Summary
हृदय रोगों के सेलुलर आधार पर वर्तमान ज्ञान ज्यादातर पशु मॉडलों पर अध्ययन पर निर्भर करता है. यहाँ हम का वर्णन है और मानव निलय मायोकार्डियम के छोटे शल्य चिकित्सा नमूने से एक व्यवहार्य cardiomyocytes प्राप्त करने के लिए एक उपन्यास विधि मान्य. मानव निलय myocytes electrophysiological अध्ययन और नशीली दवाओं के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
रोगग्रस्त दिल से cardiomyocytes कोशिका की संरचना में परिवर्तन, उत्तेजना संकुचन युग्मन और झिल्ली आयन धाराओं को शामिल जटिल remodeling प्रक्रियाओं के अधीन हैं. उन परिवर्तनों वृद्धि हुई arrhythmogenic जोखिम और हृदय रोगियों में सिस्टोलिक और डायस्टोलिक में शिथिलता के लिए अग्रणी सिकुड़ा परिवर्तन के लिए जिम्मेदार होने की संभावना है. हालांकि, हृदय रोगों में myocyte समारोह के परिवर्तन पर सबसे अधिक जानकारी पशु मॉडल से आ गया है.
यहाँ हम का वर्णन है और हृदय की सर्जरी आपरेशन के दौर से गुजर रोगियों से निलय मायोकार्डियम के छोटे शल्य नमूनों से व्यवहार्य myocytes अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मान्य. प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णन किया गया है. Electrophysiological और intracellular कैल्शियम माप इस विधि के साथ प्राप्त मानव निलय cardiomyocytes में एकल कक्ष माप की एक संख्या की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करने के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं.
प्रोटोकॉल वह रिपोर्टRe विभिन्न हृदय रोगों की उपस्थिति में मानव हृदय के कार्यात्मक परिवर्तन के सेलुलर और आणविक आधार की भविष्य में जांच के लिए उपयोगी हो सकता है. इसके अलावा, इस विधि सेलुलर स्तर पर उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए और प्रत्यक्ष translational मूल्य के साथ, मानव cardiomyocytes पर नए यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
मायोकार्डियम के electrophysiological गुणों के विच्छेदन एक हृदय myocyte अलगाव के लिए तकनीक के विकास के बाद स्पष्ट रूप से प्रगति की है. हृदय उत्तेजना संकुचन युग्मन (ईसी-युग्मन) की समझ में हाल की प्रगति में भी बरकरार ऊतक के सभी शारीरिक गुणों को बनाए रखने कि व्यवहार्य एकल cardiomyocytes अलग करने की क्षमता से संभव बनाया गया है. पैच दबाना तरीकों नियमित हृदय sarcolemmal आयन धाराओं के समारोह और औषधीय मॉडुलन अध्ययन करने के लिए कार्यरत हैं. सीए 2 + संवेदनशील रंगों के साथ intracellular कैल्शियम की गतिशीलता की रिकॉर्डिंग भी नियमित रूप से चुनाव आयोग युग्मन के शरीर क्रिया विज्ञान पर और साथ ही intracellular सीए 2 + का रोग परिवर्तन पर महत्वपूर्ण डेटा प्रदान करने, स्वस्थ और रोगग्रस्त मॉडल की एक किस्म से ही हृदय myocytes पर प्रदर्शन कर रहे हैं यांत्रिक परेशानी होती है और हृदय रोगों में वृद्धि हुई arrhythmogenic बोझ के लिए अग्रणी होमियोस्टेसिस. सूचनाइन अध्ययनों से tion नैदानिक सेटिंग में दवाओं की electrophysiological और यांत्रिक प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, transmembrane धाराओं में और हृदय की कार्य क्षमता और हृदय यांत्रिकी के विशिष्ट सुविधाओं के लिए खाते में है कि चुनाव आयोग युग्मन प्रोटीन में प्रजातियों विशिष्ट मतभेद हैं. गैर मानव स्तनधारियों से अलग myocytes की पढ़ाई biophysical गुणों और विशिष्ट transmembrane आयन चैनल और चुनाव आयोग युग्मन प्रोटीन की शारीरिक भूमिकाओं को स्पष्ट कर दिया है, जबकि इस प्रकार, वे आवश्यक रूप से मानव हृदय myocytes की प्रासंगिक मॉडल प्रदान नहीं करते हैं. मानव मायोकार्डियम से व्यवहार्य myocytes के अलगाव पूरी तरह से हृदय रोगों के pathophysiology को समझने और उपन्यास चिकित्सकीय दृष्टिकोण को मान्य करने के लिए इसलिए जरूरी है.
आलिंद उपांग अक्सर सर्जिकल प्रक्रियाओं के दौरान खारिज कर रहे हैं के रूप में मानव आलिंद ऊतक आसानी से उपलब्ध है. वयस्क मानव हृदय कार्रवाई क्षमता और आयनिक घन की प्रारंभिक मात्रात्मक पढ़ाईrrents enzymatically पृथक आलिंद कोशिकाओं 1-4 कार्यरत हैं. कार्रवाई क्षमता या पृथक वयस्क मानव निलय कोशिकाओं से धाराओं की रिकॉर्डिंग बाद में 3,5-10 सूचित किया गया है. इन अध्ययनों से अधिकांश explanted दिलों से प्राप्त की है और अलग कक्षों प्राप्त करने के लिए collagenase के लिए एक कोरोनरी धमनी खंड या excised ऊतक के अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा के जोखिम के collagenase छिड़काव या तो उपयोग कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है. इन अध्ययनों से स्वस्थ दिल से मानव निलय cardiomyocytes से और टर्मिनल दिल की विफलता के साथ रोगियों से transmembrane आयन धाराओं के एक नंबर की एक विस्तृत विशेषताओं की अनुमति दी. एल प्रकार की रिकॉर्डिंग सीए 2 + (वर्तमान मैं CA-एल) 5-7, क्षणिक जावक पोटेशियम वर्तमान (मैं) 8, शुद्ध पोटेशियम वर्तमान आवक (मैं κ1) 8, देरी करनेवाला पोटेशियम वर्तमान के विभिन्न घटकों (मैं κ ) 9 सूचित किया गया है. अग्रिम और शोधन कीअलगाव की प्रक्रिया 10,, कार्रवाई संभावित मोहलत 11 शामिल टर्मिनल दिल विफलता, में वृद्धि हुई arrhythmogenic क्षमता का आयनिक आधार का स्पष्ट लक्षण वर्णन अनुमति दी depolarizations 12 के बाद देरी और डायस्टोलिक विध्रुवण और समयपूर्व धड़कता प्रमुख अजीब मौजूदा 13 की वृद्धि हुई.
सेक्स हृदय myocytes सामान्य रूप से विभिन्न एंजाइम मिश्रण के साथ पूरे दिल, सीए 2 + सहिष्णु 14 कोशिकाओं की उच्च पैदावार का उत्पादन एक तकनीक का प्रतिगामी छिड़काव द्वारा छोटे जानवरों से अलग कर रहे हैं. ऊतक के टुकड़े से हृदय myocytes के अलगाव शायद क्योंकि कोरोनरी धमनियों का छिड़काव करके हासिल की है कि के साथ तुलना में व्यक्तिगत myocytes एंजाइमों की सीमित पहुंच के स्वाभाविक रूप से कम सफल है. क्योंकि अप्रयुक्त दाता दिल के बहुत सीमित उपलब्धता की, एक नियमित आधार पर सामान्य मानव निलय कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए केवल व्यावहारिक रास्ता एंजाइमी digestio से हैवैकल्पिक शल्य प्रक्रिया के दौरान excised अक्सर बहुत छोटे ऊतक टुकड़े के एन. अच्छी तरह से सेल स्तर पर होती है कि केवल मानव रोग मॉडल प्रत्यारोपित दिल तक पहुँच के कारण टर्मिनल दिल की विफलता है. हालांकि, टर्मिनल दिल विफलता रोगियों के एक अल्पमत में होता है और अक्सर अंतर्निहित कारण 15 से अपेक्षाकृत स्वतंत्र है जो मायोकार्डियल कोशिकाओं की गंभीर remodeling, के एक आम मार्ग शामिल है. रोग के पहले के एक गैर नाकाम रहने चरण में रोगियों से एकल cardiomyocytes के समारोह का आकलन करने की क्षमता अलग विरासत में मिला है या अर्जित की स्थिति के विशिष्ट pathophysiology को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) एक कह उदाहरण है. HCM एक सामान्य (1/500 व्यक्तियों) हृदय अतिवृद्धि द्वारा विशेषता दाय हृदय हालत की वजह से बहिर्वाह पथ बाधा और diastolic रोग से 16 arrhythmogenic जोखिम और सिकुड़ा परिवर्तन वृद्धि हुई है. HCM दिल से cardiomyocytes Uसेल संरचना में परिवर्तन (अतिवृद्धि, myofibrillar अव्यवस्था) और चुनाव आयोग युग्मन 17 से जुड़े एक जटिल remodeling प्रक्रियाओं ndergo. हालांकि, हो ची मिन्ह में myocyte रोग के सबसे अधिक जानकारी ट्रांसजेनिक पशु मॉडल से आ गया है. HCM रोगियों के केवल एक अल्पसंख्यक टर्मिनल दिल की विफलता की ओर विकसित और हृदय प्रत्यारोपण की आवश्यकता है, हो ची मिन्ह दिलों मानक तरीकों के साथ सेल अलगाव के लिए बहुत मुश्किल से ही उपलब्ध हैं. हालांकि, हो ची मिन्ह के रोगियों के कम से कम 30% प्रकुंचन (HCM) 18 के दौरान बड़े पैमाने पर सेप्टल अतिवृद्धि फेरबदल बहिर्वाह पथ रक्त प्रवाह के कारण प्रतिरोधी लक्षण विकसित. हो ची मिन्ह में बाधा के राहत के लिए सबसे प्रभावी उपलब्ध चिकित्सकीय विकल्प शल्य सेप्टल myectomy है: इस शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान, ऊपरी पट की एक चर आकार भाग ट्रांस महाधमनी दृष्टिकोण से निकाल दिया जाता है. Hypertrophied पट के इस हिस्से को ताजा ऊतक से सेल अलगाव के लिए इसलिए उपलब्ध है.
मानव ventricula के अलगाव के लिए एक विधिआर एकल, छोटे ट्रांसवेनस endomyocardial बायोप्सी नमूनों से myocytes पहले से विकसित और 19 प्रकाशित किया गया है. हम सेप्टल myectomy और वाल्व प्रतिस्थापन प्रक्रियाओं के दौर से गुजर रोगियों के दौर से गुजर HCM के साथ रोगियों सहित हृदय शल्य चिकित्सा के दौर से गुजर रोगियों से निलय मायोकार्डियम के नमूनों से ही सेप्टल myocytes अलग करने के लिए एक विधि लागू. अलगाव प्रोटोकॉल, प्रतिनिधि electrophysiological और सीए 2 + प्रतिदीप्ति का विस्तृत विवरण के अलावा माप पृथक मानव निलय myocytes की व्यवहार्यता और पैच दबाना और intracellular सीए 2 + पढ़ाई की व्यवहार्यता का प्रदर्शन, प्रस्तुत कर रहे हैं.
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Protocol
मानव ऊतक पर प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल Careggi विश्वविद्यालय अस्पताल (; 2009 नए सिरे से मई 2006/0024713) की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. प्रत्येक मरीज को लिखित सूचित सहमति दे दी है.
1. समाधान और उपकरण तैयारी
समाधान 1 तालिका में वर्णित हैं. सेल अलगाव की प्रक्रिया का एक सरलीकृत फ्लोचार्ट चित्र 1 में पाया जाता है.
| समाधान | सी.पी. | डीबी | KB | टीबी | पुनश्च | EB1 | EB2 | |
| अभिकर्मक (मिमी) | के.एच. 2 पीओ 4 | 50 | ||||||
| 4 MgSO | 8 | 1.2 | 5 | 1.2 | 1.2 | |||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | |||||
| एक यौगिक जो न्यूक्लिइक अम्ल से प्राप्त होता है जो शर्करा तथा एडीनाइन से बना होता है, डी - राइबोज | 5 | |||||||
| ग्लूकोज | 140 | 10 | 20 | 10 | 10 | 10 | ||
| mannitol | 100 | |||||||
| बैल की तरह | 10 | 20 | 5 | 20 | 20 | |||
| NaCl | 113 | 136 | 113 | 113 | ||||
| KCl | 4.7 | 85 | 5.4 | 25 | 4.7 | 4.7 | ||
| 2 MgCl | </ P> | 1.2 | 5 | |||||
| के.एच. 2 पीओ 4 | 0.6 | 30 | 0.6 | 0.6 | ||||
| ना 2 4 HPO | 0.6 | 0.6 | 0.6 | |||||
| 3 NaHCO | 12 | 12 | 12 | |||||
| KHCO 3 | 10 | 10 | 10 | |||||
| ना पाइरूवेट | 4 | 4 | 4 | |||||
| BDM | 10 | 10 | 10 | |||||
| BHBA | 5 </ P> | |||||||
| succinic एसिड | 5 | |||||||
| EGTA | 0.5 | |||||||
| कश्मीर 2-एटीपी | 2 | |||||||
| पाइरुविक एसिड | 5 | |||||||
| creatine | 5 | |||||||
| KMES | 115 | |||||||
| एंजाइमों (यू / एमएल) | Collagenase प्रकार वी | 250 </ P> | 250 | |||||
| प्रोटीज प्रकार XXIV | 4 | |||||||
| पीएच | 7.4 KOH | 7.3 NaOH | 7.1 KOH | 7.35 NaOH | 7.2 KOH | 7.3 NaOH | 7.3 NaOH | |
.. तालिका 1 नमूना संग्रह, सेल अलगाव और myocytes के कार्यात्मक विशेषता सी.पी. = cardioplegic समाधान के लिए इस्तेमाल किया समाधान; डीबी = हदबंदी बफर; KB = क्राफ्ट-Bruhe समाधान; टीबी = Tyrode बफर; पुनश्च = पिपेट समाधान; EB1 = एंजाइम बफर 1; EB2 = एंजाइम बफर 2.
