Summary
المعرفة الحالية على أساس الخلوية من أمراض القلب تعتمد في الغالب على دراسات على نماذج حيوانية. نحن هنا وصف والتحقق من صحة طريقة جديدة للحصول العضلية قابلة للحياة واحد من عينات جراحية صغيرة من عضلة القلب البطيني الإنسان. myocytes البطين الإنسان يمكن أن تستخدم للدراسات الكهربية واختبار المخدرات.
Abstract
تخضع العضلية من قلوب المريضة إلى العمليات المعقدة التي تنطوي على إعادة عرض التغيرات في بنية الخلية، الإثارة انكماش اقتران والتيارات أيون الغشاء. ومن المرجح أن تكون مسؤولة عن زيادة خطر محدث اضطراب النظم والتعديلات التي تؤدي إلى ضعف مقلص الانقباضي والانبساطي في مرضى القلب تلك التغييرات. ومع ذلك، فقد تأتي معظم المعلومات على التعديلات وظيفة خلية عضلية في أمراض القلب من النماذج الحيوانية.
نحن هنا وصف والتحقق من صحة بروتوكول لعزل myocytes قابلة للحياة من عينات جراحية صغيرة من عضلة القلب البطيني من المرضى الذين يخضعون لعمليات جراحية في القلب. يوصف البروتوكول بالتفصيل. وذكرت القياسات الكهربية والكالسيوم داخل الخلايا لإثبات جدوى لعدد من القياسات وحيدة الخلية العضلية في البطين الإنسان التي تم الحصول عليها مع هذا الأسلوب.
ذكرت وبروتوكول انهيمكن أن يكون مفيدا لإعادة التحقيقات مستقبل أساس الخلوية والجزيئية من تعديلات وظيفية من قلب الإنسان في وجود أمراض القلب المختلفة. علاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد أهداف علاجية جديدة على المستوى الخلوي واختبار فعالية مركبات جديدة على العضلية البشرية، مع قيمة متعدية المباشرة.
Introduction
تشريح الخصائص الكهربية لعضلة القلب قد تقدم بشكل ملحوظ بعد تطوير تقنيات لعزل واحد خلية عضلية قلبية. كما بذلت التطورات الأخيرة في فهم القلب الإثارة تقلص اقتران (EC-اقتران) بفضل القدرة على عزل العضلية واحد قابلة للحياة التي تحتفظ كافة الخصائص الفسيولوجية للأنسجة سليمة. ويعمل أساليب التصحيح المشبك بشكل روتيني لدراسة وظيفة وتعديل الدوائية للsarcolemmal القلب التيارات أيون. كما أجريت تسجيلات لديناميات الكالسيوم داخل الخلايا مع كا 2 + الأصباغ الحساسة بانتظام على myocytes القلب واحد من مجموعة متنوعة من النماذج السليمة والمريضة، وتوفير البيانات الحيوية على فسيولوجيا EC-اقتران وكذلك على التغيرات المرضية من داخل الخلايا كا 2 + مما يؤدي إلى اختلال التوازن الميكانيكية وزيادة العبء محدث اضطراب النظم في أمراض القلب. انفورمانشوئها من هذه الدراسات هو أمر حاسم لفهم الآثار الكهربية والميكانيكية المخدرات في الإعداد السريرية. ومع ذلك، هناك اختلافات محددة في الأنواع التيارات وعبر الغشاء في البروتينات EC-اقتران التي تمثل سمات محددة من إمكانات العمل القلب والميكانيكا القلب. وهكذا، في حين أوضحت دراسات myocytes المعزولة من الثدييات غير البشرية الخصائص الفيزيائية الحيوية والفسيولوجية للأدوار القنوات الأيونية عبر الغشاء محددة والبروتينات EC-اقتران، فإنها لا توفر بالضرورة النماذج ذات الصلة من myocytes القلب البشري. وبالتالي عزلة myocytes قابلة للحياة من عضلة القلب البشري هو ضروري لفهم كامل للالفيزيولوجيا المرضية لأمراض القلب والتحقق من صحة النهج العلاجية الرواية.
النسيج الأذيني الإنسان متاحة بسهولة في كثير من الأحيان يتم تجاهل الزوائد الأذيني أثناء العمليات الجراحية. الدراسات الكمية الأولي من إمكانات العمل القلب البشري الكبار ومكعب الأيونيةrrents العاملين الخلايا الأذيني معزولة إنزيمي 1-4. وقد تم الإبلاغ عن تسجيلات لإمكانات العمل أو تيارات من خلايا الإنسان البالغ البطين المعزولة في وقت لاحق 3،5-10. وقد استخدمت معظم هذه الدراسات تم الحصول عليها من خلايا قلوب explanted والاستفادة منها إما كولاجيناز نضح من شريحة الشريان التاجي أو التعرض كميات كبيرة نسبيا من الأنسجة رفعه إلى كولاجيناز للحصول على خلايا معزولة. سمحت هذه الدراسات على توصيف مفصل لعدد من التيارات عبر الغشاء أيون من العضلية البطين الإنسان من قلوب سليمة ومن المرضى الذين يعانون من قصور في القلب الطرفية. تسجيلات من نوع L-كا 2 + الحالية (I CA-L) 5-7، عابر الحالية البوتاسيوم الخارج (أنا ل) 8، الداخل المعدل الحالي البوتاسيوم (I κ1) 8، ومكونات مختلفة من تأخر المعدل الحالي البوتاسيوم (I κ ) تم الإبلاغ عن 9. السلف وتكريرالإجراء العزلة 10، يسمح للتوصيف واضح للأساس الأيونية للزيادة المحتملة محدث اضطراب النظم في فشل القلب المحطة، التي تضم 11 إطالة عمل محتمل، وتأخر بعد depolarizations 12 وزيادة مضحك الحالي 13 مما يؤدي إلى إزالة الاستقطاب الانبساطي ويدق سابقا لأوانه.
