Summary
心疾患の細胞に基づく現在の知識は、ほとんどの動物モデルの研究に依存しています。ここでは、説明し、人間の心室心筋の小さな外科的サンプルから単実行可能な心筋細胞を得るための新しい方法を検証する。ヒト心室筋細胞は、電気生理学的研究および薬物試験のために使用することができる。
Abstract
疾患のある心臓の心筋細胞は、細胞構造、励起収縮連関および膜イオン電流の変化を伴う複雑なリモデリングプロセスに供される。これらの変更は増加催不整脈リスクと心臓病患者における収縮期および拡張機能障害につながる収縮の変化の原因であると思われる。しかし、心疾患における心筋細胞機能の変化は上のほとんどの情報は、動物モデルから来ている。
ここでは、説明し、心臓手術操作を受けている患者からの心室の心筋の小さな外科的サンプルから実行可能な筋細胞を単離するためのプロトコルを検証する。プロトコルが詳細に記載されている。電気生理学的および細胞内カルシウムの測定は、この方法で得られたヒト心室心筋細胞における単一細胞の測定数の実現可能性を実証することが報告されている。
プロトコルは、彼を報告した再様々な心臓疾患の存在下で、人間の心臓の機能的変化の細胞および分子基盤の将来の調査のために役立ちます。また、この方法は、細胞レベルで新規な治療標的を同定するために、ダイレクト並進値と、ヒト心筋細胞に新規化合物の有効性を試験するために使用することができる。
Introduction
心筋の電気生理学的特性の解剖は、単一の心筋細胞を単離するための技術の開発の後に顕著に進んでいる。心臓の興奮収縮連関（ECカップリング）の理解における最近の進歩はまた、完全な組織の全ての生理学的特性を保持している実行可能な単一の心筋細胞を単離する能力によって可能になってきた。パッチクランプ法は日常的機能および心臓筋細胞膜のイオン電流の薬理学的調節を研究するために使用される。のCa 2 +感受性色素と細胞内カルシウム動態の記録はまた、定期的に、ECカップリングの生理学上だけでなく、細胞内Ca 2 +の病理学的変化に重要なデータを提供し、健康で病気の様々なモデルから単一の心筋細胞上で実行される機械的な障害や心疾患増加催不整脈の負担につながる恒常性。情これらの研究からのTiONは、臨床現場における薬物の電気生理学的および機械的な影響を理解するために重要です。しかし、貫通電流および心臓の活動電位と心臓力学の特定の機能を占め、ECカップリングタンパク質における種特異的な違いがあります。非ヒト哺乳動物から単離した筋細胞の研究は、生物物理学的特性および特定の膜貫通イオンチャネルおよびEC結合タンパク質の生理的役割を解明しつつ、それらは必ずしも人間の心筋細胞の関連のモデルを提供していません。人間の心筋からの実行可能な筋細胞の単離は、完全に心疾患の病態生理を理解し、新たな治療アプローチを検証することが不可欠である。
心耳は、多くの場合、外科的手技中に破棄されたように、ヒト心房組織は、容易に入手可能である。成人の心臓の活動電位とイオンのCuの初期定量的研究rrentsを酵素的に孤立性心房細胞の1-4を採用。活動電位または単離された成人の心室細胞からの電流の記録は、その後3,5-10を報告されている。これらの研究のほとんどは、外植された心臓から得られた細胞を使用し、単離された細胞を得るためにコラゲナーゼ冠動脈セグメントまたは切除組織の比較的大量の暴露のコラゲナーゼ灌流のいずれかを利用している。これらの研究は、健康な心からの人間の心室心筋細胞からターミナル心不全患者からの膜貫通イオン電流の数の詳細な特性を可能にした。 L型の録音は、Ca 2 +電流（I CA-L）を 5-7、一過性外向きカリウム電流（I） は 8は 、整流カリウム内向き電流（私はκ1）8、遅延整流カリウム電流のさまざまなコンポーネントは、（私はκ 9）が報告されている。の進歩と精製単離手順10は 、脱分極12期および拡張期脱分極および早期のビートにつながる面白い、現在13に増加した後に遅れて活動電位延長11を含む、ターミナル心不全で増加催不整脈性のイオン根拠の明確な特性評価を可能にした。
アダルト心筋細胞は通常、様々な酵素混合物で心臓全体のCa 2 +トレラント細胞14を高収率で生産する技術の逆行性灌流によって小さな動物から単離される。組織の断片からの心筋細胞の単離は、冠状動脈の灌流によって達成されるものと比較しているため、個々の筋細胞への酵素の限られたアクセス、おそらく本質的にあまり成功しています。なぜなら、未使用のドナー心臓の非常に限られた入手可能性、定期的に正常なヒト心室細胞を得るための唯一の実用的な方法は、酵素digestioである待機的外科手術中に切除しばしば非常に小さな組織フラグメントのN。徹底的に細胞レベルで特徴付けられている唯一のヒト疾患モデルでは、移植された心臓へのアクセスのために、端末心不全である。しかし、端末の心不全は、少数の患者が発生し、多くの場合、根本的な原因15は比較的独立している心筋細胞の深刻な改造の共通の経路を伴う。疾患の初期非失敗の段階で患者からの単一心筋細胞の機能を評価する能力は、異なる遺伝性または後天条件の具体的な病態生理を理解することが重要です。肥大型心筋症（HCM）は語っ例です。 HCMは、流出路閉塞および拡張機能障害16による催不整脈リスクと収縮の変化を一般的な（1/500個体）心肥大が特徴継承心臓状態、増加している。 HCMの心臓から心筋細胞Uセル構造の変化（肥大、筋原線維混乱）とEC-カップリング17を含む複雑なリモデリング過程をndergo。しかし、HCMでの筋細胞機能障害のほとんどの情報は、トランスジェニック動物モデルから来ている。 HCM患者のごく少数が端末心不全に向かって進化し、心臓移植を必要とするため、HCMの心は非常にまれに、標準的な方法を用いた細胞単離のために使用できません。しかし、HCM患者の少なくとも30％が、収縮期（HCM）18中に流出路の血流を変化させる大規模な中隔肥大に起因する閉塞症状を発症する。 HCMにおける障害物の救済のための最も効果的な利用可能な治療の選択肢は、手術中隔の心筋切除術である：この外科手術中、上側の中隔の可変サイズの部分は、トランス大動脈アプローチによって除去される。肥大した中隔のこの部分は、新鮮な組織からの細胞を単離するための、したがって提供されています。
人間ventriculaの単離のための方法Rシングル、小型の経静脈心内膜心筋生検標本からの筋細胞は、以前に開発され、19を公表されている。私たちは、中隔心筋切除術および弁置換処置を受けた患者を受けHCMの患者を含む心臓手術を、受けている患者からの心室の心筋サンプルから単中隔の筋細胞を単離するための方法を実施しました。単離プロトコールの詳細な説明に加えて、代表的な電気生理学的およびCa 2 +の蛍光測定は、単離されたヒト心室筋細胞の生存率およびパッチクランプ及び細胞内Ca 2 +の研究の実現可能性を実証し、提示される。
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Protocol
（; 2009年5月リニューアル2006/0024713）、ヒトの組織についての実験プロトコルがCareggi大学病院の倫理委員会によって承認された。各患者は、書面によるインフォームドコンセントを与えた。
1。ソリューションと設備の準備
溶液は、表1に記載されている。細胞単離手順の簡略化したフローチャートを図1に見出される。
| ソリューション | CP | DB | KB | TB | PS | EB1 | EB2 | |
| 試薬（MM） | KH 2 PO 4 | 50 | ||||||
| 硫酸マグネシウム | 8 | 1.2 | 5 | 1.2 | 1.2 | |||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | |||||
| アデノシン | 5 | |||||||
| グルコース | 140 | 10 | 20 | 10 | 10 | 10 | ||
| マンニトール | 100 | |||||||
| タウリン | 10 | 20 | 5 | 20 | 20 | |||
| NaClを | 113 | 136 | 113 | 113 | ||||
| 塩化カリウム | 4.7 | 85 | 5.4 | 25 | 4.7 | 4.7 | ||
| 塩化マグネシウム | </ TD> | 1.2 | 5 | |||||
| KH 2 PO 4 | 0.6 | 30 | 0.6 | 0.6 | ||||
| のNa 2 HPO 4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | |||||
| 炭酸水素ナトリウム | 12 | 12 | 12 | |||||
| KHCO 3 | 10 | 10 | 10 | |||||
| ピルビン酸ナトリウム | 4 | 4 | 4 | |||||
| BDM | 10 | 10 | 10 | |||||
| BHBA | 5 </ TD> | |||||||
| コハク酸 | 5 | |||||||
| EGTA | 0.5 | |||||||
| K 2-ATP | 2 | |||||||
| ピルビン酸 | 5 | |||||||
| クレアチン | 5 | |||||||
| KMES | 115 | |||||||
| 酵素（U / ml）を | コラゲナーゼタイプV | 250 </ TD> | 250 | |||||
| プロテアーゼタイプXXIV | 4 | |||||||
| pHは | 7.4 KOH | 7.3のNaOH | 7.1 KOH | 7.35のNaOH | 7.2 KOH | 7.3のNaOH | 7.3のNaOH | |
。表1検体採取、細胞の単離と筋細胞の機能解析 、CP =心筋保護液のために使用される溶液 ; DB =解離緩衝液; KB =クラフト·Bruhe溶液; TB =タイロード緩衝液; PS =ピペット溶液; EB1 =酵素緩衝液1; EB2 =酵素緩衝液2。
- 心臓麻痺（CP）溶液を調製する。 CP溶液を1週間まで4℃で保存することができる。
- のCa 2 +を含まない解離緩衝液（DB）を準備します。このソリューションでは、一日の中で使用する必要があります。
- クラフト·Bruhe（KB）の溶液を調製する。 KB溶液を最大1ほんの4℃で保存することができるK。
- のCa 2 +を含まないタイロード緩衝液（TB）を準備します。このソリューションでは、一日の中で使用する必要があります。
- 使用前にシリンジフィルターを使用して、すべてのソリューションをフィルタリングします。