- Cardioplegic (सीपी) समाधान तैयार करें. सी.पी. समाधान करने के लिए 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- सीए 2 + मुक्त हदबंदी बफर (डीबी) तैयार करें. यह समाधान दिन के भीतर किया जाना चाहिए.
- क्राफ्ट-Bruhe (के.बी.) समाधान तैयार करें. KB समाधान करने के लिए 1 मूत के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता हैकश्मीर.
- सीए 2 + मुक्त Tyrode बफर (टीबी) तैयार करें. यह समाधान दिन के भीतर किया जाना चाहिए.
- उपयोग करने से पहले सिरिंज फिल्टर का उपयोग सभी के समाधान तक.
- पाचन डिवाइस (चित्रा 2), एक विद्युत मोटर द्वारा घुमाया जिनमें से एक सिलिकॉन elastomer के दो का सामना करना पड़ ब्रश से बना एक स्क्रैप कंटेनर तैयार करें. पाचन डिवाइस कस्टम बनाया है. पाचन डिवाइस पर विवरण चित्रा 8 में कर रहे हैं; डिवाइस की छवियों आंकड़े 2 सी और 2 डी में हैं. 70% इथेनॉल और पानी के साथ ऊतक चैम्बर धो लें.
मायोकार्डियल नमूने की 2. संग्रह और प्रसंस्करण
- एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में cardiplegic (सीपी) समाधान के 40 एमएल डालो और यह सेल अलगाव प्रयोगशाला को ऑपरेटिव कक्ष से नमूना परिवहन के लिए बर्फ में स्टोर.
- बर्फ ठंड से धो, तुरंत छांटना के बाद ऑपरेटिव कक्ष से निलय दौरे नमूना इकट्ठासी.पी. समाधान और यह ट्यूब में स्टोर. ओपन हार्ट सर्जरी के दौरान ऊपरी इंटर वेंट्रिकुलर पट, भार> 100 मिलीग्राम से excised endocardial नमूनों का प्रयोग करें.
- तेजी से प्रयोगशाला क्षेत्र के लिए नमूना हस्तांतरण; नमूना छांटना से 10 मिनट के भीतर नमूना प्रसंस्करण शुरू करते हैं.
- बर्फ के ठंडे सी.पी. बफर में नमूना रखते हुए, ध्यान से एक stereomicroscope के तहत ठीक कैंची का उपयोग endocardial तांतव परत को हटा दें; बाद में, छोटे टुकड़ों (लंबी 2-3 मिमी) को दौरे के ऊतकों में कटौती. ऊतक नमूना आकार पर निर्भर करता है, प्रत्येक अलगाव के लिए 100 मिलीग्राम और 1 ग्राम के बीच निलय मायोकार्डियम की कुल राशि में कटौती.
- ऊतक क़ीमा बनाने की समाप्ति पर, स्वच्छ बर्फ के ठंडे सी.पी. समाधान के साथ, पाचन डिवाइस में दौरे हिस्सा हस्तांतरण. कोई अधिक कुल ऊतक के ग्राम 1 से उपयोग कर, दौरे मात्रा के साथ दो सिलिकॉन ब्रश के बीच पूरी मात्रा (3-4 एमएल) भरने से बचें.
3. धुलाई और दौरे का हिस्सा पाचन
- पिछाड़ीहिस्सा पाचन डिवाइस की scraping कक्ष में स्थानांतरित कर रहे हैं एर, ठंड सीए 2 + मुक्त हदबंदी बफर (डीबी) के साथ चैम्बर में सी.पी. बफर बदल जाते हैं.
- स्नान में गर्म पानी (चित्रा 1) के साथ संपर्क में होने का चैम्बर के लिए आदेश में, एक थर्मास्टाटिक स्नान में पाचन डिवाइस रखें. 37.5 डिग्री सेल्सियस के लिए स्नान करना और धीरे धीरे ऊतक कक्ष का तापमान बढ़ाने के लिए, यह मोड़ पर. 1 क्रांति / सेकंड के लिए रोटेशन की गति सेटिंग, पाचन डिवाइस की मोटर चालू करें.
- हर 8 मिनट साफ DB के साथ कक्ष में समाधान बदलते, DB के साथ 3 धोने चक्र पूरा करें. डीबी (37 डिग्री सेल्सियस) गरम और ऑक्सीजन दौरे मात्रा के साथ संपर्क में हो रहा से पहले संतृप्त है.
- डीबी समाधान करने Collagenase प्रकार वी और 4 यू / एमएल Protease प्रकार XXIV की 250 यू / मिलीलीटर जोड़कर एंजाइम बफर 1 (EB1) तैयार करें. डीबी समाधान करने के लिए 250 यू / एमएल Collagenase प्रकार वी जोड़कर एंजाइम बफर 2 (EB2) तैयार करें. (37 डिग्री सेल्सियस) और oxygenat वार्म अपई EB1 और EB2.
- (37 डिग्री सेल्सियस) 100% ऑक्सीजन EB1 साथ घूर्णन पाचन डिवाइस में पाचन की दो 12 मिनट के चक्र को पूरा करें. प्रत्येक चक्र में, EB1 की ~ 3 मिलीलीटर का उपयोग करें. पिपेट आकांक्षा से समाधान निकालें और प्रत्येक चक्र के बाद यह त्यागें.
- सेल संग्रह और ~ बफ़र्स eluting के लिए ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) KB समाधान की 80 मिलीलीटर के लिए 6 से 15 मिलीलीटर ट्यूबों तैयार.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 एमएल 100% ऑक्सीजन EB2 साथ एक पहले 15 मिनट पाचन चक्र प्रदर्शन करना पाचन चक्र के बाद, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में पहले अलग myocytes युक्त समाधान इकट्ठा करने और 12 एमएल ठंड KB समाधान के साथ सेल निलंबन पतला. कमरे के तापमान पर ट्यूब फ्लैट स्टोर.
