U. F., Tamot, B., Guelette, B. S., Hoffmann-Benning, S. New aspects of phloem-mediated long-distance lipid signaling in plants. Front.Plant.Sci. 3, 53> (2012).
  5. Chen, S., Petersen, B. L., Olsen, C. E., Schulz, A., Halkier, B. A. Long-distance phloem transport of glucosinolates in Arabidopsis. PlantPhysiol. 127, 194-201 (2001).
  6. Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long distance signalling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316, 1030-1033 (2007).
  7. Dafoe, N. J., Gowen, B. E., &Constabel, C. P. Thaumatin-like proteins are differentially expressed and localized in phloem tissues of hybrid poplar.BMC. Plant Biology. 10, (2010).
  8. Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. The Plant Journal. 55, 746-759 (2008).
  9. Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements. J. Exp. Bot. 53, 631-637 (2002).
  10. Fisher, D. B., Wu, Y., Ku, M. S. B. Turnover of soluble-proteins in the wheat sieve tube. Plant Physiol. 100, 1433-1441 (1992).
  11. Gaupels, F., Buhtz, A., Knauer, T., Deshmukh, S., Waller, F., van Bel, A. J. E., Kogel, K. -H., Kehr, J. Adaptation of aphid stylectomy for analyses of proteins and mRNAs in barley phloem sap. J Exp Bot. 59, 3297-3306 (2008).
  12. Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. Towards the proteome of Brassica napus phloem sap. Proteomics. 6, 896-909 (2006).
  13. Guelette, B. S., Chamberlin, B., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Indications of lipids/lipid signaling in the phloem exudates of Arabidopsis thaliana and Perilla ocymoides. Benning, C., Ohlroggeeds, J. Proceedings of the 17th International Symposium of Plant, Michigan State University. Lansing, USA. 92-95 (2007).
  14. Guelette, B. S., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Identification of lipids and lipid-binding proteins in phloem exudates from Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 63, 3603-3616 (2012).
  15. Haebel, S., Kehr, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry peptide mass fingerprints and post source decay: a tool for the identification and analysis of phloem proteins from Cucurbita maxima Duch. separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Planta. 214, 3328 (2001).
  16. Hayashi, H., Fukuda, A., Suzui, N., Fujimaki, S. Proteins in the sieve element-companion cell complexes: their detection, localization and possible functions. Aust. J. Plant Physiol. 27, 489-496 (2000).
  17. Hoffmann-Benning, S., Gage, D. A., McIntosh, L., Kende, H., Zeevaart, J. A. D. Comparison of peptides in the phloem sap of flowering and non-flowering Perilla and lupine plants using microbore HPLC followed by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Planta. 216-2140 (2002).
  18. Jorgensen, R. A., Atkinson, R. G., Forster, R. L., Lucas, W. J. An RNA-Based Information Superhighway in Plants. Science. 6, 1486-1487 (1998).
  19. Kehr, J. Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects. J. Exp. Bot. 57, 767-774 (2006).
  20. King, R. W., Zeevaart, J. A. Enhancement of phloem exudation from cut petioles by chelating-agents. Plant Physiol. 53, 96-103 (1974).
  21. Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B., Lucas, W. J. Analysis of the pumpkin phloem proteome provides functional insights into angiosperm sieve tube function. Mol. Cell. Proteomics. 8, 343-356 (2009).
  22. Lough, T. J., Lucas, W. J. Integrative plant biology: role of phloem long-distance macromolecular trafficking. Annu.Rev. Plant Biol. 57, 203-232 (2006).
  23. Madey, E., Nowack, L. M., Thompson, J. E. Isolation and characterization of lipid in phloem sap of canola. Planta. 214, 625-634 (2002).
  24. Maeda, H., Song, W., Sage, T. L., DellaPenna, D. Tocopherols playa crucial role in low-temperature adaptation and phloem loading in Arabidopsis. The Plant Cell. 18, 2710-2732 (2006).
  25. Marentes, E., Grusak, M. A. Mass determination of low-molecular-weight proteins in phloem sap using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. J. Exp. Bot. 49, 903-911 (1998).
  26. Prado, E., Tjallingii, W. Behavioral evidence for local reduction of aphid-induced resistance. Journal ofInsect Science. 7, 48 (2007).
  27. Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants. Development. 126, 4405-4419 (1999).
  28. Ryabov, E. V., Robinson, D. J., Taliansky, M. E. A plant virus-encoded protein facilitates long-distance movement of heterologous viral RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1212-1217 (1999).
  29. Schilmiller, A. L., Howe, G. A. Systemic signaling in the wound response. Curr.Opin. Plant Biol. 8, 369-377 (2005).
  30. Thompson, G. A., Goggin, F. L. Transcriptomics and functional genomics of plant defence induction by phloem-feeding insects. J. Exp. Bot. 57, 755-766 (2006).
  31. Thorpe, M. R., Ferrieri, A. P., Herth, M. M., Ferrieri, R. A. (11)C-imaging: methyl jasmonate moves in both phloem and xylem, promotes transport of jasmonate, and of photoassimilate even after proton transport is decoupled. Planta. (11), 226-541 (2007).
  32. Truman, W., Bennett, M. H., Kubigsteltig, I., Turnbull, C., Grant, M. Arabidopsis systemic immunity uses conserved defense signaling pathways and is mediated by jasmonates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 1075-1080 (2007).
  33. van Bel, A. J. E., Knoblauch, M. Sieve element and companion cell: the story of the comatose patient and the hyperactive nurse. Aust. J. Plant Physiol. 27, 477-487 (2000).
  34. van Bel, A. J. E., Hess, P. H. Hexoses as phloem transport sugars: the end of a dogma. J. Exp. Bot. 59, 261-272 Forthcoming.
  35. Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes. Plant J. 31, 189-197 (2002).
  36. Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins. Phytochemistry. 65, 1795-1804 (2004).
  37. Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).
  38. Will, T., van Bel, A. J. E. Physical and chemical interactions between aphids and plants. J. Exp. Bot. 57, 729-737 (2006).
  39. Yoo, B. C., Kragler, F., Varkonyi-Gasic, E., Haywood, V., Archer-Evans, S., Lee, Y. M., Lough, T. J., Lucas, W. J. A systemic small RNA signaling system in plants. Plant Cell. 16, 1979-2000 (2004).
  40. Zhang, B., Tolstikov, V., Turnbull, C., Hicks, L. M., Fiehn, O. Divergent metabolome and proteome suggest functional independence of dual phloem transport systems in cucurbits. PNAS USA. 107, 13532-13537 (2010).
  41. Zhang, C., Yu, X., Ayre, B. G., Turgeon, R. The Origin and Composition of Cucurbit "Phloem" Exudate. Plant Physiology. 158, 1873-1882 (2012).
  42. Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. The Phloem-Delivered RNA Pool Contains Small Noncoding RNAs and Interferes with Translation. Plant Physiol. 150, 378-387 (2009).
Innsamling og analyse av<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Phloem Exudates Bruke EDTA-tilrettelagt metode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method. J. Vis. Exp. (80), e51111, doi:10.3791/51111 (2013).More

Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method. J. Vis. Exp. (80), e51111, doi:10.3791/51111 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter