Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Insamling och analys av Published: October 23, 2013 doi: 10.3791/51111
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State Universtiy

Summary

Kunskap om sammansättningen av floem sav samt mekanismen för dess lastning och långväga transporter är avgörande för förståelsen av långväga signalering i växtens utveckling och stress / patogen respons och assimilera transporter. Detta manuskript beskriver insamling av floem utsöndringar använder EDTA-underlättas metoden.

Abstract

Anläggningen phloem är viktigt för långväga transporter av (bild-) assimilerar samt av signaler förmedlar biotisk eller abiotisk stress. Den innehåller socker, aminosyror, proteiner, RNA, lipider och andra metaboliter. Medan det finns ett stort intresse för att förstå sammansättning och funktion av floem, den roll som många av dessa molekyler och därmed deras betydelse för växtens utveckling och stress har ännu inte fastställts. Ett hinder för floem analys ligger i det faktum att de floem förseglar sig själv vid såra. Som ett resultat, är det antal växter från vilka floem sav kan erhållas begränsad. En metod som möjliggör insamling av floem utsöndringar från flera växtarter utan tillsatt utrustningen är EDTA-underlättas phloem exsudat kollektion beskrivs här. Även om det är lätt att använda, leder det till såra av celler och försiktighet måste vidtas för att ta bort innehållet i skadade celler. Dessutom till flera kontroller bevisa renhet exsudatär nödvändiga. Eftersom det är en utsöndring snarare än en direkt samling av floem sav (inte möjligt i många arter) endast relativ kvantifiering av dess innehåll kan förekomma. Fördelen med denna metod framför andra är att det kan användas i många örtartade eller vedartade växtarter (Perilla, Arabidopsis, poppel, etc.) och kräver minimal utrustning och utbildning. Det leder till rimligt stora mängder utsöndringar som kan användas för efterföljande analys av proteiner, sockerarter, lipider, RNA, virus och metaboliter. Det är enkelt nog att den kan användas både i forskning och i en undervisning laboratorium.

Introduction

Växter kan inte flytta fly ogynnsamma förhållanden. Därför var de tvungna att utveckla mekanismer för att upptäcka miljöpåkänningar, framkalla och sända en relaterad signal i hela anläggningen, och justera utvecklingen därefter. Två transportsystem finns för distribution av vatten, näringsämnen och andra (signalering) föreningar. Den första är den xylem, som normalt transporterar vatten och mineraler tas upp av rötterna hela anläggningen. Den andra är floemet. Vyn floemet har ändrats från en enkel assimilera transportsystem till en ledning för RNA, protein, virus, lipider och andra små molekyler. Den spelar en viktig roll i assimilera och näringstransporten, respons mot biotisk och abiotisk stress, liksom i växtens tillväxt och utveckling. Det som nu kallas "digitala motorvägen" av anläggningen 18.

Den phloem består av flera celltyper: phloem levervävnad, samt specialiserade följeslagare ceLLS och sikt element. Sikten elementet är platsen för långväga rörelse. För att möjliggöra obehindrad längsgående flöde är såll element saknas flesta organeller samt kärnor och tros innehålla i bästa fall en begränsad translationell maskiner 21, 33. Man tror att följeslagare celler syntetisera proteiner och andra föreningar, som reser i floem strömmen. Dessa föreningar transporteras sedan in i sikten elementet via plasmodesmata och kan fungera som långväga signaler 4,16.

Flera grupper av föreningar kan återfinnas i floem utsöndringar:

  • Socker är ofta produkter av fotosyntes och transporteras som "energi-bär" molekyler till andra delar av anläggningen för lagring eller som byggstenar. De kan emellertid också fungera som frostskyddsmedel eller som signal-föreningar.
  • Proteiner kan också hittas i floem utsöndringar. De innefattar metaboliska enzymer, men också har signalfunktion. Ett exemle av ett protein som fungerar som en utvecklings-signal är Blommande locus T-protein, som signalerar induktion av blomning samt säsongsbetonad blad abscission i växter. sex
  • Nukleinsyror är närvarande i floem utsöndringar i form av mRNA, små och mycket små RNA, och virala RNA. De verkar vara i stort sett inblandad i signalering 27, 28, 39. Samtidigt, har rRNA och tRNA-sekvenser för nästan alla aminosyror observerats i floem sav gurkväxter 42. De verkar vara selektivt överförs till sikten rörsystemet. De tRNA visar ändringar som krävs för förmågan att överföra aminosyror till den translationella apparaturen. Men snarare än att delta i översättning, verkar de att hämma denna process. Alternativt kan de tjäna som en källa för cytokinin eller signalera metaboliska status av anläggningen 42.
  • Fettsyror, oxylipins och andra lipider har också påträffats i floem utsöndringar 3, 13, 14, 23. Jasmonic-syra, ett oxylipin rör sig genom floem som en del av svaret på patogeninfektion 22, 29, 31, 32. Medan den roll de flesta floem lipider är fortfarande oklart, en del av dem sannolikt har signalfunktion 4.