- निम्नलिखित पाचन चक्र के लिए collagenase वी की एकाग्रता को आधा करने के क्रम में DB के एक बराबर राशि के साथ शेष EB2 समाधान पतला.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिलीलीटर EB2 साथ अन्य 5 से 12 मिनट पाचन चक्र प्रदर्शन; इनमें से प्रत्येक के बाद एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में बफर युक्त myocyte के लिए इकट्ठा करने और12 एमएल KB समाधान के साथ पतला. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 6 सेल युक्त ट्यूबों स्टोर.
4. सेल मेजबान और सीए 2 + Readaptation
- 20 मिलीलीटर सीए 2 + मुक्त Tyrode बफर (टीबी) के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin (BSA) जोड़ें. समाधान तक.
- व्यवस्थित करने के लिए myocytes मजबूर करने के लिए 5 मिनट के लिए 100 XG पर छह myocyte युक्त शंक्वाकार ट्यूबों अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालें और आरटी पर टीबी युक्त बीएसए की (उपज के आधार पर 1-3 मिलीलीटर) एक चर राशि के साथ प्रत्येक ट्यूब में कोशिकाओं resuspend.
- धीरे - धीरे 100 mmol / एल 2 CaCl समाधान के छोटे aliquots जोड़कर सेल युक्त बफर में सीए 2 + एकाग्रता में वृद्धि. पहले और दूसरे चरण में सीए 2 + एकाग्रता क्रमश: 50 μmol / एल और 100 μmol / एल अप करने के लिए उठाया है. निम्नलिखित सीए 2 + अलावा कदम हर 5 मिनट प्रदर्शन कर रहे हैं और एकाग्रता हर कदम टी में 100 μmol / एल से उठाया है0.9 mmol / एल की OA अंतिम एकाग्रता
- अलगाव की प्रक्रिया की उपज का आकलन करें. एक माइक्रोस्कोप की गिलास नीचे कक्ष पर myocyte युक्त समाधान के 0.5 मिलीलीटर स्थानांतरण. 10x उद्देश्य बढ़ाई 15 माइक्रोस्कोप क्षेत्रों का मूल्यांकन और (स्पष्ट स्त्रिअतिओन्स और कोई महत्वपूर्ण समावेशन के साथ जैसे छड़ी के आकार की कोशिकाएं, चित्रा 2) स्वस्थ myocytes के प्रतिशत की गणना. उम्मीद की उपज 20% के आसपास है.
पृथक cardiomyocytes की 5. कार्यात्मक मूल्यांकन.
निम्नलिखित प्रोटोकॉल कार्रवाई क्षमता और intracellular सीए 2 + अपशिष्टों के एक साथ रिकॉर्डिंग सहित मानव cardiomyocyte कार्यात्मक मूल्यांकन का एक उदाहरण है.
- छिद्रित पैच विन्यास में पैच दबाना प्रयोगों के लिए विंदुक समाधान (पी एस) तैयार करें. समाधान के लिए 3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
- सीए 2 + मुक्त Tyrode बफर (टीबी) के लिए 1.8 mmol / एल 2 CaCl जोड़ें. यूएसई पैच दबाना / प्रतिदीप्ति प्रयोगों के दौरान cardiomyocytes की superfusion के लिए इस समाधान.
- एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरण सेल निलंबन के 1 मिलीग्राम और 10 μmol / एल Fluoforte और 10 μl Powerload ध्यान लगाओ जोड़ें. आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. बाद में, ऊर्ध्वाधर स्थिति में ट्यूब सेट और 5 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए सेल छोड़; सीए में कोशिकाओं resuspend 2 + टीबी से युक्त.
- (: 37 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस तापमान) एक छोटे से (0.5 मिलीलीटर) के लिए सेल निलंबन के 0.25 मिलीलीटर हस्तांतरण, तापमान नियंत्रित माइक्रोस्कोप 0.3 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर एक गर्म microperfusor प्रणाली के साथ गंभीरता से superfused रिकार्डिंग कक्ष, घुड़सवार.
- एक micropipette खींचने का उपयोग, 3 से 5 माइक्रोन का एक टिप व्यास और पी एस के साथ भर दिया जब 3 एम 4.5 के प्रतिरोध के साथ पैच दबाना pipettes तैयार करते हैं.
- पुनश्च (250 माइक्रोग्राम / एमएल) के एक बैच के लिए Amphotericin बी जोड़ें और इलेक्ट्रोड को भरने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं.
- समावेशन से रहित स्पष्ट स्त्रिअतिओन्स साथ एक छड़ी के आकार का सेल,, के लिए चयन करेंउपयोग प्रतिरोध नीचे 20 MΩ बूँदें जब तक RM, 5 से 10 मिनट Giga सील और इंतजार.
- उत्तेजना के विभिन्न आवृत्तियों (0.2 हर्ट्ज, 0.5 हर्ट्ज और 1 हर्ट्ज, प्रत्येक आवृत्ति पर 1 मिनट) पर कम दालों (<3 मिसे) का उपयोग वर्तमान दबाना मोड में कार्रवाई क्षमता को प्रकाश में लाना. रिकॉर्डिंग चरण के दौरान, 492 ± 3 एनएम पर उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी पर बारी और 505-520 एनएम पर Fluoforte प्रतिदीप्ति का पता लगाने. प्रतिदीप्ति मोल और Digidata 1440A और pClamp 10.0 सॉफ्टवेयर का उपयोग संभावित संकेतों झिल्ली. अगर जरूरत रिकॉर्डिंग अनुक्रम को कई बार दोहराने; हालांकि, प्रत्येक कक्ष के लिए 15 मिनट से नीचे कुल रिकॉर्डिंग समय रहते हैं.
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Representative Results
गैर नाकाम रहने गैर hypertrophic शल्य चिकित्सा के रोगियों के 21 की तुलना में ऊपर वर्णित विधि, myectomy ऑपरेशन कराना पड़ा जो hypertrophic cardiomyopathy (HCM) के साथ रोगियों की interventricular पट से अलग cardiomyocytes के कार्यात्मक असामान्यताएं चिह्नित करने के लिए नियुक्त किया गया था. इस खंड में निहित परिणाम है कि काम 21 से निकाली गई है और इस तकनीक को हृदय रोग की स्थिति में दौरे सेल समारोह के परिवर्तन को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक उदाहरण के रूप में यहाँ दिखाया गया है.
