Summary
Qui si descrive un modo per esprimere antigeni di superficie del virus dell'influenza piegati correttamente e funzionali derivati dal romanzo virus H7N9 cinese in cellule di insetto. La tecnica può essere adattata per esprimere ectodomains di eventuali proteine di superficie virali o cellulari.
Abstract
Il sistema di espressione baculovirus è un potente strumento per l'espressione di proteine ricombinanti. Qui usiamo per produrre versioni piegati correttamente e glicosilata del virus dell'influenza A glicoproteine di superficie del virus - l'emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA). Come esempio, abbiamo scelto le proteine HA e NA espresse dal virus H7N9 romanzo che recentemente emersa in Cina. Tuttavia il protocollo può essere facilmente adattato per HA e NA proteine espresse da qualsiasi altra influenza A e B ceppi virali. Proteine ricombinanti HA (umana ricombinante) e NA (RNA) sono reagenti importanti per saggi immunologici quali ELISPOT e ELISA, e sono in largo uso per il vaccino contro la standardizzazione, la scoperta di anticorpi, isolamento e caratterizzazione. Inoltre, molecole NA ricombinanti possono essere utilizzate per lo screening di piccole molecole inibitrici e sono utili per la caratterizzazione della funzione enzimatica della NA, così come la sua sensibilità ai farmaci antivirali. Proteine HA ricombinanti sono anche being testato come vaccini sperimentali in modelli animali, e un vaccino ricombinante basato su HA è stato recentemente autorizzato dalla FDA per l'uso nell'uomo. Il metodo che descriviamo qui di produrre queste molecole è semplice e può facilitare la ricerca in laboratori influenza, in quanto consente la produzione di grandi quantità di proteine veloci ea basso costo. Anche qui ci concentriamo su glicoproteine di superficie del virus dell'influenza, questo metodo può anche essere usato per produrre altre proteine di superficie virali e cellulari.
Introduction
Come prima risposta alla recente nascita del romanzo H7N9 dell'influenza ceppo del virus in Cina, abbiamo acquisito plasmidi che trasportano le sequenze genomiche per l'emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA) geni dei primi due isolati. L'utilizzo di questi plasmidi siamo stati in grado di costruire rapidamente vettori di espressione baculovirali per la produzione di ricombinanti HA e NA in cellule di insetto. Questo sistema di espressione è ben consolidata nel nostro laboratorio e si è dimostrato fondamentale per molti dei nostri progetti di ricerca in corso 1-8. Cellule di insetto sono in grado di piegare correttamente e post-traduzionale modificare proteine complesse. Queste modifiche comprendono glicosilazione N-linked, che è importante per molte glicoproteine virali. Come tale, non è sorprendente che il sistema baculovirus è abbastanza stabilito per esprimere antigeni di superficie del virus dell'influenza. In realtà, molte delle strutture cristalline HA e NA sono stati risolti utilizzando cellule espresso proteine insetti 9-11. Un altro vantaggio delsistema risiede nella sua affidabilità rendimenti ad alto contenuto proteico fino a 30 mg di coltura cellulare HA / L (sulla base della nostra esperienza con oltre 50 diverse proteine HA) - una conseguenza del virus-infezione espressione guidato dal promotore forte poliedrina.
La rimozione del transmembrana e endodomain delle proteine HA e NA permette a manifestare versioni secretable, solubili delle proteine e quindi facilita notevolmente il processo di purificazione. Inoltre, questi ectodomains sono hexahistidine marchiato e possono quindi essere purificati mediante cromatografia per affinità utilizzando Ni 2 +-resina. I domini transmembrana di proteine HA e NA contribuiscono omotrimero e formazione omotetramero rispettivamente. Per preservare questi oligomerizations, si aggiunge un dominio trimerizzazione C-terminale al HA-, e un dominio di tetramerizzazione N-terminale al NA costrutti (Figura 1). Abbiamo dimostrato in modo conclusivo che tale dominio trimerizzazione stabilizza funzionale, conserved epitopi conformazionali sul gambo dominio di HA 1. La corretta tetramerizzazione della NA potrebbe anche contribuire a correggere la piegatura e la funzione NA 10. Sequenze e vettori Baculo trasferimento ospitano domini trimerizzazione o tetramerizzazione possono essere richiesti da parte degli autori o da altri laboratori del settore, 9,10,12.
Un altro aspetto importante per l'espressione di proteine secrete in cellule di insetto è la scelta della linea cellulare di destra. Mentre Spodoptera frugiperda derivato cellule Sf9 supportano la replica baculovirus molto bene e sono generalmente utilizzati per il salvataggio e la propagazione del virus, hanno limitato la capacità di secernere grandi quantità di proteine. Trichoplusia ni derivato BTI-TN-5B1-4 celle (comunemente noto come High Five) avere una maggiore capacità di secrezione e sono la linea cellulare di scelta per l'espressione in questo protocollo 13,14. Inoltre, è utile per ridurre o addirittura eliminare siero fetale bovino (FBS) dalle culture di espressione. Usiamo quindi media con ridotta (3%) Contenuto FBS per la crescita degli stock di lavoro di virus, e noi eseguiamo l'espressione della proteina nel siero media liberi.
Proteine HA e NA ricombinanti sono utilizzati per vari tecniche immunologiche. Forse il più comune è in saggi ELISA per misurare la conversione del siero su di vaccinazione in esseri umani o animali 4,6,7,15. Ha e AN sono utilizzati anche in saggi ELISPOT come entrambe le molecole stimolatorie e reagenti di rilevamento per anticorpi cellule che secernono 16. Il loro impiego come esche molecolari permette di ordinare specificamente per plasmablasts o altri tipi di cellule B che possono poi essere utilizzati per isolare (terapeutici) anticorpi monoclonali (mAb). Molecole di HA e NA ricombinanti sono ulteriormente utilizzati nella caratterizzazione di questi anticorpi monoclonali 8. Altri esempi includono lo studio della stabilità del pH o della specificità del recettore di ha espresso da diversi isolati di virus, o quantitativamente valutazione specifica enzimatica NAattività o resistenza agli inibitori. Inoltre, ricombinante, HA purificato può essere utilizzato per standardizzare il contenuto di HA di vaccini a virus influenzali inattivati.
Importante, umana ricombinante (e in una certa misura NA) candidati vaccini sono attualmente in fase di sperimentazione in modelli animali e studi clinici con un vaccino candidato di essere autorizzato dalla FDA nel 2013 2,17-19. Il vantaggio di questi nuovi vaccini è che, a causa della natura ricombinante di queste proteine, il processo laborioso di generazione di virus reassortant alta crescita potrebbe essere evitato. Forse ancora più rilevante è il fatto che il loro rendimento HA è elevata e riproducibile da ceppo a ceppo. Inoltre, poiché questi vaccini sono prodotti in un sistema privo di uovo, non contengono contaminanti proteici che sono problematici per le persone con allergie uovo.
Qui abbiamo scelto di esprimere le proteine HA e NA da due isolati del virus dell'influenza romanzo cinese H7N9, A / Anhui/1/13 e A/Shanghai/1/13 20,21. Questi sono esempi tempestivi, ma il protocollo descritto può essere utilizzato per l'espressione di qualsiasi influenza A e B proteine HA o NA e possono essere adattati per esprimere eventuali altre proteine virali o cellulari secrete. Proteine transmembrana trimeric o tetramerici possono essere clonati in cassette di espressione utilizzati per HA e NA, rispettivamente. Tuttavia, proteine cellulari secrete più solubili, come interferoni per esempio, non hanno bisogno di un dominio aggiuntivo per la stabilizzazione e possono essere espressi solo con un tag hexahistidine C-terminale.
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Protocol
1. Generazione di ricombinante Baculovirus
- Clonazione in baculovirus trasferimento-plasmidi
- Clone H7 HA e NA ectodomain N9 (o qualsiasi altro gene HA o NA) nella modificate trasferimento plasmidi pFastBac (vedi introduzione). Vettori per HA contenente un dominio trimerizzazione C-terminale e un tag hexahistidine, nonché per NA contenente un dominio di tetramerizzazione N-terminale e tag hexahistidine, sono stati descritti 1,10,11,22 (Figura 1) e possono essere richieste gli autori.
Nota esplicativa: ectodomains HA espresse senza un dominio trimerizzazione saranno piegate in modo errato, con conseguente perdita di epitopi neutralizzanti conformazionali, soprattutto nel settore gambo. Analogamente, la funzione enzimatica NA basa su una corretta tetramerization. - Generazione di bacmids
Trasforma il trasferimento-plasmidi baculovirus contenenti HA e NA geni nei batteri DH10Bac secondo utilizzando un'espressione baculovirusil sistema secondo le istruzioni del produttore. Isolare e purificare bacmids utilizzando un kit Midiprep secondo le istruzioni del produttore (Figura 2).
- Clone H7 HA e NA ectodomain N9 (o qualsiasi altro gene HA o NA) nella modificate trasferimento plasmidi pFastBac (vedi introduzione). Vettori per HA contenente un dominio trimerizzazione C-terminale e un tag hexahistidine, nonché per NA contenente un dominio di tetramerizzazione N-terminale e tag hexahistidine, sono stati descritti 1,10,11,22 (Figura 1) e possono essere richieste gli autori.
- Salvataggio di baculovirus ricombinante e verifica dell'espressione della proteina
Nota esplicativa: Le seguenti operazioni devono essere eseguite in modo asettico in una cappa a flusso laminare. Eseguire questa procedura indipendente per HA e NA (o qualsiasi altro gene di interesse). Cellule di insetto di solito sono coltivate a 28 ° C senza CO 2. Cellule Sf9 di questo protocollo sono coltivate in mezzi cellule di insetto pieno TNM-FH supplementato con 10% FBS, 1% Pen-Strep * e 0,1% soluzione F68 Pluronic, se non diversamente indicato, e diversi passaggi 01:04 due volte a settimana. High Five cellule sono coltivate in mezzi siero libero SFX e diversi passaggi 01:15 due volte a settimana.
* Aggiunta di antibiotici dovrebbe essere considerato facoltativo per tutto il protocollo e regolata secondo le pratiche utilizzate in ogni laboratorio.- Piatto cellule di insetto Sf9 in piastre da 6 pozzetti ad una densità di 2 x 10 5 cellule / cm 2 e lasciate riposare per 20 minuti in un incubatore a 28 ° C (senza CO 2).
- Mescolare 2 mg (conc. 0,5-2 mg / ul) di bacmid ricombinante con 100 ml di TNM-FH medio (siero gratuito, 1% Pen-Strep). Mescolare 6 ml di agente di trasfezione con 100 ml di TNM-FH medio (siero libero, Pen-Strep). Unire i due volumi, mescolare delicatamente e lasciate riposare per 20 minuti a temperatura ambiente (miscela di trasfezione). Includere un mock-trasfezione il controllo (Figura 3).
- Rimuovere il surnatante dalle cellule Sf9 placcato (cellule verranno ora aderire alla piastra) e sostituirli con 2 ml di siero libero medio TNM-FH contenenti Pen-Strep (1%). Aggiungere il volume totale della miscela di trasfezione (dal punto 1.2.2) e rock del 6 pozzetti accuratamente per 5 sec. Incubare in un incubatore a 28 ° C senza CO 2 per 6 ore (Figura 3).
- Sostituire il supporto with mezzi freschi TNM-FH completi (contenente 10% FBS, 1% Pen-Strep e 0,1% Pluronic F68). Incubare in un incubatore a 28 ° C senza CO 2 per 6 giorni. Controllare di tanto in tanto le cellule al microscopio. Cellule infette di solito appaiono più grande, rotondo, hanno ampliato nuclei, e iniziano a staccare (Figura 4).
- Raccolta di cellule e conferma di espressione proteica
- Celle di raccolta 6 giorni dopo la trasfezione mediante centrifugazione a 2000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Il supernatante contiene il baculovirus ricombinante - questo sarà usato per generare scorte lavoro subito, o può essere conservato a 4 ° C per anni.
- Per controllare l'espressione della proteina raccogliere pellet e risospendere in 500 ml di PBS. Mescolare 50 ml di sospensione con 50 microlitri di tampone SDS-PAGE carico (contenente un agente riducente). Eseguire SDS-PAGE ed eseguire una analisi Western blot con un anticorpo anti-hexahistidine per confermare l'espressione genica. Includere cellule dal fintotrasfezione come controlli negativi (Figura 3).
- Preparazione delle scorte di lavoro
- Tavola 5 x 10 5 Sf9 cellule / cm 2 in un pallone T175 cm 2 e lasciate riposare per 20 minuti permettono loro di attaccarsi al piatto. Sostituire multimediale completo TNM-FH con i media TNM-FH contenente 3% FBS (e 1% Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68).
- Infettare le cellule con 100 ml di surnatante salvataggio. Incubare in un incubatore a 28 ° C senza CO 2 per 6 giorni e controllare ogni tanto se le cellule vengono infettati (come descritto al punto 1.2.5.).
- Spin a 2.000 xg a temperatura ambiente per 5 minuti e raccogliere il surnatante. Questo è ora il tuo P2 magazzino. Questo archivio può essere conservato a tempo indeterminato a 4 ° C. Ripetere la procedura di infezione con 100 ml di stock P2 di infettare le cellule. L'azione risultante è chiamato P3 o brodo di lavoro, che può essere conservato a 4 ° C o utilizzato direttamente per l'espressione della proteina. La P3 magazzino di solito contiene 10 <sup> 7 -10 9 unità formanti placca / ml.
2. Proteine Espressione e purificazione
Nota esplicativa: le cellule Sf9 sostenere la crescita di baculovirus molto bene. Tuttavia, la loro capacità di secernere grandi quantità di proteina ricombinante è limitato. Pertanto usiamo un'altra linea cellulare di insetto, cellule High Five, per l'espressione di proteine ricombinanti secrete. Queste cellule non supportare la replica baculovirus a titoli molto alte 13 ma hanno elevata capacità secretoria.
- Crescendo High Five cellule
Crescere High Five cellule in cellule di insetto SFX terreno di coltura in T175 cm 2 palloni. Passaggio a giorni 1:3. Per una cultura espressione 200 ml avrete bisogno di crescere cinque palloni confluenti. - Raccolta e infettare le cellule High Five
- Staccare High Five celle da 5 T175 cm 2 palloni toccando i palloni con la mano. Raccogliere il Sosp cellularension e trasferire in 50 provette ml di centrifugazione.
- Spin a 1.200 xg per 7 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante per decantazione e unire le palline da loro risospensione in 15 ml di P3 magazzino.
- Lasciare riposare per 15 min in cappa a flusso (figura 5).
- Trasferire 200 ml di Hyclone SFX terreno di coltura in una sterile 1.000 ml matraccio agitatore pulito (senza Buffles, sigillato con un foglio di alluminio prima della sterilizzazione in autoclave, non avrebbero dovuto essere utilizzati per colture batteriche prima).
- Trasferire la sospensione P3/cell nel pallone shaker. Sigillare con un foglio di alluminio sterile e pallone trasferimento in uno shaker. Agitare a 70 giri al minuto a 28 ° C per 72-96 ore.
- Raccolta proteina ricombinante da High Five surnatanti di espressione delle cellule
- 72-96 h dopo l'infezione di trasferimento cultura surnatanti in 500 ml secchi centrifugazione. Spin a 5.500 xg per 20 min a 4 ° C. Nel frattempo lavare le fiasche shaker 3x con acqua bidistillata(DDH 2 O).
- Trasferimento 3 ml Ni-resina fanghiglia in un tubo da 50 ml con 45 ml di PBS (occorreva per 200 ml cultura). Agitare bene e centrifugare a 3000 xg a temperatura ambiente per 10 min. Decantare il PBS e mantenere il pellet. Mescolare il surnatante delle cellule di insetto con il pellet Ni-resina e trasferire nelle beute shaker già risciacquati. Incubare a 4 ° C per 2-4 ore, agitando (Figura 6).
- Supporto 10 ml colonna polipropilene su una pinza su un cavalletto di sostegno. Rimuovere entrambi i tappi e mettere un bicchiere sotto la colonna di raccogliere il flusso attraverso (rifiuti). Prendere il matraccio shaker su shaker e inizia a trasferire la miscela sovranatante / slurry sulla colonna; manterrà le Ni-resina e solo il supernatante fluirà attraverso. Passare l'intero volume sopra la colonna (Figura 7).
- Lavare i 4x in resina con 15 ml di tampone di lavaggio (50 mM Na 2 HCO 3, NaCl 300 mM, imidazolo 20 mM, pH 8). Che tutti lo scarico tampone di lavaggiodalla colonna e chiudere con il coperchio (lato inferiore).
- Aggiungere 2 ml di tampone di eluizione (50 mM Na 2 HCO 3, NaCl 300 mM, imidazolo 300 mM, pH 8) e lasciate riposare per 5 minuti. Aprire colonna e raccogliere l'eluato. Ripeti 3 volte (per un totale di 8 ml di tampone di eluizione). Eluato contenente alte concentrazioni di proteina mostra tipicamente schiuma se agitato (Figura 7). Tenere eluato su ghiaccio bagnato quando possibile.
- Scambio Buffer e concentrazione
- Prespin 15 ml ultrafiltrazione unità di centrifugazione (30 kDa cut-off per HA / NA ma possono variare a seconda delle dimensioni proteina purificata) con PBS (pH 7.4-7.6) a 3000 xga 4 ° C per 20 min. Scartare il flusso attraverso e carico eluato sulla colonna di spin. Riempire con 5 ml di sterile, freddo ghiaccio PBS e centrifugare per 60 min a 3000 xg a 4 ° C.
- Flusso di scarico attraverso di nuovo, riempire con 15 ml di ghiaccio freddo PBS e centrifugare per 60 min a 3000 xg a 4 ° C. Ripetere questa proceduraDure ancora una volta.
- Prendere la colonna di spin fuori dalla centrifuga e raccogliere il buffer scambiato concentrato (in genere 200 ml). Questo è molto concentrata proteina ricombinante. Lavare la colonna con 400 ml di sterile freddo ghiaccio PBS e aggiungere questo al concentrato. Conservare il concentrato su ghiaccio in ogni momento.
3. Caratterizzazione e Controllo Qualità
- Misurare la concentrazione di proteine
Prelevare un 'aliquota del concentrato e misurare utilizzando il metodo di quantificazione delle proteine di scelta. Impostare concentrazione proteica di 1 mg / ml aggiungendo PBS e congelare piccole aliquote a -80 ° C. Disgelo congelamento danneggiano la struttura delle proteine e può portare all'aggregazione. - SDS-PAGE e colorazione con Coomassie
Eseguire 500 ng della proteina su una SDS-PAGE ed eseguire una colorazione Coomassie. Per la colorazione veloce e conveniente usare Coomassie reagente in combinazione con un protocollo microonde. Proteine HA compaiono tipicamente a 64kDa mentre le proteine NA devono funzionare ad una dimensione di circa 56 kDa (figure 8A e B). Utilizzando il protocollo descritto non si dovrebbe vedere tutti i prodotti di degradazione. Se si verifica la degradazione di solito è un segno di contaminazione da lieviti / funghi durante espressione. In questo caso, ripetere la procedura e assicurarsi di tenere tutto sterile. - Western Blot / ELISA
Al fine di verificare l'identità della proteina si consiglia di fare un Western Blot o test ELISA con un anticorpo specifico. Idealmente, saggi ELISA vengono eseguite con un anticorpo che si lega ad epitopi conformazionali (ad esempio anticorpi anti-HA gambo 1). L'utilizzo di un tale anticorpo il corretto ripiegamento della proteina può essere confermata (Figura 8C). - Misurare NA attività
Corretto ripiegamento della NA virale può anche essere determinata misurando l'attività NA. Si consiglia di eseguire questo test utilizzando il saggio NA * STAR disponibile in commercio (basta seguire le linee guida dell'utente).
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Representative Results
Molecole di HA da A/Shanghai/1/13 e A/Anhui/1/13 espressi bene con rese di circa 20 mg / L cultura. NA molecole di entrambi i ceppi hanno mostrato livelli di espressione moderati da 0,2 mg / L di coltura per A/Shanghai/1/13 a 0,7 mg / L per A/Anhui/1/13. Tutti e quattro i preparati proteici avevano ben poco a che nessuna impurità (Figure 8A e B) con ha l'essere di purezza superiore AN che può essere spiegato con il livello di espressione. A/Shanghai/1/13 HA è stato ulteriormente analizzato utilizzando ELISA con l'ampiamente neutralizzanti gambo-reattiva umana mAb CR9114 23. Questo mAb lega ad un epitopo conformazionale sensibili nel dominio gambo e viene qui utilizzato come sonda per corretto ripiegamento di questo dominio. L'anticorpo mostra una buona vincolante che dà la fiducia che l'HA è infatti piegato correttamente (Figura 8C). Un secondo ELISA con siero di topo policlonale anti-H7 è stata effettuata per confermare l'identità della proteina ottenuta come di origine H7 (Figura 8D).
Figura 1. Schema di HA e NA costrutti di espressione. Il costrutto di espressione per l'HA (A) contiene un peptide segnale N-terminale seguita dal ectodomain HA, un sito di clivaggio trombina, un dominio trimerizzazione T4 e un tag hexahistidine. L'espressione costrutto NA (B) contiene un peptide segnale N-terminale, seguito da un tag hexahistidine, un vasodilatatore stimolante phosphoprotein (VASP) dominio di tetramerizzazione e il ectodomain NA. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Schema di generat bacmidion (come descritto nel passaggio 1.1.2). Un vettore baculovirus-trasferimento contenente geni HA o NA si trasforma in batteri DH10Bac. Ricombinazione nel genoma di baculovirus che questi batteri portano una colonia fenotipo bianco su piastre di selezione. Una colonia bianco viene raccolto e restreaked. Una singola colonia dalla piastra restreaked viene utilizzato per inoculare una coltura midiprep.
Figura 3. Schema di salvataggio baculovirus e di generazione e di lavoro (come descritto nei passaggi 1.2.1-6). Bacmid ricombinante e reagente di trasfezione sono diluiti nel siero libero medio TNM-FH. Le due soluzioni sono combinati, la miscela è incubata per 20 min e poi trasferiti su cellule Sf9. Sei ore dopo la trasfezione media trasfezione sono sostituiti dai media TNM-FH completi. Sei giorni dopo la transfezione il surnatante viene raccolto e il pellet cellulare è analeyzed per l'espressione di proteine ricombinanti.
Figura 4. Cellule cellule Sf9 sane e infette. Sf9 in (A) sono sani e non infetti. Essi sono attaccati alla capsula di Petri, guarda parzialmente polimorfico e relativamente piccole. Le cellule in (B) sono infettate con baculovirus, staccate dal piatto di coltura, sono grandi e rotondi e hanno ampliato nuclei. Il nucleo mostra anche un aspetto granuloso.
Figura 5. L'infezione di High Five cellule con baculovirus ricombinante (archivio di lavoro, come descritto al punto 2.2). Cinque confluenti boccette T175 con High Five cellule vengono raccolte mediante centrifugazione a bassa velocità e combinate con 15 ml di P3 baculovirus magazzino. Dopo 15 min di incubation la miscela di cellule / virus viene trasferito in 1000 ml beute shaker con 200 ml di SFX media.