Utmaningen i att arbeta med växter phloem ligger i dess förmåga att täta sig vid sårskada. Det finns fyra stora metoder som används för att samla in floem utsöndringar, men de fungerar bara i utvalda arter:

1) I gurkväxter är det möjligt att erhålla rimliga mängder phloem exsudat genom nedskärningar av bladskaft. När den första droppe med kontaminering av skadade celler har tagits bort är det möjligt att erhålla rimligt stora mängder ren floem sap 1, 15. Men med ökande samling tid, denna exsudat tjocknar, vilket gör det allt olämpligt för vätskekromatografi tillvägagångssätt (opublicerad). Nya publikationer antyder, att beroende på art, är detta phloem SAP härstammar från either fascicular (FP) eller extrafascicular floem (EP) och att, medan det innehåller "mobil" floem sav från sikten elementen (FP), är det också benägna att kontaminering från andra celltyper, inklusive xylem 40, 41 .

2) Det andra alternativet är att skaffa phloem sap genom grunda nedskärningar eller punktering i stammen eller bladskaft. Denna metod har använts framgångsrikt i lupin 17, 25, 36 gurkväxter, och Brassica napus 12. Här förorening från skadade celler är minimal och utsöndringar mycket ren. Men växter behöver för att vara friska och väl vattnade eftersom det är mycket svårt att selektivt punktera bara sikten element. Om xylem fartyg trasiga all sårsekret dras in i xylem strömmen. Detta gör metoden olämplig för anläggningar med mycket ömtåliga eller starkt förvedade bladskaft eller stjälkar.

3) Bladlöss stylectomy tillåter bladlöss att sätta sin stilett i sikten elementen in avlägsna aphid med en laser. Floem sav exuded genom den återstående mandrängen 2, 9, 10, 35, 38. I teorin kan vilken som helst växt som kan infekteras av bladlöss användas för detta tillvägagångssätt. Men de flesta växthus eller tillväxt chefer kammare stöder inte användning av en patogen. Dessutom bladlöss introducera flera proteiner i floem med deras saliv 19, 33. Detta leder till en begränsad transkriptionell omprogrammering 30 och har potential att förändra floemet sammansättning 26.

4) Den metod som beskrivs här är EDTA-underlättas utsöndring av phloem sav. Denna metod använder EDTA för att förhindra tätning av floem 20. EDTA kelaterar Ca 2 + joner som annars skulle delta i processer som tätar floem. Även EDTA kan leda till cellskador 30, har flera grupper använt denna metod och observerades ingen negativ effekt av EDTA koncentrationer från 10 till 20 mm på cellens ultrastrukturen eller på phloem lastning och transport 5, 24. För att minska eventuella skadliga effekter samt störning av EDTA med kromatografi och gelelektrofores, är växter flyttade in vatten efter 1 h och endast den senare delen av exsudat används 14. Således, snarare än utsvettning i EDTA, är floem exudated i vatten (EDTA-underlättas utsvettning). Det är en rättfram, låg kostnad och låg-tech metod för insamling av floem utsöndringar. Floem sap erhållits på detta sätt kan användas för att analysera proteiner, små molekyler, lipider, och RNA och har använts framgångsrikt i många växter. Medan ett begränsat antal experiment har utförts i monokotyledoner 11 verkar denna metod att vara mer lämpade för dikotyledoner (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, Poppel 7). Insamling av utsöndringar måste ske i en fuktig miljö för att undvika förlust av utsöndringar genom transpiration. Beroende på växten, är inkubering i EDTA under en till två timmartillräcklig för att förhindra försegling av floem / sil element. Samlingen kan då uppstå i vatten. Detta har fördelen av att förhindra den negativa effekten EDTA har på cellstruktur och stabilitet. Det eliminerar också inblandning av EDTA med metoder som HPLC eller SDS-PAGE. Det visas eftersom det gäller Arabidopsis. För större anläggningar, har inkubation i EDTA och exsudat samlingar måste skalas upp och utförs i bägare istället i 1,7 ml provrör.