- 消化装置（ 図2）、電動モータによって回転一方がシリコーンエラストマーの対向する2ブラシからなる掻き容器を準備する。消化器がカスタムメイドなのです。消化装置の詳細については、 図8であり;デバイスのイメージを図2 Cと2Dである。 70％エタノールと水で組織チャンバーを洗浄します。
心筋のサンプル2。収集および処理
- 50ミリリットルチューブにcardiplegic（CP）の溶液40ミリリットルを注ぎ、それが細胞単離研究室に手術室から検体の輸送のための氷の中に保管してください。
- 氷冷で洗って、すぐに切除した後に手術室から心室の心筋標本を収集CP液やチューブに保管します。心臓切開手術中に上部の間の心室中隔から切り出し心内膜標本、重み> 100ミリグラムを使用してください。
- 急速に研究室エリアに試料を移す。切除標本から10分以内に検体処理を開始します。
- 氷冷CPバッファ内の試験片を保持しながら、慎重に実体顕微鏡下で微細なハサミを使用して心内膜線維化層を除去する。その後、小片（2-3 mmの長さ）の心筋組織をカット。組織試料の大きさに応じて、それぞれの単離のために100ミリグラムおよび1gの間の心室筋の総量を削減する。
- 組織ミンチが完了すると、きれいな氷冷CP溶液を、消化装置に心筋チャンクを転送する。全組織のわずか1グラムを使用して、心筋のチャンクで2つのシリコンブラシ（3-4 ml）の間の全体のボリュームをいっぱいにならないよう。
心筋チャンクの3。洗浄し、消化
- アフト小胞体のチャンクを冷性Ca 2 +を含まない解離緩衝液（DB）でチャンバ内のCPバッファを変更し、消化装置の掻き取り室に移す。
- 浴中で加熱された水（ 図1）と接触するようにするためには、チャンバ、恒温槽内の消化装置を配置する。 37.5℃までバスを設定し、徐々に組織室内の温度を上昇させるために、電源を入れます。 1革命/秒に回転速度を設定し、消化器のモーターの電源をオンにします。
- すべての8分きれいなDBにチャンバー内の溶液を変え、DBで3回の洗浄サイクルを実行します。 DBは、（37℃）まで温め、酸素が心筋の塊と接触して取得する前に飽和している。
- DB溶液にコラゲナーゼタイプVと4 U / mlのプロテアーゼタイプXXIVの250 U / mlのを追加して、酵素緩衝液1（EB1）を準備します。 DB溶液に250 U / mlのコラゲナーゼタイプVを追加することにより、酵素緩衝液2（EB2）を準備します。ウォームアップ（37℃）とoxygenatEのEB1とEB2。
- （37℃）100パーセント酸素化EB1と回転の消化器内消化の2 12分のサイクルを実行します。各サイクルで、EB1の〜3ミリリットルを使用しています。ピペット吸引によって溶液を除去し、各サイクルの後に、それを捨てる。
- 細胞回収と〜バッファを溶出させるための冷却（4℃）KB液80ミリリットルのために6 15ミリリットルのチューブを準備します。
- 37℃で3ミリリットル100パーセントの酸素化EB2で最初の15分の消化サイクルを実行蒸解サイクルの後、15mlチューブ内の最初の解離筋細胞を含む溶液を収集し、12ミリリットルの冷KB溶液と細胞懸濁液を希釈する。室温でフラットチューブに保管してください。
- 次の消化サイクルのコラゲナーゼVの濃度を半分にするために、DB等量の残りEB2溶液を希釈する。
- 37℃で3ミリリットルEB2と他の5〜12分間消化サイクルを実行する;それらの各した後、15 mlコニカルチューブに緩衝液を含む筋細胞の収集および12ミリリットルキロバイト溶液で希釈する。 30分間室温で6セルを含むチューブに保管してください。
4。細胞再懸濁およびCa 2 +の再適応
- + -遊離Ca 2 20mlに1 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA）を追加するタイロードバッファー（TB）。溶液を濾過。
- 遠心沈降筋細胞を強制的に5分間、100×gでコニカルチューブを含む6筋細胞は上清を除去し、可変量を各チューブ内の細胞を再懸濁（1-3 mlの収量に応じて）室温でのTBを含む、BSAの。
- 徐々に100ミリモル/ LのCaCl 2溶液の少量ずつを追加することにより、緩衝液を含む細胞内のCa 2 +濃度を増加させる。第一及び第二のステップにおけるCa 2 +濃度は、それぞれ、50マイクロモル/ Lおよび100マイクロモル/ Lまで上昇させる。以下のCa 2 +の添加工程は、5分ごとに実行され、濃度が各ステップtで100マイクロモル/ Lで上昇させる0.9ミリモル/ LのOA最終濃度
- 単離法の収率を評価する。顕微鏡のガラスボトム室に筋細胞を含む溶液0.5mlを移す。 10倍の客観的な倍率で15顕微鏡視野を評価し、健康的な筋細胞の割合（クリア条線と有意な介在物など棒状の細胞、 図2）を計算します。期待利回りは約20％である。
絶縁型心筋細胞の5。機能評価。
次のプロトコルは、活動電位と細胞内Ca 2 +フラックスの同時録画を含むヒト心筋細胞機能評価の一例です。
- 穿孔パッチ構成のパッチクランプ実験のためのピペット溶液（PS）を準備します。溶液を最長3ヶ月間-20℃で保存することができる。
- のCa 2 +を含まないタイロード緩衝液（TB）に1.8モル/ Lの塩化カルシウムを追加します。 USEパッチクランプ/蛍光実験中の心筋細胞の灌流のためにこのソリューションを提供します。