Figura 6. Raccolta di cellule surnatante 72-96 ore dopo l'infezione e l'incubazione con resina Ni-NTA (come descritto al punto 2.3). Sospensioni di cellule infette vengono raccolte mediante centrifugazione a bassa velocità. Surnatanti di coltura sono mescolati con PBS-equilibrata Ni-resina e incubate per 2-4 ore agitando.
Figura 7. Procedura di purificazione (come descritto in 2.3 e 2.4) e controllo di qualità (come descritto nei passi 3.1.1-4). Dopo incubazione la tutta la miscela surnatante / resina viene caricato su colonne di polipropilene. La resina viene trattenuto dalle colonne e viene quindi lavato quattro volte con lavaggio BUFfer e la proteina ricombinante viene eluito con 8 ml di tampone di eluizione applicate in 2 ml passaggi. L'eluato viene poi scambiato tampone e concentrato con una colonna di spin ultrafiltrazione, frazionare e congelati. Test di controllo qualità includono SDS-PAGE, Western Blot, ELISA e la misurazione dell'attività NA NA ricombinante.
Figura 8. Risultati rappresentativi. HA (A) e NA (B), proteine del A/Anhui/1/13 e A/Shanghai/1/13 sono stati analizzati utilizzando SDS-PAGE e colorazione con Coomassie. Integrità strutturale della HA di A/Shanghai/1/13 stata valutata utilizzando il largamente di neutralizzazione CR9114 anticorpo gambo-reattiva umano che si lega ad un epitopo conformazionale sensibili (C). L'identità della stessa HA è stata confermata da un siero di topo anti-H7 policlonale (D).
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Discussion
Anche se l'espressione del virus dell'influenza HA e NA proteine in cellule di insetto che utilizzano il sistema di espressione baculovirus è generalmente semplice, ci sono diversi punti importanti da considerare. E 'importante, come ricordato in premessa, che i ectodomains di HA e NA sono espressi in fusione con domini trimerizzazione o tetramerization rispettivamente. Questi domini garantiscono corretto ripiegamento delle molecole solitamente assistiti dal dominio transmembrana, che non è presente solo se il ectodomain è espresso. Ad esempio, l'espressione della ectodomain HA senza dominio trimerizzazione porta ad oligomerizzazione e destabilizzazione di importanti epitopi neutralizzanti nel dominio gambo 1. Inoltre, la stabilità delle proteine è diminuita e la degradazione da cellule di insetto e proteasi baculovirus verifica. La scelta del dominio trimerizzazione o tetramerization è meno importante, un certo numero di essi che vanno da domini leucina cerniera 22di T4 foldons fagi 11 sono stati testati finora e tutti hanno mostrato risultati soddisfacenti. E 'importante tenere a mente che siti di taglio multibasic che si verificano in alta patogenicità H5N1 24 o 25 H7N7 isolati (ma non nel H7N9) devono essere rimossi prima espressione in quanto sono spaccati da furina quali proteasi, che sono presenti in ogni momento in il sistema di espressione baculovirus 1,12.
Un'altra possibile ragione per i prodotti degradational è contaminazione con lieviti o muffe. Ciò può accadere già nel corso generazione e di lavoro e può passare inosservato durante la conservazione delle scorte a 4 ° C. Molti lieviti e muffe preferiscono temperature comprese tra 20-30 ° C per una crescita ottimale e sono effettivamente inibiti a 37 ° C, che è la temperatura cultura comune per le cellule di mammifero. Poiché la maggior parte degli antibiotici che vengono utilizzati nelle colture cellulari non sono efficaci contro organismi eucarioti, come lieviti e muffe, e la coltura di cellule di insetto è esibiranno d alle condizioni di crescita ottimali di questi germi cura supplementare deve essere presa in termini di maneggevolezza asettico delle culture. Oltre a overgrowing cellule di insetto e acidificanti media, muffe e lieviti esprimono molte proteasi solubili e possono quindi degradare completamente proteine ricombinanti.