Protocol

Ett. Framställning av växter

  1. Arabidopsis frön kan gro direkt på marken eller på MS plattor. Odla växter för fyra till sex veckor i tillväxt kammare med en 12-hr fotoperiod (22 ° C dag, 15 ° C natt 14). Vattenväxter en till två gånger i veckan. Använd bottenbrickan för vattning, inte vattenväxter från toppen, låta facken torka innan åter vattning. Kontrollera växter är väl hydrerad vid tidpunkten för skörd.

2. Beredning av lösningar och rätter

  1. K 2-EDTA-lösning: Gör en 100 mM K 2-EDTA-lösning lösning lager, som kan förvaras i kylskåp. På dagen för insamling, späds lösningen 04:59 (en del EDTA-lösning, fyra delar vatten) för erhållande av en 20 mM K 2-EDTA-lösning.
  2. Fyll ett glas eller en petriskål (diameter 7-15 cm) halvvägs med 20 mM K 2-EDTA-lösning. Om provtagning från olika behandlingar (till exriklig kontroll och salt-stressutsatta plantor eller olika genotyper) förbereds separata rätter för varje behandling.
  3. Fyll önskat antal 1,7 tuber ml reaktionskärl med 1,4 ml 20 mM K 2-EDTA-lösning. Fyll lika många provrör med 1,4 ml autoklaveras avjoniserat eller Milliporevatten.
  4. Sätt pappershanddukar på bänken för att ställa växter på, få en ny rakblad och sätta på handskarna.

Tre. Insamling av floem Exsudat (Visat i flödesschemat i figur 1)

  1. Harvest bladrosetter fyra till sex veckor gamla anläggningar genom att skära dem med rakblad på basen av bladskaft nära centrum av rosetten.
  2. Placera omedelbart bladen i rätter innehållande 20 mM K 2-EDTA. Se till den avskurna änden av bladskaftets är nedsänkt i lösningen (Figur 2).
  3. När 15 blad har samlats (ca. 03:57 anläggningar), försiktigt stapla blad ovanpå varandra så thatt den skurna bladskaft är i linje med varandra. Fräs om basen av bladskaft (ca 1 mm) och omedelbart överföra bladen till ett av reaktionsrören med 20 mM K 2-EDTA-lösning. Bladen passar lättast om de är något rullas upp. Undvik att klämma bladen i eftersom detta kan orsaka skador på celler och därmed leder till insamling av löv cellens innehåll.
  4. Om mer material behövs, försiktigt täcka prover med en våt pappershandduk. Använd en ny uppsättning av rätter om för insamling av prover från olika behandlingar eller genotyper.
  5. När alla proverna är placerade i reaktionsrör, samla utsöndringarna antingen i mörker eller i ljuset.
  6. För provtagning i mörker, rad golvet i ett stort grunt skålen med våta pappershanddukar. Placera stället med blad fyllda provrör i skålen och något omslag med våta pappershanddukar eller sätta i en svart plast tillbaka med slitsar för luftning. Placera hela installationen i ett skåp eller ett mörkt rum.
  7. För insamling i ljuset, linje botten av en klar plexiglas behållare med våta pappershanddukar. Placera stället med blad fyllda reaktionsrör i behållaren och stäng det.
  8. Efter 1 timme, lämnar bort försiktigt från behållaren och rören reaktionsbetingelserna och tvätta noga med destillerat, avjoniserat eller Millipore vatten för att avlägsna alla EDTA. Detta steg tjänar tre ändamål: (1) det tar bort EDTA till minimeras skada på cellerna, (2) den eliminerar interferensen av EDTA med SDS-PAGE och kromatografi, och (3) tar bort alla föreningar som har ackumulerats från skär / skadad celler. Överför omedelbart in den förberedda reaktionsrören innehåller autoklaveras vatten och återgå till de fuktade insamlingscontainrar för insamling av utsöndringar. Vid denna punkt, tillsätt RNas-inhibitor om exsudatet behöver användas för RNA-extraktion. Valfritt: Proteinasinhibitor kan läggas till om proteinanalys önskas.
  9. Efter den planerade samlingen tid, dra ut och discard bladen och frysa floem utsöndringar i flytande N 2 för vidare användning. Om förlängd förvaring behövs, frystorka proverna och förvara vid -80 ° C.
  10. I fallet med Arabidopsis kan metaboliter redan detekteras efter samling av utsöndringar för 1 timme. Dock är kollektionen för 5-8 tim lämpligt om analys av mindre rikliga komponenter planeras. För större anläggningar som Perilla är längre hämtningstider (8 tim) rekommenderas.
    Exudat uppsamlas från 15 blad är typiskt tillräckligt för ett körfält på en SDS-PAGE-gel (proteiner), för mRNA-utvinning, GC-MS (sockerarter och metaboliter). För lipidanalys sammanslagning av 2-3 prover (exsudat 30-45 blad) rekommenderas och leder till tydligare resultat.