يتم عزل myocytes القلب الكبار عادة من الحيوانات الصغيرة عن طريق نضح الوراء من القلب كله مع خليط من مختلف انزيم، وهي تقنية التي تنتج غلة عالية من الكالسيوم 2 + الخلايا التي تتحمل 14. عزلة myocytes القلب من شظايا الأنسجة هي بطبيعتها أقل نجاحا ربما بسبب وصول محدود من الانزيمات لmyocytes الفردية مقارنة مع تلك التي نضح من الشرايين التاجية التي تحققت. بسبب توافر محدود جدا من قلوب المانحة غير المستخدمة، والطريقة العملية الوحيدة للحصول على خلايا البطين الإنسان العادي على أساس منتظم هي digestio الأنزيميةن من شظايا الأنسجة في كثير من الأحيان صغيرة جدا رفعه أثناء العمليات الجراحية الاختيارية. نموذج المرض البشري الوحيد الذي اتسم بدقة على مستوى الخلية هو قصور القلب المحطة، نظرا لإمكانية الوصول إلى قلوب المزروعة. ومع ذلك، يحدث فشل القلب محطة في أقلية من المرضى وينطوي على الطريق الشائع للإعادة حاد في خلايا عضلة القلب، وهي مستقلة نسبيا من السبب الكامن وراء 15 في كثير من الأحيان. القدرة على تقييم وظيفة العضلية واحد من المرضى في مرحلة مبكرة غير الفشل من المرض أمر حاسم لفهم الفيزيولوجيا المرضية محددة من الظروف الموروثة أو المكتسبة مختلفة. اعتلال عضلة القلب الضخامي (HCM) هو مثال القصص. HCM هو مشترك (1/500 فرد) حالة القلب القابلة للتوريث تتميز تضخم القلب، وزيادة خطر ومقلص التعديلات محدث اضطراب النظم بسبب انسداد المسالك وتدفق الخلل الانبساطي 16. العضلية من قلوب HCM يوndergo على عمليات إعادة معقدة تنطوي على تغييرات في هيكل الخلية (تضخم، حالة من الفوضى myofibrillar) واقتران EC-17. ومع ذلك، فقد تأتي معظم المعلومات من ضعف خلية عضلية في HCM من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا. منذ أقلية فقط من المرضى HCM تتطور نحو فشل القلب محطة ويتطلب زرع القلب، هي جدا نادرا ما تتوفر لعزل الخلايا مع الأساليب القياسية قلوب HCM. ومع ذلك، لا يقل عن 30٪ من المرضى الذين تظهر عليهم أعراض الانسداد HCM بسبب تدفق هائل الحاجز تضخم المحورة لتدفق الدم أثناء انقباض المسالك (HCM) 18. الخيار العلاجية المتاحة الأكثر فعالية للتخفيف من انسداد في HCM هو الحاجز الجراحية استئصال العضلة: خلال هذه العملية الجراحية، تتم إزالة جزء متغير الحجم من الحاجز العلوي نهج الأبهر غير المشبعة. هذا الجزء من الحاجز متضخما وبالتالي تتوفر لعزل الخلايا من أنسجة جديدة.
وهناك طريقة لعزل ventricula الإنسانص myocytes من واحد، عبر الوريد عينات خزعة شغاف وعضلة القلب صغيرة وقد وضعت سابقا ونشرت 19. نفذنا طريقة لعزل myocytes الحاجز واحد من عينات عضلة القلب البطيني من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب، بما في ذلك المرضى الذين يعانون من HCM تمر استئصال العضلة الحاجز والمرضى الذين يخضعون لإجراءات استبدال صمام. بالإضافة إلى وصف مفصل للبروتوكول العزلة، ممثل الكهربية والكالسيوم 2 + مضان يتم عرض القياسات، مما يدل على جدوى معزولة myocytes البطين الإنسان وجدوى المشبك التصحيح والكالسيوم داخل الخلايا 2 + دراسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية على الأنسجة البشرية من قبل اللجنة الأخلاقية من جامعة مستشفى Careggi (2006/0024713؛ تجدد مايو 2009). أعطى كل مريض الموافقة المسبقة عن مكتوب.
1. حلول وإعداد معدات
ووصف الحلول في الجدول 1. تم العثور على مخطط مبسط لإجراء العزل الخلية في الشكل 1.
| حل | CP | DB | KB | مرض السل | PS | EB1 | EB2 | |
| كاشف (ملم) | KH 2 PO 4 | 50 | ||||||
| MgSO 4 | 8 | 1.2 | 5 | 1.2 | 1.2 | |||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | |||||
| الأدينوزين | 5 | |||||||
| جلوكوز | 140 | 10 | 20 | 10 | 10 | 10 | ||
| مانيتول | 100 | |||||||
| التورين | 10 | 20 | 5 | 20 | 20 | |||
| كلوريد الصوديوم | 113 | 136 | 113 | 113 | ||||
| بوكل | 4.7 | 85 | 5.4 | 25 | 4.7 | 4.7 | ||
| MgCl 2 | </ الدفتيريا> | 1.2 | 5 | |||||
| KH 2 PO 4 | 0.6 | 30 | 0.6 | 0.6 | ||||
| نا 2 هبو 4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | |||||
| NaHCO 3 | 12 | 12 | 12 | |||||
| KHCO 3 | 10 | 10 | 10 | |||||
| NA-البيروفات | 4 | 4 | 4 | |||||
| BDM | 10 | 10 | 10 | |||||
| BHBA | 5 </ الدفتيريا> | |||||||
| حمض السكسينيك | 5 | |||||||
| EGTA | 0.5 | |||||||
| K-2 ATP | 2 | |||||||
| حمض البيروفيك | 5 | |||||||
| الكرياتين | 5 | |||||||
| KMES | 115 | |||||||
| الأنزيمات (U / مل) | كولاجيناز نوع V | 250 </ الدفتيريا> | 250 | |||||
| النوع البروتيني الرابع والعشرون | 4 | |||||||
| درجة الحموضة | 7.4 KOH | 7.3 هيدروكسيد الصوديوم | 7.1 KOH | 7.35 هيدروكسيد الصوديوم | 7.2 KOH | 7.3 هيدروكسيد الصوديوم | 7.3 هيدروكسيد الصوديوم | |
. الجدول 1 حلول المستخدمة لجمع العينات، والعزلة خلية وتوصيف وظيفي من myocytes CP = حل شلل القلب؛ DB = تفارق العازلة؛ KB = حل كرافت-Bruhe؛ السل = عازلة تايرود؛ PS = حل ماصة؛ EB1 = انزيم العازلة 1؛ EB2 = انزيم العازلة 2.