- 1.5mlチューブへの転送細胞懸濁液の1ミリリットルをし、10マイクロモル/ LのFluoforteと10μlのPowerload濃縮物を追加します。室温で30分間インキュベートする。その後、垂直位置にチューブをセットし、5分間沈降細胞を残す。結核を含む内Ca 2 +の細胞を懸濁します。
- （37±0.5°Cの温度）小（0.5ml）中に細胞懸濁液0.25mlのを転送し、温度制御された顕微鏡は、0.3ml /分の流速で加熱さmicroperfusorシステムと重力によって灌流記録チャンバを、取り付けられている。
- マイクロピペットプラーを使用して、3〜5ミクロンの先端径とPSで満たされた3 M 4.5の抵抗でパッチクランプピペットを準備します。
- PS（250μg/ ml）をバッチにアムホテリシンBを追加し、電極を埋めるために使用します。
- FO、介在物のない、明確な条線を細胞に棒状を選択GIGAシールをRmとアクセス抵抗が20MΩを下回るまで、5から10分待ってください。
- 刺激の異なる周波数（0.2 Hzで、0.5と1Hz、各周波数で1分）での短パルス（<3ミリ秒）を使用して、電流クランプモードでの活動電位を誘発する。記録フェーズでは、492±3 nmで明視野照明をオンにして505から520 nmでFluoforteの蛍光を検出する。 Digidata 1440AとPCLAMPの10.0ソフトウェアを使用して蛍光および膜電位信号を取得。必要に応じて記録シーケンスを複数回繰り返します。しかし、各セルの15分以下の記録時間を保つ。
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Representative Results
非障害の非肥大手術患者21と比較して、上述の方法は、心筋切除術の手術を受けた肥大型心筋症（HCM）を有する患者の心室中隔から単離された心筋細胞の機能異常を特徴づけるために用いた。このセクションに含まれている結果は、ワーク21から誘導され、この技術は、心臓の疾患状態における心筋細胞機能の変化を特徴付けるために使用することができる方法の例として示されている。
HCMを有する患者からの代表的な外科的試料は、 図2Aに示されている。外科的試料は、心内膜線維ストリークの大きさおよび厚さの点で非常に可変であった。我々はHCMサンプルから各単離操作に使用する心筋組織の量は1グラムぐらいでした。その代わりに、対照サンプルに使用組織の量は、（100〜500ミリグラム。）小さかった、ロウによるR組織の可用性。対照試料は、組織内の生存可能な心筋細胞の相対量はHCM心筋において減少し、心内膜心筋線維症が22に増加するためか、HCMに対して処理した場合に収率が有意に高かった。これらの観察結果から、我々は、生存細胞を得るために必要な量の組織が心筋症の有無に応じて可変とすることができると結論付けた。
図2（b）に示すように試料は、小さな塊に切断した。その後、チャンクは、消化デバイス（ 図2C）のチャンバーに移した（ 図2D）上記のように単一細胞単離のために使用した。心室中隔サンプルから記載した細胞単離手順を用いて得られた細胞懸濁液の代表的な顕微鏡写真を図3A及び図3Bに示される。シングル心室CAの拡大像rdiomyocytesは、 図3C〜3Fに示されている。プロトコルセクションに記載したようにHCMサンプルからの心筋細胞の活動電位および細胞内Ca 2 +の変動の同時録画に使用した。 3異なる周波数で刺激中膜電圧（上）と細胞内Ca 2 +（下）を示す代表的な同時トレースを図4に示します。これらのトレースは、HCMの試料から単離され、単一の心筋細胞から記録した。
パッチクランプ研究の結果は、刺激の様々な周波数で記録された活動電位持続時間（APD）は著しく対照（ 図5Aおよび5B）と比較して、HCM（HCM心筋細胞）の患者からの心筋細胞で延長されたことを示した。単離された筋細胞における生理学的応答の維持を確認するために、我々は、10で使用し、イソプロテレノールの効果を試験した- 7 M（ 図5C）：β-adrenerをGICの刺激はコントロール細胞における予想されるAPの短縮をもたらした。長時間のAPDは脱分極（イーズ）23後の初期のリスクの増加につながることから、APのプラトー相の間に自発的な脱分極として検出EADSの発生は、測定した。 HCMの心筋細胞では、EADSは、コントロール（ 図5D）と比較して有意に多かった。複数のEADSを示す代表的なトレースを図5Eに示されて
長いAPDとイオン電流の異常がHCMの心筋細胞における興奮収縮連関のメカニズムに影響を与える可能性かどうかをテストするために、細胞内Ca 2 +の変化の特性は、刺激中に評価した。 2 +過渡電流固定条件で誘発のCaの振幅が心筋細胞（ 図6A）と比較し HCMに類似していた。逆に、一過性のCa 2 +の動態は、HCM（ 図には有意に長かった6B）。さらに、細胞内の拡張期Ca 2 +濃度は、HCMで顕著に高かった心筋細胞（ 図6C）と比較し、刺激周波数の増加に応じより顕著に増加した。
注目すべきことに、ヒト心室サンプルから、この方法で単離された心筋細胞はまた、正常に特定の膜貫通電流（ 図7A）、細胞内Ca 2 +及び/又は細胞電場刺激の間に記録を短縮する（ 図の電圧クランプ記録を含む他の用途に使用されてきた7B）と共焦点顕微鏡法および膜結合蛍光標識（ 図7C）を用いて、筋細胞膜の微細構造の評価。