4. Efterföljande analys (Video Vi visar bara 4,4)

  1. För proteinanalys, återsuspendera provet i 15 | il vatten och 30 ^ il Lämmli buffert, upphetta till 95 ° C under 5 min, snabbt spinn ner någon precipitates och ladda hela provet på en SDS-PAGE-gel (45 ^ lastning fickor). Prover bör färgas med kolloidalt Coomassie eller andra känsliga fläckar eftersom protein överflöd är mycket låg.
  2. För socker och små metabolitanalys, tillsätt Derivatiserande medel till det torkade provet som beskrivs i litteraturen 14.
  3. mRNA kan analyseras med hjälp av RT-PCR, microarray eller RNA-Seq-analys.
  4. För lipidanalys omedelbart pool 02:58 prover och partitionera mot kloroform: metanol (1:1) i dragskåp enligt följande: tillsätt en lika stor mängd kloroform: metanol till varje prov, virvel i några sekunder och centrifugera i 4 min vid 400 x g. Samla botten (organiska) fasen i ett glasrör med teflonhatt och upprepa partitionen med den övre fasen ytterligare tre gånger. Torka de kombinerade organiska faserna under en ström av N2 och underkasta sig vidare analys (Tunnskiktskromatografi: TLC 14, 37; Vätskekromatografi-Masspektrometri: LC-MS 14).

Representative Results

Det har blivit uppenbart under de senaste åren att det komplicerade floem sav kan vara svaret på frågan om hur växter skickar varierande utvecklings och stress signaler för optimal respons. Använda EDTA-underlättat phloem exudation kan ge möjlighet att analysera floem utsöndringar från växter som inte är lämpliga för andra metoder, men kan vara av ekonomiskt eller fysiologisk intresse.

Denna metod gör det möjligt för skörd av tillräcklig phloem utsöndringar att identifiera floemet-lokaliserade proteiner och upptäcka förändringar i deras svar på utveckling eller stress (Figur 3). Som framgår av figuren, proteiner i mycket begränsad omfattning, men ändå, är deras nivå är tillräckligt hög för senare proteomik experiment med LC-MS/MS eller för Western blot-analys. Fynd i gurkväxter antyder att avskärningen av skaftet leder till en störning av den vattenpotentialen balans och en efterföljande inflöde av vatten ocheventuella föroreningar från apoplasten 41. Ändå kollektion för tider från ett till åtta timmar påverkar inte floem proteinprofilen / komposition i Arabidopsis (. Endast det absoluta beloppet varierar Guelette et al), mängden protein samlas och mönstret hittade proteiner varierar mellan arter (Arabidopsis: Vid, Perilla, lane I och NI) och behandlingar (Perilla odlas vid olika dag längder, lane I och NI). Som ett resultat proteinaktiga signaler kan visualiseras, identifieras och följas.

mRNA och mikro RNA kan också identifieras i floem utsöndringar genom denna metod. Emellertid är behandling med RNAse inhibitor nödvändig för att förhindra nedbrytning av mRNA under den förlängda utsvettning tid. Eftersom sikten element inte innehålla funktionella kloroplasterna, Rubisco liten eller stor subenhet (RBC eller RbCl, respektive) mRNA kan användas som negativa kontroller, medan känd floem-Lokaliserad mRNA som Ubiquitin-konjugerande enzym kan användas som en positiv kontroll (figur 4).