- إعداد شلل القلب (CP) حل. ويمكن تخزين حل CP في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
- إعداد كا 2 + خالية من التفكك العازلة (DB). ينبغي استخدام هذا الحل خلال اليوم.
- إعداد كرافت-Bruhe (KB) حل. ويمكن تخزين KB الحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 ويك.
- إعداد كا 2 + خالية العازلة تايرود (السل). ينبغي استخدام هذا الحل خلال اليوم.
- تصفية جميع الحلول باستخدام مرشحات حقنة قبل استخدامها.
- إعداد جهاز الهضم (الشكل 2)، وعاء مصنوع من تجريف اثنين من فرش تواجه من السيليكون والمطاط الصناعي، واحدة منها استدارة بواسطة محرك كهربائي. هو العرف الجهاز الهضم. التفاصيل على الجهاز الهضم هي في الشكل 8؛ صور الجهاز في الشكلين 2 C و 2D. غسل الغرفة الأنسجة مع الايثانول 70٪ والمياه.
2. جمع وتجهيز العينات عضلة القلب
- صب 40 مل من cardiplegic (CP) الحل في أنبوب 50 مل وتخزينها في الجليد لنقل عينة من غرفة المنطوق إلى المختبر العزلة الخلية.
- جمع العينة عضلة القلب البطيني من غرفة المنطوق مباشرة بعد الختان، وغسله مع الثلج الباردةالحل CP وتخزينها في الأنبوب. استخدام العينات الشغاف رفعه من الحاجز البطيني العليا المشتركة خلال جراحة القلب المفتوح، الترجيح> 100 ملغ.
- بسرعة نقل العينة إلى المنطقة المختبر؛ بدء تجهيز العينات في غضون 10 دقيقة من العينة الختان.
- مع الحفاظ على العينة في المخزن الجليد الباردة CP، وإزالة بعناية طبقة تليفي الشغاف باستخدام مقص غرامة تحت stereomicroscope؛ بعد ذلك، قص الأنسجة عضلة القلب إلى قطع صغيرة (2-3 ملم طويلة). اعتمادا على حجم العينة الأنسجة، وقطع المبلغ الإجمالي للالبطين عضلة القلب ما بين 100 ملغ و 1 غرام لكل العزلة.
- عند الانتهاء من تنميق الأنسجة، ونقل أجزاء عضلة القلب في الجهاز الهضم، مع الجليد نظيفة حل CP الباردة. تجنب ملء مجلدا كاملا بين اثنين من فرش السيليكون (3-4 مل) مع قطع عضلة القلب، وذلك باستخدام ما لا يزيد عن 1 غرام من الأنسجة المجموع.
3. الغسيل والهضم من عضلة القلب قطعة غليظة
- الخلفإيه يتم نقل قطع في غرفة تجريف للجهاز الهضم، وتغيير المخزن المؤقت CP في غرفة مع الكالسيوم الباردة 2 تفارق العازلة خالية من + (DB).
- وضع الجهاز الهضم في حمام الحراري، وذلك للغرفة ليكون في اتصال مع الماء الساخن في الحمام (الشكل 1). تعيين الحمام إلى 37.5 درجة مئوية، وتشغيله، وذلك لرفع درجة الحرارة ببطء من الغرفة الأنسجة. تشغيل المحرك للجهاز الهضم، وتحديد سرعة دوران الثورة إلى 1 / ثانية.
- تنفيذ 3 دورات الغسيل مع DB، وتغيير الحل في غرفة نظيفة مع DB كل 8 دقائق. وارتفعت درجة حرارة DB (37 ° C) والأكسجين المشبع قبل الحصول على اتصال مع أجزاء عضلة القلب.
- إعداد انزيم عازلة 1 (EB1) وذلك بإضافة 250 U / مل من كولاجيناز نوع V و 4 U / مل البروتياز نوع الرابع والعشرون لحل DB. إعداد انزيم العازلة 2 (EB2) وذلك بإضافة 250 U / مل كولاجيناز نوع V إلى حل DB. الاحماء (37 ° C) وoxygenatه EB1 وEB2.
- تنفيذ دورتين 12 دقيقة من عملية الهضم في الجهاز الهضم بالتناوب مع EB1 الاوكسيجين 100٪ (عند 37 درجة مئوية). في كل دورة، استخدم ~ 3 مل من EB1. إزالة حل عن طريق الشفط ماصة وتجاهل أنه بعد كل دورة.
- 6 إعداد 15 مل أنابيب لجمع الخلايا و~ 80 مل من البرد (4 درجات مئوية) KB حل ليبلغ حجمه المخازن المؤقتة.
- إجراء دورة الهضم 15 دقيقة الأولى مع 3 مل 100٪ EB2 الاوكسيجين في 37 درجة مئوية. بعد دورة الهضم، وجمع محلول يحتوي على myocytes فصلها الأول في أنبوب 15 مل وتمييع تعليق الخلية مع 12 مل KB الباردة الحل. تخزين مسطحة أنبوب في درجة حرارة الغرفة.