हो ची मिन्ह के साथ एक रोगी से एक प्रतिनिधि शल्य नमूना चित्रा 2A में दिखाया गया है. सर्जिकल नमूने का आकार और endocardial रेशेदार धारियाँ की मोटाई के मामले में अत्यंत चर रहे थे. हम HCM नमूनों से प्रत्येक अलगाव की प्रक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है कि दौरे के ऊतकों की राशि 1G के आसपास थी. इसके बजाय, नियंत्रण के नमूने लिए इस्तेमाल ऊतक की मात्रा (100-500 मिग्रा.) छोटा था, लोव के कारणआर ऊतक उपलब्धता. ऊतक के भीतर व्यवहार्य दौरे कोशिकाओं के रिश्तेदार राशि HCM मायोकार्डियम में कम हो जाता है और endomyocardial फाइब्रोसिस 22 की वृद्धि हुई है, शायद इसलिए क्योंकि उपज, नियंत्रण के नमूने HCM के लिए सम्मान के साथ कार्रवाई कर रहे थे, जब काफी अधिक था. इन अवलोकन से हम व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए ऊतक के लिए आवश्यक राशि दौरे रोग की अनुपस्थिति या उपस्थिति के आधार पर चर हो सकता है कि संपन्न हुआ.
चित्रा 2 बी के रूप में दिखाया नमूने छोटी मात्रा में काट रहे थे. बाद में, हिस्सा पाचन डिवाइस (चित्रा -2) के कक्ष में स्थानांतरित कर दिया और चित्रा (2 डी) ऊपर वर्णित के रूप में एकल कक्ष अलगाव के लिए इस्तेमाल किया गया. एक interventricular पट नमूना से वर्णित सेल अलगाव की प्रक्रिया का उपयोग कर प्राप्त एक सेल निलंबन के प्रतिनिधि photomicrographs आंकड़े 3 ए और 3 बी में दिखाया गया है; एकल निलय सीए का बढ़ाया छवियोंrdiomyocytes आंकड़े -3 सी-3F में चित्रित कर रहे हैं. हो ची मिन्ह के नमूनों से cardiomyocytes कार्रवाई क्षमता और नयाचार अनुभाग में वर्णित के रूप में intracellular सीए 2 + विविधताओं के एक साथ रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया गया. 3 विभिन्न आवृत्तियों पर उत्तेजना के दौरान झिल्ली वोल्टेज (ऊपर) और intracellular सीए 2 + (नीचे) दिखा प्रतिनिधि एक साथ निशान चित्रा 4 में दिखाया गया है: ये निशान एक HCM नमूना से अलग एक एकल cardiomyocyte से दर्ज किए गए.
पैच दबाना अध्ययनों के परिणामों उत्तेजना के विभिन्न आवृत्तियों पर दर्ज की गई कार्रवाई संभावित अवधि (APD) स्पष्ट रूप से नियंत्रण (चित्रा 5A और 5 ब) की तुलना में HCM (HCM cardiomyocytes) के साथ रोगियों से cardiomyocytes में लंबे समय तक किया गया था कि पता चला है. Β-adrener: 7 एम (चित्रा 5C) - पृथक myocytes में शारीरिक प्रतिक्रियाओं के रखरखाव का पता लगाने के लिए, हम 10 पर इस्तेमाल किया, isoproterenol के प्रभाव का परीक्षण कियाजीआईसी उत्तेजना नियंत्रण myocytes में उम्मीद एपी छोटा करने का उत्पादन किया. लंबे समय तक APD जल्दी depolarisations (ईएडीएस) 23 के बाद का खतरा बढ़ जाता है के बाद से, ईएडीएस की घटना, एपी के पठार चरण के दौरान के रूप में सहज depolarisations का पता चला, मापा गया था. हो ची मिन्ह cardiomyocytes में, ईएडीएस नियंत्रण (चित्रा 5D) की तुलना में काफी अधिक अक्सर थे. कई ईएडीएस दिखा प्रतिनिधि ट्रेस चित्रा 5E में दिखाया गया है
अब APD और वर्तमान आयन असामान्यताएं HCM cardiomyocytes में उत्तेजना संकुचन युग्मन तंत्र को प्रभावित कर सकता है कि क्या परीक्षण करने के लिए, intracellular सीए 2 + विविधताओं के गुण उत्तेजना दौरान मूल्यांकन किया गया. 2 + यात्रियों वर्तमान दबाना परिस्थितियों में पैदा सीए के आयाम cardiomyocytes (चित्रा 6A) पर नियंत्रण की तुलना HCM में समान थे. इसके विपरीत, सीए 2 + क्षणिक के कैनेटीक्स, चित्रा (HCM में काफी लंबे समय तक थे6B). इसके अतिरिक्त, intracellular डायस्टोलिक सीए 2 + एकाग्रता cardiomyocytes (चित्रा 6C) पर नियंत्रण की तुलना HCM में स्पष्ट रूप से अधिक था और उत्तेजना आवृत्ति में वृद्धि पर अधिक प्रमुखता से वृद्धि हुई है.
विशेष रूप से, मानव निलय नमूनों से इस विधि के साथ अलग cardiomyocytes भी सफलतापूर्वक intracellular सीए + और / या सेल बिजली के क्षेत्र उत्तेजना के दौरान रिकॉर्डिंग छोटा (चित्रा, विशिष्ट transmembrane धाराओं (चित्रा 7A) का वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग सहित अन्य अनुप्रयोगों के लिए 2 नियोजित किया गया है 7B) और confocal माइक्रोस्कोपी और झिल्ली ही सीमित फ्लोरोसेंट लेबल (चित्रा 7C) का उपयोग sarcolemma के ठीक संरचना का मूल्यांकन.
सेल अलगाव की प्रक्रिया की 1. फ्लोचार्ट चित्रा.