På liknande sätt kan socker eller små metaboliter analyseras med användning av antingen GC-MS eller LC-MS. Här bör det nämnas att de floem utsöndringar innehåller ett stort antal funktionella enzymer, inklusive nästan hela glykolytiska vägen 12. Därför kan användning av flera tidpunkter avslöja metaboliska processer under exsudat samlingen. Ett exempel visas i Figur 5: I samtliga utsöndringar, är sackaros den mest förekommande metaboliten, Detta är mest uppenbart efter en insamling till en timme. Men efter fem timmar sackaros till fruktos är något reducerad. Om samma exsudat samlas i en timme och kvar på bänken under de kommande fyra timmar, är sackaros till fruktos reduceras till en mycket större utsträckning, vilket tyder på att aktiva enzymer i floem utsöndringar lett till en försämring av sackaros vid rumstemtemperatur (för mer topp tolkningar se 14). Detta stämmer överens med fynd som phloem lastning och transport av molekyler från följeslagare celler i sikten elementen kan fortsätta under utsöndring tills systemet förlorar sin vitalitet 34.

Lipider i floem utsöndringar och, i förlängningen, långväga lipid-signalering är en relativt ny intresseområde inom växtforskningen. På grund av deras hydrofoba natur lipider är bara närvarande i låga koncentrationer och kan vara bunden till andra molekyler för solubilisering. Ändå tillåter EDTA-underlättas utsvettning för insamling av tillräckligt material för att visualisera (TLC, Figur 6) och identifiera (LC-MS, Figur 7) floem lipider från flera växtarter. Som figuren visar att det är möjligt att identifiera och separera flera lipid arter. LC-MS tillåter att identifiera olika lipid arter och följa förändringar inom lipid profiler different genotyper eller behandlingar. Detta gör det möjligt att studera rollen av lipider under anläggningens utveckling och stress.

Figur 1
Figur 1. Flödesschema för insamling av floem utsöndringar av Arabidopsis eller Perilla. Olika vägar leder till olika slutprodukter, som anges i blått. För beredning av RNA, RNAs-inhibitor (100 E / ml, Roche) tillsätts till vattnet i vilket floem exsudatet uppsamlas.
Klicka här för att se större bild .

Figur 2
Figur 2. Inställning av material för phloem exsudat samlajon. Installationsprogrammet visar alla material som behövs för protokollsteg 3,1-3,4.
Klicka här för att se större bild .

Figur 3
. Figur 3 Proteiner som finns i floem utsöndringar av två olika växtarter, Arabidopsis (At) och Perilla (I och NI, olika dag längder), MW: molekylviktsmarkör (spår 2). Proteiner separerades med användning av en 10-20% gradient SDS-PAGE.
Klicka här för att se större bild .

Figur 4
Figur 4. Analysav närvaron av mRNA för Rubisco lilla och stora subenheten (RBCs och RbCl, respektive) och ubikitin-konjugerande enzym (UBC). mRNA uppsamlades från Arabidopsis blad (L), bladskaft (P), och floem exudat (Ph), transkriberades omvänt och specifika transkript visualiseras med användning av PCR. Siffran ändrades från Guelette et al. 14.
Klicka här för att se större bild .

Figur 5
Figur 5. GC-MS profil phloem utsöndringar samlas för olika mängd gånger. Notera hur den relativa mängden av sackaros förändringar från 1 timme samling (A) till 5 timmar efter provtagning tid (B). Sårsekret profil efter kollektion för 1 timme följt av "inkubation" på rummet temperatur (RT) under fyra timmar (C). Leaf metabolit profil (D).
Klicka här för att se större bild .

Figur 6
Figur 6. Tunnskiktsplattor kromatogram jämföra lipider från Perilla (vänster) och Arabidopsis (höger) blad och utsöndringar floem. Asterisker indikerar lipider specifika för floem utsöndringar. DGDG: digalaktosyldiacylglycerol, PG: fosfatidylglycerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; Den delen av figuren visar Arabidopsis lipider har ändrats från Guelette et al 14..
Klicka här för att se större bild .

nt "fo: keep-together.within-sida =" alltid "> Figur 7
Figur 7. Lipid profil floem utsöndringar av Arabidopsis (kloroformfas) med LC-MS / negativ jon-läge. Grafer i toppen (mutant, A) och botten (vildtyp, B) visar skillnaderna i lipidprofiler mellan två olika genotyper (anges med pilar).
Klicka här för att se större bild .