- تمييع الحل EB2 المتبقية مع مبلغ مساو من DB من أجل خفض تركيز كولاجيناز الخامس للدورات التالية الهضم.
- تنفيذ دورات أخرى 5 12 دقيقة الهضم مع 3 مل EB2 عند 37 درجة مئوية؛ بعد كل منهم جمع من خلية عضلية تحتوي على العازلة في أنبوب مخروطي 15 مل وتمييع مع 12 مل KB الحل. تخزين الخلايا التي تحتوي على أنابيب 6 في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
4. إعادة تعليق الخليوي وكا 2 + إعادة التكيف
- إضافة 1 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) إلى 20 مل كا 2 + خالية من تايرود العازلة (السل). تحديد الحل.
- أجهزة الطرد المركزي لستة خلية عضلية تحتوي على أنابيب مخروطية في 100 x ج لمدة 5 دقائق لإجبار myocytes لتسوية. إزالة طاف و resuspend الخلايا في كل أنبوب مع كمية متغير (1-3 مل، اعتمادا على المحصول) من جيش صرب البوسنة التي تحتوي على السل في RT.
- تدريجيا يزيدون كا 2 + تركيز في المخزن المؤقت الخلية التي تحتوي بإضافة مأخوذة صغيرة من 100 مليمول / لتر و CaCl 2 الحل. في الخطوات الأولى والثانية يتم رفع كا 2 + تركيز تصل إلى 50 ميكرومول / لتر و 100 ميكرومول / لتر، على التوالي. يتم تنفيذ الخطوات كا 2 + بالإضافة التالية كل 5 دقائق ويتم رفع تركيز بنسبة 100 ميكرومول / لتر في كل خطوة رالزراعة العضوية تركيز النهائي من 0.9 ملمول / لتر.
- تقييم العائد من إجراء العزل. نقل 0.5 مل من خلية عضلية تحتوي على الحل على غرفة أسفل الزجاج من المجهر. تقييم 15 حقلا المجهر على التكبير 10x الهدف وحساب النسبة المئوية من myocytes صحية (مثل قضيب على شكل الخلايا مع التصدعات واضحة ولا شوائب كبيرة، الشكل 2). العائد المتوقع هو حوالي 20٪.
5. التقييم الوظيفي للالمعزولة العضلية.
بروتوكول التالي هو مثال من cardiomyocyte تقييم وظيفي الإنسان بما في ذلك التسجيلات في وقت واحد من إمكانات العمل والكالسيوم داخل الخلايا 2 + التدفقات.
- إعداد الحل ماصة (PS) لإجراء التجارب المشبك التصحيح في التكوين التصحيح مثقبة. ويمكن تخزين الحل في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
- إضافة 1.8 ملمول / لتر و CaCl 2 إلى كا 2 عازلة خالية من تايرود + (السل). Uحد ذاته هذا الحل لsuperfusion من خلال التجارب العضلية المشبك التصحيح / مضان.
- نقل 1 مل من تعليق خلية إلى أنبوب 1.5 مل وإضافة 10 ميكرومول / لتر Fluoforte و 10 ميكرولتر Powerload التركيز. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT. بعد ذلك، تعيين أنبوب في الوضع الرأسي وترك الخلية لتسوية لمدة 5 دقائق؛ resuspend الخلايا في كا 2 + التي تحتوي على السل.
- نقل 0.25 مل من تعليق خلية إلى صغيرة (0.5 مل)، ودرجة الحرارة التي تسيطر عليها المجهر شنت غرفة تسجيل، superfused عن طريق الجاذبية مع نظام microperfusor ساخنة في معدل تدفق 0.3 مل / دقيقة (درجة الحرارة: 37 ± 0.5 درجة مئوية).
- باستخدام مجتذب micropipette، وإعداد التصحيح ماصات المشبك بقطر غيض من 3 إلى 5 ميكرون والمقاومة من 3-4،5 م عندما تمتلئ PS.
- إضافة الأمفوتريسين B إلى مجموعة من PS (250 ميكروغرام / مل) واستخدامها لملء الأقطاب.
- تحديد شكل الخلية قضيب مع التصدعات واضحة، تخلو من شوائب، لجمهورية مقدونيا ختم جيجا وانتظر 5 إلى 10 دقيقة، حتى قطرات المقاومة وصول أقل من 20 MΩ.
- انتزاع إمكانات العمل في وضع المشبك الحالي باستخدام نبضات قصيرة (<3 ميللي ثانية) على ترددات مختلفة من التحفيز (0.2 هرتز، 0.5 هرتز و 1 هرتز، 1 دقيقة في كل تردد). أثناء مرحلة التسجيل، وتشغيل إضاءة حقل مشرق في 492 ± 3 نانومتر، والكشف عن مضان في Fluoforte 505-520 نانومتر. اكتساب مضان وغشاء المحتملة باستخدام إشارات Digidata 1440A وpClamp 10.0 البرمجيات. تكرار تسلسل تسجيل عدة مرات إذا لزم الأمر؛ ومع ذلك، والحفاظ على مجموع وقت تسجيل أقل من 15 دقيقة لكل خلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كان يعمل الطريقة الموصوفة أعلاه لتوصيف وظيفي من تشوهات العضلية معزولة عن الحاجز بين البطينين من المرضى الذين يعانون من اعتلال عضلة القلب الضخامي (HCM) الذي خضع لعملية استئصال العضلة، مقارنة مع مرضى الفشل الضخامي غير غير الجراحية 21. وتستمد النتائج الواردة في هذا القسم من هذا العمل 21 وترد هنا كمثال للكيفية التي يمكن أن تستخدم هذه التقنية لتوصيف تغيرات في وظيفة خلايا عضلة القلب في ظروف مرض القلب.