図1。細胞単離手順を示すフローチャート。
中隔心筋切除術の手術を受けたHCMの患者からの心室の心筋のサンプルを示す、図2。細胞単離のための心室サンプルの処理（A）代表画像。心室手術標本から心室組織切断の較正バー= 5ミリメートル（B）チャンク、細胞単離のために使用される。消化器のキャリブレーションバー= 5ミリメートル。（C）画像。デバイスは、2つのシリコンのブラシを用いて消化チャンバを含む：優れたブラシは、モータにより移動したときに回転することができる心室組織の酵素消化中に恒温槽内の消化装置を示す（D）画像。 P>
図3。単離されたヒト心室の心筋細胞。（A-B）のパネルは、代表的な心筋細胞懸濁液を示す2顕微鏡視野（10×対物レンズ）の顕微鏡写真を示しています。注目すべきは、細胞の約30％が棒状であり、明確な条線が表示されます。キャリブレーションバー=100μmである。（CE）HCM患者（40X対物レンズ）の検体から分離され3人の心筋細胞の代表的な画像。録音用のパッチピペットの先端が触れた人間の心室の心筋細胞を示すキャリブレーションバー=20μmの。（F）画像。キャリブレーションバー=20μmの。
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図4。膜電位と細胞内カルシウムの同時記録。代表トレースを示す膜電位（上）と細胞内カルシウム（下）HCMの試料から単離された単一の筋細胞から記録された。筋細胞は0.2 Hzで、0.5 Hzおよび1Hzでパッチピペットを介して刺激される。
図5。HCMサンプルから心室心筋細胞における活動電位の改変。（A）代表は右、黒トレース（0.2ヘルツ、0.5 Hzおよびコントロール（左、灰色のトレース）筋細胞およびHCMの筋から1 Hzで誘発された活動電位を重畳）。HCMでの90％再分極（APD90％）で、（B）の平均活動電位持続時間（N = 81）と、HCM患者と対照試料からの心筋細胞におけるEADSの制御心筋細胞（N = 29）は、試験した3ペーシング周波数で。（C）発生。（D）は不在（連続トレース）で制御筋から0.5Hzの時に活動電位を重ねて10 -7 Mのイソプロテレノールの存在下で行われる。（E）の矢印でマークされた（初期の脱分極、EADS後）プラトー期中に発生したいくつかの自発的な脱分極を表示するHCMの患者からの心筋細胞の膜電位を示す代表的なトレース。刺激は、トレース下記短い線でマークされています。 ** = p <0.01対応のないt-検定。図中のすべてのパネルはCoppini らの許可を得て変更されます。2012年21。
図6。HCMサンプルから心室の心筋細胞内のカルシウムトランジェントの改変。（A）代表は、カルシウムトランジェントが制御筋細胞におけるパッチピペット（グレー）とHCM細胞（黒）を介して0.2 Hzで刺激中に誘発さ重畳。注目すべきは、Ca 2 +のトランジェントの振幅は、2セルの間に違いはありません（B）HCMにおけるCa 2 +過渡の動力学（N = 42）と対照（N = 24）心筋細胞：時間の刺激からの過渡（TPをピークに）、ピークから50％までの時間減衰（T50％）およびピークからの過渡の90％減衰（T90％）のまでの時間が示されている。HCMにおける3つの異なる周波数での刺激の間、細胞内Ca 2 +を示した（C）代表長いトレースおよびHCM筋細胞において高いペーシングレートで上昇し、拡張期のCa 2 +を強調。（D）の平均拡張期のCa 2 + HCM（N = 42）と対照（N = 24）心筋細胞に3種類のペーシングRAにおける制御筋細胞、TES。 ** = P <0.01対応のないt検定。図中のすべてのパネルはCoppini らの許可を得て変更されます。2012年21。
。。図7ヒト心室筋細胞を使用して追加の実験的なアプリケーション（A）は、左：代表（詳細は21を参照）、L型Ca 2 +特定のプロトコルと異なる膜電圧で、電圧クランプの下に記録された電流を示すトレースを重ね合わせた。右：異なる膜でHCM試料から単離した細胞からの平均18 L型Ca 2 +電流ピーク密度。電圧（B）細胞内Ca 2 +が 1 Hzの電界刺激中に心室筋細胞から記録されたトレース。心室cardiomの（C）の共焦点画像蛍光膜結合色素（ジ-3 - ANEPPDHQ）で染色HCM試料からyocyte。注目すべきは、ttubulesの密度は、HCMの形態学的膜のリモデリングを示唆して低い。
図8。消化器。消化器の（A-B）コンポーネント。可変速モータの回転は、第二つに接続される第一のプラスチックのアームに接続されている。第2のプラスチックアームが取り外し可能なブラシと上部に接続されている。ブラシは、シリコーンエラストマーで作られている。 〜1.5ミリメートル間隔100穴のPTFE負の金型は、液体シリコーンからブラシをキャストするために使用された。金型の内部空間は直径1.9cmを有し、同じサイズのブラシを製造する、厚さ6mmである。金型の一方の側に位置する穴は、長さ8mmのブラシ毛を産生するためになされている金型から鋳造され、削除されます。液体シリコーンを金型に入れた後、少なくとも48時間は完全硬化のために必要とされる。ブラシは、ガラス管（内径= 2センチメートル、厚さ2mm）を内部に搭載され、2つのブラシとガラス壁によって形成された円筒状のチャンバは気密に2つのゴム製Oリングにより封止されている。ブラシは、一方を他方に押圧される必要がある;上側のモータアームのプラスチック端部に接着し、従って、回転することができるしながら底一方は、プラスチック基材上に接着されている。上側ブラシの（C）の拡大図。注目すべきは、ブラシは、チャンバの構成要素がそれらの最終位置で示されている（D）を回転させるために、モータ·アームの端部に接着する必要がある。 2つのブラシ（実際室）との間の空間は約2センチ幅、高7〜8ミリメートル;このスペースは簡単に心筋組織の1グラムまでは別のバッファ3-4ミリリットル、フィットします。