Un problema che si verifica talvolta è precipitazione nel tampone di eluizione. Questo si vede raramente e più o meno specifico ceppo (es A/Vietnam/1203/04 H5 HA tende a precipitare), ma può essere prevenuta scambio tampone rapido e completo di PBS. Stoccaggio di proteine in tampone di eluizione-imidazolo contenenti non è raccomandato. La procedura di purificazione dalla vendemmia al congelamento di aliquote a -80 ° C deve essere effettuata entro un giorno lavorativo e deposito di proteina purificata a temperatura diversa da -80 ° C dovrebbero essere evitati. Inoltre, ripetuti cicli di congelamento-scongelamento hanno dimostrato di avere un impatto negativo sulla stabilità di alcuni epitopi 1.
_content "> rendimenti dovrebbe essere previsto per essere nell'intervallo 0.2-30 mg / L cultura. molti è esprimere nella fascia superiore mentre AN tendono ad esprimere a livelli inferiori. Inoltre, i livelli di espressione di HA sembrano correlare inversamente con il numero dei siti di glicosilazione. HAs da H3N2 stagionale umana e stagionale prepandemico H1N1 isolati di solito mostrano livelli di espressione bassi, mentre la maggior parte ha di origine virus dell'influenza aviaria hanno livelli elevati di espressione. Per migliorare l'espressione si raccomanda di aumentare la densità cellulare nel pallone o per provare di utilizzare meno o magazzino più lavorare in ogni espressione. aumento di 10 volte o diminuzione dello stock di lavoro possono influire positivamente sui livelli di espressione. Un altro fattore che può influire sui livelli di espressione è il tempo che intercorre tra l'infezione e la raccolta. 96 ore sono l'ideale per la maggior parte ha e AN ma i tempi di incubazione più brevi potrebbe effettivamente aumentare le rese di alcune proteine.Cellule di insetto sono in grado di eseguire modifiche post-traduzionali in maniera quasi mammiferin modo simile e sono in grado di piegare le strutture di proteine molto complesse con efficienze simili a quelli di cellule di mammiferi (ma producendo rendimenti più elevati). In termini di glicosilazione, esibiscono un modello che è leggermente diverso da cellule di mammifero e caratterizza principalmente paucimannosidic N-glicani che mancano modifiche acido sialico 19. Tuttavia, le linee di cellule di insetti che sono stati modificati per produrre mammiferi come glicosilazione (incluso l'acido sialico terminale) sono disponibili in commercio 14.
Il sistema di espressione baculovirus è uno strumento estremamente utile per l'espressione delle glicoproteine di superficie influenzali ricombinanti - HA e NA. Queste proteine ricombinanti sono utilizzati per vari saggi immunologici e biochimici, nonché per la standardizzazione del contenuto di antigene e di vaccini come antigene per esperimenti di vaccinazione in modelli animali. Baculovirus-espressi HA e NA mostrano piena funzione biologica e corretto ripiegamento, se espressa in cornice con trimerizatisu e domini tetramerization rispettivamente. Questo li distingue da batteri espresso ha quel sono non-glicosilata e la mancanza di epitopi funzionali nel dominio gambo. Inoltre, le mostre del sistema di espressione baculovirus rendimenti significativamente più elevati di proteine rispetto ai sistemi cellulari di mammiferi 26 e movimentazione e upscaling sono più facili. In sintesi si descrive un protocollo semplice ed efficace per esprimere grandi quantità di virus influenzale ricombinante HA e NA molecole.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Patrick C. Wilson per monoclonale CR9114 anticorpo. Ringraziamo anche Jennifer Debeauchamp e Richard Webby per i plasmidi originali A/Anhui/1/13. Supporto parziale per questo lavoro è stato fornito dal National Institute for Allergy e Malattie Infettive-finanziato Progetto Programma di Grant AI097092-01A1 e CEIRS (centri di eccellenza per la ricerca e l'Influenza Surveillance, HHSN26620070010C). FK è stato sostenuto da una borsa di Erwin Schrödinger (J 3232) dal Fondo austriaco della scienza (FWF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
References
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