يظهر نموذج الجراحية ممثل من مريض مصاب HCM في الشكل 2A. وكانت العينات الجراحية متغير للغاية من حيث حجم وسمك الشرائط ليفية الشغاف. كانت كمية الأنسجة عضلة القلب التي استخدمناها لكل إجراء العزل من عينات HCM حول 1G. بدلا من ذلك، كانت كمية الأنسجة المستخدمة في عينات السيطرة أصغر (100-500 ملغ)، وذلك بسبب لويص توافر الأنسجة. كان العائد أعلى بكثير عندما تم تجهيز عينات السيطرة فيما يتعلق HCM، ربما لأن يتم تخفيض القيمة النسبية للخلايا عضلة القلب قابلة للحياة داخل الأنسجة في HCM عضلة القلب وتليف شغاف وعضلة القلب وزيادة 22. من هذه الملاحظة نحن خلص إلى أن المبلغ المطلوب من الأنسجة للحصول على خلايا قابلة للحياة قد تكون متغيرة تبعا لغياب أو وجود أمراض عضلة القلب.
قطعت العينات إلى قطع صغيرة كما هو موضح في الشكل 2B. بعد ذلك، تم نقل قطع الى غرفة الجهاز الهضم (الشكل 2C) وتستخدم لعزل خلية واحدة كما هو موضح أعلاه (الشكل 2D). ويرد photomicrographs ممثل تعليق خلية والتي تم الحصول عليها باستخدام الإجراء العزلة خلية وصفت من عينة الحاجز بين البطينين في أرقام 3A 3B و؛ الصور المكبرة من كاليفورنيا البطين واحدوصفت rdiomyocytes في أرقام 3C-3F. واستخدمت العضلية من عينات HCM للتسجيلات في وقت واحد من إمكانات العمل والكالسيوم داخل الخلايا 2 + الاختلافات كما هو موضح في قسم البروتوكول. وتظهر آثار في وقت واحد ممثل يظهر الجهد غشاء (أعلاه) والكالسيوم داخل الخلايا 2 + (أدناه) خلال التحفيز على 3 ترددات مختلفة في الشكل 4: سجلت هذه الآثار من cardiomyocyte واحدة معزولة عن عينة HCM.
وأظهرت نتائج الدراسات المشبك التصحيح أن عمل محتمل مدة (APD) سجلت عند ترددات مختلفة من التحفيز لفترات طويلة وبشكل ملحوظ في المرضى الذين يعانون من العضلية من HCM (العضلية HCM) مقارنة مع الضوابط (5A الشكل و5B). للتأكد من الحفاظ على الاستجابات الفسيولوجية في myocytes معزولة، ونحن اختبار آثار ايزوبروتيرينول، وتستخدم في 10-7 M (الشكل 5C): β-adrenerأنتجت مؤسسة الخليج للاستثمار التحفيز تقصير AP المتوقع في myocytes السيطرة. منذ فترة طويلة الهادئ يؤدي إلى زيادة خطر الإصابة في وقت مبكر بعد depolarisations (EADS) 23، وقوع EADS، الكشف عن depolarisations عفوية كما أثناء مرحلة الهضبة من وكالة اسوشييتد برس، تم قياس. في العضلية HCM، كانت EADS بشكل ملحوظ أكثر تواترا مقارنة مع الضوابط (الشكل 5D). ويظهر أثر ممثل تظهر EADS متعددة في الشكل 5E
لاختبار ما إذا الهادئ وتشوهات أيون الحالية تعد قد تؤثر آليات اقتران الإثارة انكماش العضلية HCM، تم تقييم خصائص الخلايا كا 2 + الاختلافات خلال التحفيز. كانت السعة كا 2 + العابرين أثار في ظروف مماثلة في المشبك الحالي مقارنة HCM للسيطرة العضلية (الشكل 6A). على العكس، حركية كا 2 + عابرة، كانت أطول بشكل ملحوظ في HCM (الشكل6B). بالإضافة إلى ذلك، كانت الخلايا الانبساطي كا 2 + تركيز أعلى بشكل ملحوظ في HCM مقارنة للسيطرة العضلية (الشكل 6C) وزيادة أكثر بروزا على زيادة في وتيرة التحفيز.
والجدير بالذكر أن العضلية معزولة مع هذا الأسلوب من عينات البطين الإنسان كما تم استخدامها بنجاح لتطبيقات أخرى، بما في ذلك تسجيلات الجهد المشبك من التيارات عبر الغشاء محددة (الشكل 7A)، الكالسيوم داخل الخلايا 2 + و / أو تقصير الخلية التسجيلات خلال التحفيز مجال كهربائي (الشكل 7B) وتقييم هيكل غرامة من غمد الليف العضلي باستخدام المجهر متحد البؤر والتسميات فلوري غشاء محدد (الشكل 7C).
الرقم 1. مخطط انسيابي الداخلي العزلة الخلية.
الشكل 2. تجهيز العينات البطين لعزل الخلية (أ) صورة الممثل تظهر عينة من عضلة القلب البطيني من مريض مصاب HCM الذين خضعوا لعملية استئصال العضلة الحاجز. شريط المعايرة = 5MM. (B) قطع من قطع الأنسجة البطين من عينة جراحية البطين، لاستخدامها لعزل الخلية. شريط المعايرة = 5MM (C) الصور من جهاز الهضم. ويتألف الجهاز الهضم غرفة مع اثنين من فرش السيليكون: فرشاة متفوقة قادرة على تدوير عندما انتقلت بواسطة محرك (D) صورة تبين جهاز الهضم في الحمام thermostated أثناء الهضم الأنزيمي من الأنسجة البطين. ع>
تظهر لوحة الرقم 3. المعزولة العضلية البطين الإنسان. (AB) photomicrographs من حقلين المجهر (10X الهدف) يظهر تعليق cardiomyocyte ممثل. من المذكرة، حوالي 30٪ من الخلايا هي على شكل قضيب وتظهر التصدعات واضحة. شريط المعايرة = 100 ميكرون. (CE) وصور الممثل من 3 العضلية البشرية المعزولة من عينة من مريض HCM (40X الهدف). شريط المعايرة = 20μm. (F) صورة تظهر العضلية البطين الإنسان لمسها من قبل غيض من ماصة التصحيح للتسجيلات. شريط المعايرة = 20μm.
es.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51116/51116fig4.jpg "/>
الشكل 4. تسجيل في وقت واحد من غشاء المحتملة والكالسيوم داخل الخلايا. التتبع الممثل تظهر غشاء المحتملة (أعلاه) والكالسيوم داخل الخلايا (أدناه) سجلت من خلية عضلية واحدة معزولة عن عينة HCM. يتم تحفيز خلية عضلية عبر ماصة التصحيح عند 0.2 هرتز، 0.5 هرتز و 1 هرتز.