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Discussion
私たちは、説明され、人間の心室の心筋の外科サンプルから実行可能な筋細胞を単離するための方法を検証しています。首尾よく心房外科試料から単離した細胞に使用されていた以前に記載されたプロトコルから始めて、病気の心室の心筋から単一の実行可能な筋細胞の分離を可能にする技術が開発され、微調整した。初期の報告では、冠灌流を介してバッファを含む酵素の配信が遅延整流を損なわなかったのに対し、心房および心室組織の塊から単一心筋細胞の単離は、選択的、生理的刺激8,24に変更された電気生理学的特性および応答で、その結果、カリウム電流を再分極減損ことを示した分離株の細胞25の電流。残念ながら、心室心筋の手術標本からのヒト心室筋細胞の単離は、冠状動脈枝の整合以来冠灌流によって実行することはできません外植心と分散で、失われます。本手法を用いて、心筋のチャンクから分離した心筋細胞は、ペーシング周波数の変化に応じて、活動電位持続時間の明確な適応を表示したり、アドレナリン刺激をβに。そのような応答が発生するためには、遅延整流カリウムチャネルの完全性は、これらのチャネルの全体的な完全性は、我々の分離法によって損なわれない示唆し、26〜28が必要である。さらに、我々の方法を用いて単離された細胞は、通常の電気生理学的応答（ 図3および4）を 、表示しないだけでなく、（カルシウム、期待される形状および持続時間の過渡現象（ 図3および5）および定期的なサルコメア組織（ 図2）と短縮プロパティをしない表示する）が示され、これらの細胞の全体的な構造的完全性がこの分離手順によって保存されることを示唆している。以前に比べてこの方法の主な発展技術は、過度の損傷を与えることなく単一細胞の分離を可能にする、組織塊の穏やかな機械的撹拌を提供し、新たに設計された消化装置によって提供される。また、消化装置の使用は、私たちは細胞単離緩衝液中の酵素のより低い濃度を使用することが許可され;特に、我々はこれまでに報告された方法24と比較して、非選択的なプロテアーゼのはるかに低い濃度を使用しています。デバイスは、カスタム我々の研究室で構成されています。建物の回路図を図8に示す。
シンプルなデザインと構造はこのプロトコルの成功した結果のために複製することが非常に容易になります。 図8を参照する伝説は、シリコーンブラシを製造し、こする室を構築するために必要な手順について説明します。消化装置の利点のために、生存細胞の数が比較的高いた（100mg程度の低い）心室組織の比較的低い量から得ることができる。以前に公表された方法19は、小さな生検（偶数<20mg）をよりカルシウム耐性の筋細胞を提供することが示された。しかし、報告された筋細胞収量は非常に低く、著者らは、この方法で単離した細胞は、細胞内カルシウムサイクリングや収縮機能の特徴付けに実現可能であるかどうかを示さなかった。心室中隔の小部分は、しばしば弁置換手順の間に切除されるので、この技術は、多くの外科患者に潜在的に適用可能である（ 例えば、大動脈弁置換）。しかしながら、成功したアイソレーションを得るための重要なポイントは、手術室からのサンプル採取後手順の迅速な開始である。したがって、有益なことが、この技術ためには、心臓手術の診療所に近接しているために細胞の研究室に必要とされる。さらに、適切な酵素活性は正常な分離のためにも極めて重要である。以来、非選択的なプロテアーゼ活性OF各コラゲナーゼバッチは通常、完全にテストされていません、各ロットは、細胞の単離の間に別々に実行する可能性がある。したがって、最良の結果を得るために微調整コラゲナーゼの最終濃度に不可欠である。我々は、生存細胞サイクル3に現れる開始することを確認するために、各サイクルにおいて、顕微鏡下で細胞懸濁液を観察示唆する細胞の初期の外観は、過剰な酵素活性を示唆し、酵素濃度の減少に向かって促す。サイクル3の後に細胞の出現が不十分な酵素活性を示唆する。我々の経験では、これは正しい酵素濃度の最も効果的な指標である。
我々は成功し、手術中隔の心筋切除術を受けた左室流出路閉塞を伴うだけでなく、故障していない非肥大の手術患者21からHCM患者の心室間中隔から単一の心筋細胞を得るために、このメソッドを使用している。その論文の結果同時に蛍光色素と細胞内カルシウム動態を記録することにより、EC-カップリング異常を評価しながら、この方法で単離された筋細胞パッチクランプ技術を用いて完全な電気生理学的評価のために用いることができることを示している。ここで説明する記録手順は、私たちはこのようにして細胞および限られたサンプル数で大量のデータを生成し、各セルからの単一の記録を有するいくつかの生理学的細胞パラメータを収集させる。これらの利点のおかげで、この方法は、正常、非肥大患者21と比較して、HCM患者から心室心筋細胞の特定の機能異常を特徴づけるために使用されている。イオン電流および活動電位持続時間、ならびに運動異常、外径細胞内Ca 2 +サイクルの異常が明らかに高い再現性で、この技術を用いて同定した。加えて、我々は後半のNa +の選択的阻害剤による治療が示されている、VSラノラジンとの二重盲検臨床試験の開発につながった。現在進行中であるHCM 29、を有する患者でプラセボ。