Discussion

Den EDTA-underlättade samling phloem utsöndringar är mycket enkel, kräver minimal utrustning, och är tillämplig på de flesta växter. Totalt sträcker sig denna metod förmågan att analysera floem utsöndringar från att fler arter. Även exsudatet späds, är det enkelt att samla många olika prover eller från många växter att skala upp till en stor mängd material. Detta möjliggör sedan för detektion av nya föreningar som är i mycket begränsad omfattning och annars skulle förbises.

Denna metod kan användas för flera växtarter och fungerar såsom beskrivits för de som förtecknas i detta manuskript. Om nya arter utforskas, de två aspekter som kan behöva ändras är antalet använda löv och tiden för utsöndring. I de flesta fall bör en 07:55 timmars exudation vara lämpliga. För att bekräfta användningen av denna metod för en ny växtart måste exsudat som skall samlas in och en eller flera av den följande analysen som beskrivs i protokoll del 4 nEEDS som skall utföras. Beroende på intensiteten av den observerade signalen kan uppsamlingsvolymen måste skalas upp. I allmänhet kommer lipid och proteinanalys kräver mer material än socker och metabolitanalys eftersom den förstnämnda är mindre rikligt förekommande i floem utsöndringar.

Eftersom EDTA-underlättat exsudat kollektion innebär snittytor samt en potentiellt skadlig effekt av EDTA, flera punkter måste beaktas: (1) efter en timmes inkubering med EDTA, bladskaft måste tvättas noggrant. Detta tar bort alla föreningar, erhållen från skadade celler liksom EDTA själv, vilket kan skada celler eller störa utvinning. (2) Positiva och negativa kontroller måste ingå för att säkerställa erhållna data härrör från phloem sav och inte från skadade celler (se kritiska stegen nedan). (3) phloem SAP gör innehåller flera enzymer, vilket skulle kunna vara aktiva under exsudat samling. Följaktligen, i vissa fall kan det vara användbart att samla for olika lång tid. (4) Eftersom metoden involverade exsudation i vatten, är en absolut kvantifiering av föreningarna inte möjlig.

Kritiska steg: Nyckeln till framgångsrik användning av denna metod är att använda försiktighet vid hantering av provet för att inte skada några celler samt användning av lämpliga kontroller (se ref 14.). En lämplig kontroll är den samling av floem utsöndringar utan tidigare behandling med EDTA. I detta fall floem kommer att försegla sig själv och ingen exsudat kan uppsamlas. Eventuella kontaminerande föreningar som kommer från de sårade cellerna kommer att upptäckas här. En andra kontroll skulle vara analys av socker i exsudat. I Arabidopsis, bör sackaros vara den dominerande metaboliten inom floem sav, med fruktos till sackaros förhållande av 1:04 till 1:08 (ref 8, 14).

För RNA-extraktion användning av en RNas inhibitor är nödvändigt. Dessutom, en positiv kontroll av tidigare som beskrivered floem-lokaliserad mRNA (UBC9: ubikvitinkonjugerande enzym 9, At4g27960, 8, 14) och en negativ kontroll av exempelvis en kloroplast-mRNA (Rubisco LSU) är att rekommendera.

Eftersom exsudat innehåller aktiva enzymer, är ett tidsförlopp uppmanas att se förändringar i floem profilen är inte bara på grund av variationer i samlingen tiden. I vissa fall kan det vara fördelaktigt att använda proteinasinhibitorer. Men utredarna måste ha i åtanke att den insamlade exsudat ska vara koncentrerad och att eventuella tillsatta föreningar kommer att till stor del koncentrerad. Ett andra viktigt steg i protokollet är recutting av bladskaftets enligt EDTA. Detta steg tjänar ett dubbelt syfte: det första, det tar bort alla förseglade silplattor samtidigt förhindra bildandet av nya pluggar vilket möjliggör fritt flöde av floem sav. Det andra, det tar bort den kavitationsbubbla i genererade xylem medan skärning och därmed möjliggör xylem transport. Storleken på det andra snittet beros på de använda växterna. I anläggningar med större bladskaft det borde vara flera millimeter (upp till 1 cm) ovanför den första snittet, i växter som Arabidopsis, 1-2 mm är tillräckliga.