فرضه الرقم 5. التعديلات من إمكانات العمل في العضلية البطين من عينات HCM. (A) الممثل إمكانات العمل أثار عند 0.2 هرتز، 0.5 هرتز و 1 هرتز من خلية عضلية التحكم (يسار، آثار الرمادي) وخلية عضلية HCM (الحق، وآثار سوداء ). (B) متوسط مدة العمل المحتملة في 90٪ عودة الاستقطاب (APD90٪) في HCM (ن = 81) والسيطرة العضلية (ن = 29) في ترددات يخطو ثلاث اختبارها. (C) حدوث EADS في العضلية من المرضى وعينات HCM السيطرة. (D) لتركيب إمكانات العمل في 0.5Hz من خلية عضلية السيطرة في غياب (التتبع المستمر) و في ظل وجود 10 -7 M ايزوبروتيرينول. (E) تتبع الممثل تظهر غشاء المحتملة من cardiomyocyte من المريض HCM عرض عدة depolarizations العفوية التي تحدث خلال مرحلة الهضبة (في وقت مبكر بعد depolarizations، EADS)، التي تميزت السهام. وتتميز المحفزات بواسطة خطوط قصيرة دون أثر. ** = P <0.01 المفردة اختبار t. يتم تعديل جميع لوحات في الشكل بإذن من كوبيني وآخرون 2012 21.
شخصية6 فرضه. التعديلات العابرين الكالسيوم في العضلية البطين من عينات HCM. (A) الممثل أثار العابرين الكالسيوم خلال التحفيز عند 0.2 هرتز عبر ماصة التصحيح في خلية عضلية التحكم (الرمادي) وخلية HCM (أسود). وخاصة، واتساع كا 2 + العابرين لا تختلف بين خليتين (B) حركية كا 2 + العابرين في HCM (ن = 42) والسيطرة (ن = 24) العضلية: الوقت من التحفيز إلى الذروة عابرة (TP )، يتم عرض الوقت من الذروة إلى 50٪ تسوس (T50٪) والوقت من الذروة إلى 90٪ من تسوس عابرة (T90٪). (C) آثار طويلة الممثل تظهر الخلايا كا 2 + خلال التحفيز على 3 ترددات مختلفة في HCM و myocytes السيطرة، وتسليط الضوء على زيادة الانبساطي كا 2 + بمعدلات سرعة عالية في خلية عضلية HCM. (D) متوسط الانبساطي كا 2 + في HCM (ن = 42) والسيطرة (ن = 24) العضلية في 3 را سرعة مختلفةقسم التدريب والامتحانات. ** = P <0.01 المفردة ر الاختبار. يتم تعديل جميع لوحات في الشكل بإذن من كوبيني وآخرون 2012 21.
. الرقم 7 تطبيقات إضافية التجريبية باستخدام myocytes البطين الإنسان (A) اليسار: تظهر آثار فرضه ممثل L-نوع كا 2 + الحالية المسجلة تحت المشبك الجهد في الفولتية الغشاء مختلفة مع بروتوكول معين (انظر 21 للحصول على التفاصيل). الحق: متوسط نوع L-كا 2 + كثافة الذروة الحالية من 18 خلايا معزولة من عينات HCM في الغشاء مختلفة. الفولتية. (B) بين الخلايا كا 2 + تتبع سجلت من خلية عضلية البطين خلال التحفيز مجال كهربائي في 1 هرتز. (C) متحد البؤر صورة cardiom البطينyocyte من عينة HCM ملطخة غشاء ملزمة صبغة الفلورسنت (دي-3-ANEPPDHQ). من المذكرة، وكثافة ttubules منخفضة، مما يوحي المورفولوجية إعادة غشاء في HCM.
الرقم 8. الجهاز الهضم. (AB) مكونات جهاز الهضم. تم توصيل الدورية المحركات متغيرة السرعة إلى الذراع البلاستيكية الأولى، التي يتم توصيلها إلى ثانية واحدة. الذراع البلاستيك الثاني هو قابل للنقل ومتصلا فرشاة العليا. مصنوعة فرش مع السيليكون والمطاط الصناعي. تم استخدام قالب سلبي السليكوون، مع 100 ثقوب متباعدة ~ 1.5 ملم للادلاء الفرش من السيليكون السائل. الفضاء الداخلي من القالب لديها 1.9 سم وقطرها 6 مم، وتنتج فرش من نفس الحجم. مصنوعة الثقوب الموجودة على جانب واحد من العفن من أجل إنتاج 8 ملم شعيرات طويلة عندما الفرشويلقي وإزالتها من القالب. بعد يتم وضع السيليكون السائل في القالب، وهناك حاجة إلى ما لا يقل عن 48 ساعة لتصلب كاملة. هي التي شنت فرش داخل أنبوب زجاجي (القطر الداخلي = 2 سم، سمك 2 ملم) وغرفة اسطوانية شكلتها فرش اثنين والجدران والزجاج ومغلقة بإحكام من قبل اثنين من المطاط O-الخواتم. لابد من دفع واحدة إلى أخرى وفرش؛ يتم لصقها واحد أسفل على قاعدة من البلاستيك، في حين يتم لصقها العلوي واحدة إلى نهاية البلاستيك من الذراع المحرك وبالتالي هي قادرة على تدوير (C) تضخيم آراء الفرشاة العليا. من المذكرة، يحتاج إلى فرشاة لصقها إلى نهاية الذراع المحرك من اجل ان لتدوير (D) يتم عرض مكونات الغرفة في موقفهم النهائي. الفضاء بين اثنين من فرش (الغرفة الفعلي) هو ~ 2 سم واسعة وعالية 7-8 مم؛ هذا الفضاء تناسبها بسهولة 3-4 مل من العازلة، وغيرها من ما يصل الى 1 غرام من الأنسجة عضلة القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفناها والتحقق من صحتها وسيلة لعزل myocytes قابلة للحياة من عينات جراحية من عضلة القلب البطيني الإنسان. بدءا من البروتوكولات التي سبق وصفها التي استخدمت بنجاح إلى خلايا معزولة من العينات الجراحية الأذيني، والتقنية للسماح وقد وضعت فصل myocytes واحدة قابلة للحياة المريضة من عضلة القلب البطيني وصقلها. وأظهرت التقارير المبكرة التي عزلة العضلية واحدة من قطع من الأذيني البطيني الأنسجة وضعف انتقائي repolarizing التيارات البوتاسيوم، مما أدى إلى تغير الخصائص الكهربية والاستجابات الفسيولوجية للمؤثرات 8،24، في حين أن تسليم إنزيم تحتوي عازلة عن طريق نضح التاجي لم تنل تأخر مقوم التيارات في الخلايا عزل 25. للأسف، عزلة myocytes البطين الإنسان من العينات الجراحية من البطين عضلة القلب لا يمكن أن يقوم بها التروية التاجية منذ نزاهة فروع الشريان التاجييتم فقدان تتعارض مع قلوب explanted. العضلية معزولة عن قطع عضلة القلب باستخدام طريقة لدينا عرض التكيف عمل واضحة المدة المحتملة في استجابة للتغيرات في سرعة التردد أو β التحفيز الأدرينالية. من أجل هذه الاستجابات أن تحدث، يطلب من سلامة قنوات البوتاسيوم المعدل تأخر 26-28، مما يدل على سلامة الشاملة لتلك القنوات لا تنال من طريقة عزلتنا. بالإضافة إلى ذلك، خلايا معزولة مع طرقنا تظهر ليس فقط الاستجابات الكهربية العادية (أرقام 3 و 4)، ولكن أيضا عرض العابرين الكالسيوم من الشكل المتوقع ومدة (أرقام 3 و 5) وتنظيم الساركومير العادية (الشكل 2) والممتلكات تقصير (لا معروضة)، مما يدل على أن السلامة الهيكلية الشاملة لتلك الخلايا والحفاظ عليها من قبل هذا الإجراء العزلة. النهوض الرئيسي من هذا الأسلوب أكثر من السابقوتقدم التقنيات من قبل الجهاز الهضم المصممة حديثا، والتي توفر التحريك الميكانيكية لطيف من قطع الأنسجة، مما يسمح للفصل خلية واحدة من دون أضرار مفرطة. علاوة على ذلك، تسمح باستخدام الجهاز الهضم لنا لتوظيف تركيز أقل من الإنزيمات في المخزن المؤقت العزلة الخلية؛ لا سيما ونحن نستخدم تركيز أقل بكثير من البروتيني العشوائي بالمقارنة مع أساليب ذكرت سابقا 24. هو العرف الجهاز في مختبرنا: يتم عرض الخطط بناء في الشكل 8.
تصميم بسيط وهيكل يجعل من السهل جدا لتكرار لتحقيق نتيجة ناجحة من هذا البروتوكول. يصف الأسطورة إلى الشكل 8 أيضا الإجراءات المطلوبة لإنتاج فرش سيليكون وبناء غرفة كشط. نظرا لمزايا الجهاز الهضم، وهو عدد كبير نسبيا من خلايا قابلة للحياة يمكن الحصول عليها من كمية قليلة نسبيا من الأنسجة البطين (منخفضة تصل إلى 100 ملغ).وقد أظهرت الطريقة التي تم نشرها مسبقا 19 لتوفير الكالسيوم myocytes تسامحا من الخزعات الصغيرة (حتى <20 ملغ). ومع ذلك، كان العائد خلية عضلية ذكرت منخفضة جدا ولم تظهر المؤلفين ما إذا كانت الخلايا المعزولة مع هذا الأسلوب كان ممكنا لتوصيف الدراجات الكالسيوم داخل الخلايا وظيفة مقلص. هذا الأسلوب هو والممكن تطبيقها في العديد من المرضى لعمليات جراحية، منذ أجزاء صغيرة من الحاجز بين البطينين كثيرا ما رفعه خلال إجراءات استبدال صمام (على سبيل المثال. استبدال الصمام الأبهري). ومع ذلك، فإن النقطة الحاسمة للحصول على العزلة الناجح هو البدء السريع في الإجراء بعد جمع العينات من غرفة العمليات. لذلك، هو مطلوب منها للمختبر الخلية لتكون على مقربة من العيادة جراحة القلب، من أجل هذه التقنية لتكون مثمرة. بالإضافة إلى ذلك، نشاط انزيم السليم هو أيضا في غاية الأهمية لنجاح العزلة. منذ العشوائي نشاط الأنزيم البروتيني سو عادة ما يتم اختبار كل دفعة كولاجيناز تماما، كل الكثير من المرجح أن تؤدي بشكل مختلف خلال العزلة الخلية. ولذا فمن الضروري لضبط تركيز النهائي من كولاجيناز من أجل تحقيق أفضل النتائج. نقترح مراقبة تعليق خلية تحت المجهر في كل دورة، وذلك للتأكد من أن خلايا قابلة للحياة تبدأ في الظهور في دورة 3 ظهور في وقت مبكر من الخلايا يوحي نشاط انزيم المفرطة ويطالب نحو الحد من تركيز الانزيم.؛ ظهور الخلايا بعد دورة 3 يوحي عدم كفاية نشاط انزيم. في تجربتنا، وهذا هو المؤشر الأكثر فعالية من تركيز الانزيم الصحيح.