ヒト心筋標本の可用性はさらに専門的な施設で、比較的穏やかであり、これは、この技術の幅広い適用性を制限することがあります。それにもかかわらず、直接、心筋細胞機能の変化に関連する疾患の患者サンプルから得られる情報の質は、HCMおよび他の心臓疾患の動物モデルから達成可能に匹敵する。間の大規模な違いを考えるヒトおよびマウスの心筋細胞の生理学、人間の筋細胞の機能評価からのデータは非常に貴重なことができます。結論として、我々は我々のプロトコルが即時翻訳値は、患者サンプルから直接細胞で機能的アセスメントの完全なセットを実行する可能性を提供するため、この技術の将来のアプリケーションが大幅に、心疾患の知識に貢献できると考えています。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、EU（STREPプロジェクト241577 "大きな心、「第7回欧州フレームワークプログラムは、CP）、メナリーニ国際事業ルクセンブルク（AM）、テレソンGGP07133（CP）とギリアド·サイエンシズ（AM）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | 49601 | |
| Pyruvic acid | Sigma-Aldrich | 107360 | |
| 3-Hydroxybutyric acid | Sigma-Aldrich | 166898 | |
| Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Succinic Acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A0281 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V | Sigma-Aldrich | C9263 | |
| Proteinase, Bacterial, Type XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
| Calcium chloride solution, ~1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcium chloride 0.1 M solution | Sigma-Aldrich | 53704 | |
| Potassium methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 83000 | |
| FluoForte Reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-52015 | |
| Powerload concentrate, 100X | Life Technologies | P10020 | |
| Perfusion Fast-Step System | Warner Instruments | VC-77SP | |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528 | |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pClamp10.0 | Molecular Devices | ||
| Digestion Device | CUSTOM | CUSTOM | The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested. |
| Silicone elastomer for the digestion device's brushes | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Variable speed rotating motor for the digestion device | Crouzet | Crouzet 178-4765 | |
| Mold for brushes casting | N.A. | N.A. | The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods. |
References
- Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
- Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells. Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).
- Harding, S. E., et al. Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes. Cardioscience. 1, 49-53 (1990).
- Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
- Cohen, N. M., Lederer, W. J. Calcium current in single human cardiac myocytes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation Research. 73, 379-385 (1993).
- Virag, L., et al. The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes. Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).
- Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note. Cardioscience. 4, 111-116 (1993).
- Benitah, J. P., et al. Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).
- Verkerk, A. O., et al. Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts. Circulation. 104, 2728-2733 (2001).
- Cerbai, E., et al. Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart. Circulation. 95, 568-571 (1997).
- Kohncke, C., et al. Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Tomaselli, G. F., Marban, E. Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).
- Maron, B. J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).
- Olivotto, I., et al. The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).
- Maron, M. S., et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction. Circulation. 114, 2232-2239 (2006).
- Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
- Lippiat, J. D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).
- Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127, 575-584 (2013).
- Kuusisto, J., et al. Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 98, 1007-1013 (2012).
- Yan, G. X., et al. Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall. Circulation. 103, 2851-2856 (2001).
- Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods. The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).
- Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes. Circulation research. 78, 689-696 (1996).
- Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study. Circulation. 99, 2466-2474 (1999).
- Volders, P. G., et al. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation. 107, 2753-2760 (2003).
- Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action. Circulation Research. 68, 77-84 (1991).
- Coppini, R., et al. A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine. Circulation. 125, 1 (2012).