Användningen av denna metod kan leda till upptäckten av nya föreningar i floem utsöndringar som kunde ha signalering, utvecklingsmässiga eller biomedicinsk konsekvenser. Det har föranlett en mer ingående titt på långväga lipid signalering, som var lite studerade fält inom vetenskap växt på grund av bristande tillgång till floemet.

Disclosures

Vi har inget att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Science Foundation NSF-IOS bevilja # 1144391 till SHB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K2-EDTA Sigma-Aldrich ED2P-500G  
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15cm) PYREX or Corning Any clean, shallow dish will work
Chloroform EMD CX1054-1 Only open containers in fume hood
Methanol J.T.Baker 9070-03  
Screw cap tubes VWR International 53283-800  
Screw cap tubes Sun Sri 13-425  
Eppendorf tubes Denville C2170  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balachandran, S., Xiang, Y., Schobert, C., Thompson, G. A., Lucas, W. J. Phloem sap proteins from Cucurbita maxima and Ricinus communis have the capacity to traffic cell to cell through plasmodesmata. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 14150-14158 (1997).
  2. Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Aston, P., Jones, A., Pritchard, J. Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry. J. Exp. Bot. 55, 1473-1481 (2004).
  3. Behmer, S. T., Grebenok, R. J., Douglas, A. E. Plant sterols and host plant suitability for a phloem feeding insect. Functional Ecology. , (2010).
  4. Benning, U. F., Tamot, B., Guelette, B. S., Hoffmann-Benning, S. New aspects of phloem-mediated long-distance lipid signaling in plants. Front.Plant.Sci. 3, 53> (2012).
  5. Chen, S., Petersen, B. L., Olsen, C. E., Schulz, A., Halkier, B. A. Long-distance phloem transport of glucosinolates in Arabidopsis. PlantPhysiol. 127, 194-201 (2001).
  6. Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long distance signalling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316, 1030-1033 (2007).
  7. Dafoe, N. J., Gowen, B. E., &Constabel, C. P. Thaumatin-like proteins are differentially expressed and localized in phloem tissues of hybrid poplar.BMC. Plant Biology. 10, (2010).
  8. Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. The Plant Journal. 55, 746-759 (2008).
  9. Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements. J. Exp. Bot. 53, 631-637 (2002).
  10. Fisher, D. B., Wu, Y., Ku, M. S. B. Turnover of soluble-proteins in the wheat sieve tube. Plant Physiol. 100, 1433-1441 (1992).
  11. Gaupels, F., Buhtz, A., Knauer, T., Deshmukh, S., Waller, F., van Bel, A. J. E., Kogel, K. -H., Kehr, J. Adaptation of aphid stylectomy for analyses of proteins and mRNAs in barley phloem sap. J Exp Bot. 59, 3297-3306 (2008).
  12. Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. Towards the proteome of Brassica napus phloem sap. Proteomics. 6, 896-909 (2006).
  13. Guelette, B. S., Chamberlin, B., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Indications of lipids/lipid signaling in the phloem exudates of Arabidopsis thaliana and Perilla ocymoides. Benning, C., Ohlroggeeds, J. Proceedings of the 17th International Symposium of Plant, , Michigan State University. Lansing, USA. 92-95 (2007).
  14. Guelette, B. S., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Identification of lipids and lipid-binding proteins in phloem exudates from Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 63, 3603-3616 (2012).
  15. Haebel, S., Kehr, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry peptide mass fingerprints and post source decay: a tool for the identification and analysis of phloem proteins from Cucurbita maxima Duch. separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Planta. 214, 3328 (2001).
  16. Hayashi, H., Fukuda, A., Suzui, N., Fujimaki, S. Proteins in the sieve element-companion cell complexes: their detection, localization and possible functions. Aust. J. Plant Physiol. 27, 489-496 (2000).
  17. Hoffmann-Benning, S., Gage, D. A., McIntosh, L., Kende, H., Zeevaart, J. A. D. Comparison of peptides in the phloem sap of flowering and non-flowering Perilla and lupine plants using microbore HPLC followed by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Planta. , 216-2140 (2002).
  18. Jorgensen, R. A., Atkinson, R. G., Forster, R. L., Lucas, W. J. An RNA-Based Information Superhighway in Plants. Science. 6, 1486-1487 (1998).