وقد استخدمنا هذا الأسلوب بنجاح للحصول على واحد من العضلية الحاجز بين البطين من المرضى مع HCM البطين الأيسر تدفق انسداد المسالك التي تمر الجراحية استئصال العضلة الحاجز، وكذلك من غير فشلها-المرضى لعمليات جراحية غير الضخامي 21. النتائج من تلك الورقةتبين أن myocytes معزولة مع هذا الأسلوب يمكن استخدامها لتقييم الكهربية كاملة مع تقنيات المشبك التصحيح في وقت واحد في حين أن تقييم شذوذ EC-اقتران، من خلال تسجيل ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا مع الأصباغ الفلورية. الإجراء تسجيل هنا وصف سمح لنا لجمع العديد من المعلمات الخلية الفسيولوجية مع تسجيل واحد من كل خلية، وبالتالي إنتاج كمية كبيرة من البيانات مع عدد محدود من الخلايا والعينات. بفضل هذه المزايا، وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح لوصف شذوذ وظيفية محددة من العضلية البطين من المرضى HCM، بالمقارنة مع المرضى غير الضخامي 21. شذوذ من التيارات والعمل أيون المدة المحتملة، فضلا عن الشذوذ الحركية التطوير التنظيمي داخل الخلايا كا 2 + ركوب الدراجات وحددت بشكل واضح استخدام هذه التقنية، مع استنساخ عالية. بالإضافة إلى ذلك، نحن قد أظهرت أن العلاج مع مثبطات انتقائية في وقت متأخر نا + مقابل. همي في المرضى الذين يعانون من HCM 29، والذي هو حاليا الجارية.
الإنسان توافر عينة القلب متواضع نسبيا، حتى في المراكز المتخصصة، وهذا قد يحد من تطبيق واسع لهذه التقنية. مع ذلك، ونوعية المعلومات التي يمكن الحصول عليها مباشرة من عينات المرضى على التغييرات المتعلقة المرض في وظيفة cardiomyocyte يماثل ذلك الذي يتحقق من النماذج الحيوانية من HCM وأمراض القلب الأخرى. نظرا للاختلافات واسعة بينعلم وظائف الأعضاء من myocytes القلب الإنسان والفئران، ويمكن البيانات من التقييم الوظيفي للmyocytes الإنسان تكون قيمة للغاية. كما الختام، فإننا نعتقد أن التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية يمكن أن تساهم إلى حد كبير في معرفة أمراض القلب، لأن بروتوكول لدينا يوفر إمكانية إجراء مجموعة كاملة من التقييمات وظيفية مباشرة على الخلايا من عينات المرضى، مع قيمة متعدية فوري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل الاتحاد الأوروبي (بكتيريا المشروع 241577 "القلب الكبير" برنامج الإطار الأوروبي 7، CP)، الدولية لوكسمبورغ عمليات Menarini مينارينى (AM)، تيليثون GGP07133 (CP) والعلوم جلعاد (AM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | 49601 | |
| Pyruvic acid | Sigma-Aldrich | 107360 | |
| 3-Hydroxybutyric acid | Sigma-Aldrich | 166898 | |
| Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Succinic Acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A0281 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V | Sigma-Aldrich | C9263 | |
| Proteinase, Bacterial, Type XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
| Calcium chloride solution, ~1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcium chloride 0.1 M solution | Sigma-Aldrich | 53704 | |
| Potassium methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 83000 | |
| FluoForte Reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-52015 | |
| Powerload concentrate, 100X | Life Technologies | P10020 | |
| Perfusion Fast-Step System | Warner Instruments | VC-77SP | |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528 | |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pClamp10.0 | Molecular Devices | ||
| Digestion Device | CUSTOM | CUSTOM | The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested. |
| Silicone elastomer for the digestion device's brushes | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Variable speed rotating motor for the digestion device | Crouzet | Crouzet 178-4765 | |
| Mold for brushes casting | N.A. | N.A. | The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods. |
References
- Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
- Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells. Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).
- Harding, S. E., et al. Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes. Cardioscience. 1, 49-53 (1990).
- Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
- Cohen, N. M., Lederer, W. J. Calcium current in single human cardiac myocytes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation Research. 73, 379-385 (1993).
- Virag, L., et al. The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes. Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).
- Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note. Cardioscience. 4, 111-116 (1993).
- Benitah, J. P., et al. Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).
- Verkerk, A. O., et al. Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts. Circulation. 104, 2728-2733 (2001).
- Cerbai, E., et al. Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart. Circulation. 95, 568-571 (1997).
- Kohncke, C., et al. Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Tomaselli, G. F., Marban, E. Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).
- Maron, B. J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).
- Olivotto, I., et al. The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).
- Maron, M. S., et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction. Circulation. 114, 2232-2239 (2006).
- Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
- Lippiat, J. D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).
- Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127, 575-584 (2013).
- Kuusisto, J., et al. Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 98, 1007-1013 (2012).
- Yan, G. X., et al. Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall. Circulation. 103, 2851-2856 (2001).
- Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods. The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).
- Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes. Circulation research. 78, 689-696 (1996).
- Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study. Circulation. 99, 2466-2474 (1999).
- Volders, P. G., et al. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation. 107, 2753-2760 (2003).
- Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action. Circulation Research. 68, 77-84 (1991).
- Coppini, R., et al. A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine. Circulation. 125, 1 (2012).