सेप्टल myectomy ऑपरेशन कराना पड़ा है जो हो ची मिन्ह के साथ एक रोगी से निलय मायोकार्डियम का एक नमूना दिखा सेल अलगाव के लिए निलय नमूनों की चित्रा 2. प्रसंस्करण. (ए) प्रतिनिधि छवि. एक निलय शल्य नमूना से निलय ऊतक में कटौती की कैलिब्रेशन बार = 5 मिमी. (बी) विखंडू, सेल अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. कैलिब्रेशन बार = पाचन डिवाइस के 5mm. (सी) छवियों. इस उपकरण में दो सिलिकॉन ब्रश के साथ एक पाचन कक्ष शामिल हैं: बेहतर ब्रश एक मोटर के द्वारा ले जाया गया जब बारी बारी से करने में सक्षम है निलय ऊतक के enzymatic पाचन के दौरान thermostated स्नान में पाचन डिवाइस दिखा (डी) छवि.. p>
चित्रा 3. पृथक मानव निलय cardiomyocytes. (एबी) पैनल प्रतिनिधि cardiomyocyte निलंबन दिखा दो माइक्रोस्कोप क्षेत्रों (10x उद्देश्य) के photomicrographs से पता चलता है. ध्यान से, कोशिकाओं के बारे में 30% छड़ी के आकार के हैं और स्पष्ट स्त्रिअतिओन्स दिखा. कैलिब्रेशन बार = 100 माइक्रोन. (सीई) एक HCM रोगी (40x उद्देश्य) का एक नमूना से अलग 3 मानव cardiomyocytes के प्रतिनिधि छवियाँ. कैलिब्रेशन बार = रिकॉर्डिंग के लिए पैच पिपेट की नोक से छुआ एक मानव निलय cardiomyocytes दिखा 20μm. (एफ) छवि. कैलिब्रेशन बार = 20μm.
es.jpg "src =" / files/ftp_upload/51116/51116fig4.jpg "/>
झिल्ली क्षमता (ऊपर) और intracellular कैल्शियम दिखा चित्रा 4. झिल्ली क्षमता और intracellular कैल्शियम की एक साथ रिकॉर्डिंग. प्रतिनिधि ट्रेस (नीचे) एक HCM नमूना से अलग एक भी myocyte से दर्ज की गई. myocyte पैच 0.2 हर्ट्ज पर पिपेट, 0.5 हर्ट्ज और 1 हर्ट्ज के माध्यम से प्रेरित है.
चित्रा 5. HCM नमूनों से निलय cardiomyocytes में कार्रवाई क्षमता का बदलाव. (ए) प्रतिनिधि सही, काला निशान (0.2 हर्ट्ज, 0.5 हर्ट्ज और एक नियंत्रण (बाएँ, ग्रे निशान) myocyte और एक HCM myocyte से 1 हर्ट्ज पर हासिल कार्रवाई क्षमता आरोपित ). (बी) औसत संभावित कार्रवाई हो ची मिन्ह में 90% repolarization (APD90%) में अवधि (n = 81) औरHCM रोगियों और नियंत्रण के नमूने से cardiomyocytes में ईएडीएस के नियंत्रण cardiomyocytes (एन = 29) का परीक्षण तीन पेसिंग आवृत्तियों पर. (सी) घटना. (डी) अनुपस्थिति (निरंतर ट्रेस) में एक नियंत्रण myocyte से 0.5Hz पर कार्रवाई क्षमता आरोपित और 10 -7 एम isoproterenol की मौजूदगी में. (ई) तीर से चिह्नित (जल्दी depolarizations, ईएडीएस के बाद) पठार चरण के दौरान होने वाली कई सहज depolarizations, दिखाने में कोई HCM रोगी से एक cardiomyocyte की झिल्ली क्षमता दिखा प्रतिनिधि ट्रेस. उत्तेजनाओं का पता लगाने के नीचे छोटी लाइनों द्वारा चिह्नित हैं. ** = पी <0.01 unpaired टी परीक्षण. चित्रा के सभी पैनलों Coppini एट अल से अनुमति के साथ संशोधित कर रहे हैं. 2012 21.
आंकड़ा6. HCM नमूनों से निलय cardiomyocytes में कैल्शियम यात्रियों का बदलाव. (ए) प्रतिनिधि कैल्शियम यात्रियों एक नियंत्रण myocyte में पैच विंदुक (ग्रे) और एक HCM सेल (काला) के माध्यम से 0.2 हर्ट्ज पर उत्तेजना के दौरान हासिल आरोपित. विशेष रूप से, सीए 2 + यात्रियों के आयाम दो कोशिकाओं के बीच अलग नहीं है (बी) HCM में सीए 2 + यात्रियों के कैनेटीक्स (एन = 42) और नियंत्रण (एन = 24) cardiomyocytes:. समय उत्तेजना से क्षणिक (टी.पी. चोटी ), 50% क्षय (T50%) और क्षणिक के 90% क्षय (T90%) के लिए पीक समय पर शिखर से समय दिखाए जाते हैं. (सी) intracellular सीए दिखा प्रतिनिधि लंबे निशान HCM में 3 विभिन्न आवृत्तियों पर उत्तेजना के दौरान 2 + और हो ची मिन्ह myocyte में उच्च पेसिंग दरों में वृद्धि की डायस्टोलिक सीए 2 + पर प्रकाश डाला नियंत्रण myocytes,. (डी) 3 अलग पेसिंग आरए पर जवाब डायस्टोलिक सीए 2 हो ची मिन्ह में + (n = 42) और नियंत्रण (एन = 24) cardiomyocytestes. ** = पी <0.01 unpaired टी परीक्षण. चित्रा के सभी पैनलों Coppini एट अल से अनुमति के साथ संशोधित कर रहे हैं. 2012 21.
.. मानव निलय myocytes का उपयोग चित्रा 7 अतिरिक्त प्रयोगात्मक आवेदन पत्र (ए) वाम: प्रतिनिधि एल प्रकार सीए दिखा निशान आरोपित 2 + वर्तमान (विवरण के लिए 21 देखें) एक विशिष्ट प्रोटोकॉल के साथ अलग झिल्ली वोल्टेज पर वोल्टेज क्लैंप के तहत दर्ज की गई है. अधिकार: अलग झिल्ली में HCM नमूनों से अलग 18 कोशिकाओं से औसत एल प्रकार सीए 2 + वर्तमान शिखर घनत्व. Voltages. (बी) Intracellular सीए 2 + ट्रेस 1 हर्ट्ज पर बिजली के क्षेत्र उत्तेजना के दौरान एक निलय myocyte से दर्ज की गई. एक निलय cardiom (सी) confocal छविएक फ्लोरोसेंट झिल्ली बाध्य डाई (Di-3 ANEPPDHQ) के साथ दाग एक HCM नमूना से yocyte. ध्यान से, ttubules का घनत्व HCM में रूपात्मक झिल्ली remodeling सुझाव, कम है.
चित्रा 8. पाचन डिवाइस. पाचन डिवाइस की (एबी) घटकों. एक चर गति घूर्णन मोटर एक दूसरे से एक से जुड़ा है, जो पहली बार एक प्लास्टिक बांह से जुड़ा है. दूसरा प्लास्टिक हाथ हटाने योग्य और ऊपरी ब्रश से जुड़ा है. ब्रश सिलिकॉन elastomer के साथ बना रहे हैं. ~ 1.5 मिमी दूरी पर 100 छेद के साथ एक PTFE नकारात्मक मोल्ड, तरल सिलिकॉन से ब्रश कास्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. मोल्ड के भीतर अंतरिक्ष 1.9 सेमी व्यास की है और एक ही आकार के ब्रश का निर्माण मोटी 6 मिमी, है. मोल्ड के एक तरफ स्थित छेद 8 मिमी लंबे बाल का उत्पादन करने के क्रम में किया जाता है जब ब्रशसांचे से डाली और हटा रहे हैं. तरल सिलिकॉन मोल्ड में डाल दिया है, के बाद कम से कम 48 घंटे पूरा सख्त के लिए आवश्यक हैं. ब्रश एक ग्लास ट्यूब के अंदर बढ़ रहे हैं (भीतरी व्यास = 2 सेमी, मोटाई 2 मिमी) और दो ब्रश और कांच की दीवारों द्वारा गठित बेलनाकार कक्ष भली भांति बंद करके दो रबर O-छल्ले से बंद है. ब्रश एक दूसरे को धक्का दिया करने की जरूरत है; नीचे एक ऊपरी एक मोटर हाथ की प्लास्टिक अंत तक चिपके है, जबकि एक प्लास्टिक के आधार पर चिपके हैं और इस प्रकार बारी बारी से करने में सक्षम है. (सी) ऊपरी ब्रश के विचारों को बढ़ाया. ध्यान से, ब्रश यह (डी) चैंबर के घटकों उनकी अंतिम स्थिति में दिखाया गया है बारी बारी से करने के लिए आदेश में मोटर बांह के अंत से चिपके होने की जरूरत है. दो ब्रश (वास्तविक कक्ष) के बीच अंतरिक्ष ~ 2 सेमी चौड़ा है और उच्च 7-8 मिमी; इस अंतरिक्ष आसानी दौरे के ऊतकों की 1 ग्राम के लिए ऊपर अलावा अन्य बफर के 3-4 मिलीलीटर, फिट बैठता है.
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Discussion
हम वर्णित और मानव निलय मायोकार्डियम की शल्य चिकित्सा के नमूनों से व्यवहार्य myocytes अलग करने के लिए एक विधि पुष्टि की है. सफलतापूर्वक रोगग्रस्त निलय मायोकार्डियम से एक व्यवहार्य myocytes की जुदाई विकसित की है और देखते ठीक किया गया था की अनुमति के लिए आलिंद शल्य चिकित्सा नमूने, तकनीक से अलग कक्षों के लिए इस्तेमाल किया गया था कि पहले वर्णित प्रोटोकॉल से शुरू. प्रारंभिक रिपोर्टों के चुनिंदा, शारीरिक उत्तेजनाओं 8,24 को बदल electrophysiological गुणों और प्रतिक्रियाओं में जिसके परिणामस्वरूप, पोटेशियम धाराओं repolarizing बिगड़ा आलिंद और निलय ऊतक की मात्रा से एकल cardiomyocytes के अलगाव कोरोनरी छिड़काव के माध्यम से बफर युक्त एंजाइम के वितरण में देरी करनेवाला ख़राब नहीं था, जबकि पता चला है कि अलग कोशिकाओं 25 में धाराओं. दुर्भाग्य से, निलय मायोकार्डियम के सर्जिकल नमूनों से मानव निलय myocytes के अलगाव कोरोनरी शाखाओं की अखंडता के बाद कोरोनरी छिड़काव द्वारा नहीं किया जा सकता हैexplanted दिल से भिन्न, खो दिया है. हमारे विधि का उपयोग दौरे मात्रा से अलग cardiomyocytes पेसिंग आवृत्ति के बदलाव के जवाब में कार्रवाई संभावित अवधि का स्पष्ट अनुकूलन प्रदर्शन या एड्रीनर्जिक उत्तेजना β के लिए. घटित करने के लिए इस तरह की प्रतिक्रियाओं के लिए आदेश में देरी करनेवाला पोटेशियम चैनलों की अखंडता हमारे अलगाव विधि से प्रभावित नहीं है उन चैनलों के समग्र अखंडता का सुझाव दे, 26-28 आवश्यक है. इसके अलावा, हमारे तरीके से अलग कक्षों नियमित electrophysiological प्रतिक्रियाओं (आंकड़े 3 और 4) दिखाने के लिए, लेकिन यह भी कैल्शियम की उम्मीद आकार और अवधि के यात्रियों (आंकड़े 3 और 5) और नियमित sarcomeric संगठन (चित्रा 2) और छोटा गुण (नहीं प्रदर्शित न केवल ) दिखाया गया है, उन कोशिकाओं के समग्र संरचनात्मक अखंडता इस अलगाव प्रक्रिया द्वारा संरक्षित है कि सुझाव. पिछली पर इस विधि का मुख्य उन्नतितकनीक अत्यधिक क्षति के बिना एक सेल जुदाई की अनुमति, ऊतक मात्रा की कोमल यांत्रिक सरगर्मी जो उद्धार नए डिजाइन पाचन डिवाइस द्वारा प्रदान की जाती है. इसके अलावा, पाचन डिवाइस का उपयोग हमें सेल अलगाव बफर में एंजाइमों की एक कम एकाग्रता को रोजगार के लिए अनुमति दी; विशेष रूप से हम पहले की रिपोर्ट तरीकों 24 के साथ तुलना में unselective प्रोटीज का एक बहुत कम एकाग्रता का उपयोग कर रहे हैं. युक्ति कस्टम हमारी प्रयोगशाला में किया जाता है: इमारत schematics 8 चित्र में प्रस्तुत कर रहे हैं.
साधारण डिजाइन और संरचना इस प्रोटोकॉल का एक सफल परिणाम के लिए दोहराने के लिए यह बहुत आसान बना देता है. 8 चित्र कथा भी सिलिकॉन ब्रश का निर्माण और scraping कक्ष के निर्माण के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं का वर्णन है. पाचन डिवाइस के फायदे के कारण, व्यवहार्य कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत उच्च संख्या (100 मिलीग्राम जितनी कम) निलय ऊतक का एक अपेक्षाकृत कम राशि से प्राप्त किया जा सकता है.पहले प्रकाशित विधि 19 छोटे बायोप्सी (यहां तक कि <20 मिलीग्राम) से एक कैल्शियम सहिष्णु myocytes प्रदान करने के लिए दिखाया गया था. हालांकि, सूचना दी myocyte उपज बहुत कम था और लेखकों कि विधि के साथ अलग कोशिकाओं intracellular कैल्शियम साइकिल और सिकुड़ा समारोह के लक्षण वर्णन के लिए संभव थे कि क्या नहीं दिखा था. Interventricular पट के छोटे हिस्से को अक्सर वाल्व प्रतिस्थापन प्रक्रियाओं (जैसे. महाधमनी वाल्व रिप्लेसमेंट) के दौरान excised हैं के बाद से इस तकनीक को कई शल्य चिकित्सा के रोगियों के लिए संभावित लागू है. हालांकि, एक सफल अलगाव प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण बिंदु ऑपरेटिंग कमरे से नमूना संग्रह के बाद प्रक्रिया की एक तेजी से दीक्षा है. इसलिए, यह उपयोगी हो करने के लिए इस तकनीक के लिए आदेश में, हृदय शल्य चिकित्सा क्लिनिक के पास होने के लिए सेल प्रयोगशाला के लिए आवश्यक है. इसके अतिरिक्त, एक उचित एंजाइम गतिविधि एक सफल अलगाव के लिए भी अत्यंत महत्वपूर्ण है. चूंकि unselective प्रोटीज गतिविधि ओच प्रत्येक collagenase बैच आमतौर पर पूरी तरह से परीक्षण नहीं किया है, प्रत्येक स्थल सेल अलगाव के दौरान अलग ढंग से प्रदर्शन करने की संभावना है. इसलिए यह सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के क्रम में ठीक धुन collagenase के अंतिम एकाग्रता के लिए आवश्यक है. हम व्यवहार्य कोशिकाओं चक्र 3 पर दिखने शुरू यकीन है कि आदेश में, प्रत्येक चक्र में खुर्दबीन के नीचे सेल निलंबन देख सुझाव है कि कोशिकाओं के प्रारंभिक उपस्थिति अत्यधिक एंजाइम गतिविधि से पता चलता है और एंजाइम एकाग्रता की कमी की ओर संकेत देता है.; चक्र 3 के बाद कोशिकाओं की उपस्थिति अपर्याप्त एंजाइम गतिविधि से पता चलता है. हमारे अनुभव में, यह सही एंजाइम एकाग्रता का सबसे प्रभावी सूचक है.
हम सफलतापूर्वक बाएं निलय बहिर्वाह पथ बाधा शल्य सेप्टल myectomy के दौर से गुजर, साथ ही गैर नाकाम रहने गैर hypertrophic शल्य चिकित्सा रोगियों 21 से साथ HCM रोगियों की अंतर - वेंट्रिकुलर पट से एकल cardiomyocytes प्राप्त करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है. उस कागज से परिणामएक साथ फ्लोरोसेंट रंगों के साथ intracellular कैल्शियम की गतिशीलता की रिकॉर्डिंग के द्वारा, चुनाव आयोग युग्मन असामान्यताओं का आकलन करते समय इस विधि के साथ अलग myocytes पैच दबाना तकनीक के साथ पूरा electrophysiological मूल्यांकन के लिए नियोजित किया जा सकता है. यहाँ वर्णित रिकॉर्डिंग प्रक्रिया हमें इस प्रकार की कोशिकाओं और नमूनों की एक सीमित संख्या के साथ डेटा की एक बड़ी राशि का निर्माण, प्रत्येक कोशिका से एक भी रिकॉर्डिंग के साथ कई शारीरिक सेल मानकों को इकट्ठा करने की अनुमति दी. गैर hypertrophic रोगियों 21 की तुलना में इन फायदों के लिए धन्यवाद, इस पद्धति का सफलतापूर्वक, हो ची मिन्ह रोगियों से निलय cardiomyocytes की विशिष्ट कार्यात्मक असामान्यताएं चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. आयन धाराओं और कार्रवाई संभावित अवधि, साथ ही गतिज विसंगतियों की असामान्यताएं आयुध डिपो intracellular सीए 2 + सायकलिंग स्पष्ट रूप से उच्च reproducibility के साथ, इस तकनीक का उपयोग पहचान की गई. इसके अलावा, हम देर ना + के एक चयनात्मक अवरोध करनेवाला के साथ कि उपचार से पता चला है बनाम ranolazine के साथ एक डबल अंधा नैदानिक परीक्षण के विकास के लिए नेतृत्व किया. वर्तमान में चल रही है जो हो ची मिन्ह 29, के साथ रोगियों में placebo.
मानव हृदय नमूना उपलब्धता भी विशेष केंद्रों में अपेक्षाकृत मामूली है, और यह इस तकनीक का एक व्यापक प्रयोज्यता सीमित कर सकता है. बहरहाल, सीधे cardiomyocyte समारोह में रोग से संबंधित परिवर्तन पर मरीज के नमूनों से प्राप्त किया जा सकता है कि जानकारी की गुणवत्ता HCM और अन्य हृदय रोगों के पशु मॉडल से कि प्राप्त करने के लिए तुलनीय है. के बीच व्यापक मतभेद को देखते हुएमानव और murine हृदय myocytes के शरीर क्रिया विज्ञान, मानव myocytes के कार्यात्मक मूल्यांकन से डेटा अत्यंत मूल्यवान हो सकता है. निष्कर्ष के रूप में, हम अपने प्रोटोकॉल तत्काल translational मूल्य के साथ, रोगी के नमूने से सीधे कोशिकाओं पर कार्यात्मक मूल्यांकन का एक पूरा सेट प्रदर्शन करने की संभावना प्रदान करता है के बाद से इस तकनीक का भविष्य अनुप्रयोगों काफी, हृदय रोगों के ज्ञान के लिए योगदान कर सकते हैं.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस काम के लिए यूरोपीय संघ (strep परियोजना 241,577 "बड़ा दिल," 7 यूरोपीय फ्रेमवर्क कार्यक्रम, सीपी), Menarini अंतर्राष्ट्रीय संचालन लक्समबर्ग (पूर्वाह्न), Telethon GGP07133 (सीपी) और गिलाद विज्ञान (पूर्वाह्न) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | 49601 | |
| Pyruvic acid | Sigma-Aldrich | 107360 | |
| 3-Hydroxybutyric acid | Sigma-Aldrich | 166898 | |
| Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Succinic Acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A0281 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V | Sigma-Aldrich | C9263 | |
| Proteinase, Bacterial, Type XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
| Calcium chloride solution, ~1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcium chloride 0.1 M solution | Sigma-Aldrich | 53704 | |
| Potassium methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 83000 | |
| FluoForte Reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-52015 | |
| Powerload concentrate, 100X | Life Technologies | P10020 | |
| Perfusion Fast-Step System | Warner Instruments | VC-77SP | |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528 | |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pClamp10.0 | Molecular Devices | ||
| Digestion Device | CUSTOM | CUSTOM | The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested. |
| Silicone elastomer for the digestion device's brushes | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Variable speed rotating motor for the digestion device | Crouzet | Crouzet 178-4765 | |
| Mold for brushes casting | N.A. | N.A. | The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods. |
References
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