  19. Kehr, J. Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects. J. Exp. Bot. 57, 767-774 (2006).
  20. King, R. W., Zeevaart, J. A. Enhancement of phloem exudation from cut petioles by chelating-agents. Plant Physiol. 53, 96-103 (1974).
  21. Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B., Lucas, W. J. Analysis of the pumpkin phloem proteome provides functional insights into angiosperm sieve tube function. Mol. Cell. Proteomics. 8, 343-356 (2009).
  22. Lough, T. J., Lucas, W. J. Integrative plant biology: role of phloem long-distance macromolecular trafficking. Annu.Rev. Plant Biol. 57, 203-232 (2006).
  23. Madey, E., Nowack, L. M., Thompson, J. E. Isolation and characterization of lipid in phloem sap of canola. Planta. 214, 625-634 (2002).
  24. Maeda, H., Song, W., Sage, T. L., DellaPenna, D. Tocopherols playa crucial role in low-temperature adaptation and phloem loading in Arabidopsis. The Plant Cell. 18, 2710-2732 (2006).
  25. Marentes, E., Grusak, M. A. Mass determination of low-molecular-weight proteins in phloem sap using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. J. Exp. Bot. 49, 903-911 (1998).
  26. Prado, E., Tjallingii, W. Behavioral evidence for local reduction of aphid-induced resistance. Journal ofInsect Science. 7, 48 (2007).
  27. Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants. Development. 126, 4405-4419 (1999).
  28. Ryabov, E. V., Robinson, D. J., Taliansky, M. E. A plant virus-encoded protein facilitates long-distance movement of heterologous viral RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1212-1217 (1999).
  29. Schilmiller, A. L., Howe, G. A. Systemic signaling in the wound response. Curr.Opin. Plant Biol. 8, 369-377 (2005).
  30. Thompson, G. A., Goggin, F. L. Transcriptomics and functional genomics of plant defence induction by phloem-feeding insects. J. Exp. Bot. 57, 755-766 (2006).
  31. Thorpe, M. R., Ferrieri, A. P., Herth, M. M., Ferrieri, R. A. (11)C-imaging: methyl jasmonate moves in both phloem and xylem, promotes transport of jasmonate, and of photoassimilate even after proton transport is decoupled. Planta. (11), 226-541 (2007).
  32. Truman, W., Bennett, M. H., Kubigsteltig, I., Turnbull, C., Grant, M. Arabidopsis systemic immunity uses conserved defense signaling pathways and is mediated by jasmonates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 1075-1080 (2007).
  33. van Bel, A. J. E., Knoblauch, M. Sieve element and companion cell: the story of the comatose patient and the hyperactive nurse. Aust. J. Plant Physiol. 27, 477-487 (2000).
  34. van Bel, A. J. E., Hess, P. H. Hexoses as phloem transport sugars: the end of a dogma. J. Exp. Bot. 59, 261-272 Forthcoming.
  35. Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes. Plant J. 31, 189-197 (2002).
  36. Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins. Phytochemistry. 65, 1795-1804 (2004).
  37. Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).
  38. Will, T., van Bel, A. J. E. Physical and chemical interactions between aphids and plants. J. Exp. Bot. 57, 729-737 (2006).
  39. Yoo, B. C., Kragler, F., Varkonyi-Gasic, E., Haywood, V., Archer-Evans, S., Lee, Y. M., Lough, T. J., Lucas, W. J. A systemic small RNA signaling system in plants. Plant Cell. 16, 1979-2000 (2004).
  40. Zhang, B., Tolstikov, V., Turnbull, C., Hicks, L. M., Fiehn, O. Divergent metabolome and proteome suggest functional independence of dual phloem transport systems in cucurbits. PNAS USA. 107, 13532-13537 (2010).
  41. Zhang, C., Yu, X., Ayre, B. G., Turgeon, R. The Origin and Composition of Cucurbit "Phloem" Exudate. Plant Physiology. 158, 1873-1882 (2012).
  42. Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. The Phloem-Delivered RNA Pool Contains Small Noncoding RNAs and Interferes with Translation. Plant Physiol. 150, 378-387 (2009).

Tags

Växtbiologi växt långväga transporter långväga signalering phloem phloem exsudat samling assimilera transport protein RNA lipider
Insamling och analys av<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Phloem utsöndringar Använda EDTA-underlättas Metod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tetyuk, O., Benning, U. F.,… More

Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method. J. Vis. Exp. (80), e51111, doi:10.3791/51111 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter