Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Design og drift af en kontinuerlig Published: January 16, 2014 doi: 10.3791/51117

Summary

Denne metode forklarer, hvordan at bygge og drive en kontinuerlig 13 C og 15 N isotopmærkning kammer for ensartet eller differentieret plantevæv mærkning. Repræsentative resultater fra metaboliske og strukturel mærkning af Andropogon gerardii diskuteres.

Abstract

Sporing sjældne stabile isotoper fra plantemateriale gennem økosystemet giver den mest følsomme oplysninger om økosystemets processer fra CO 2-strømme og jordens organiske materiale dannelse til mindre stabil-isotop biomarkør sondering. Kobling af flere stabile isotoper, såsom 13C med 15 N, 18 O eller 2 H har potentiale til at afsløre endnu mere information om komplekse støkiometriske forhold i løbet af biogeokemiske omdannelser. Isotop mærket plantemateriale har været brugt i forskellige undersøgelser af kuld nedbrydning og dannelse jordens organiske materiale 1-4. Fra disse og andre undersøgelser, har det imidlertid vist sig, at de strukturelle komponenter af plantemateriale opfører sig anderledes end metaboliske komponenter (dvs.. Udvaskelige lavmolekylære forbindelser) i form af mikrobiel udnyttelse og langsigtet kulstoflagring 5-7. Evnen til at studere strukturelle og metaboliske komponenterseparat giver et kraftfuldt nyt værktøj til at fremme forkant af økosystemtjenester biogeokemiske studier. Her beskriver vi en fremgangsmåde til fremstilling af 13C og 15N mærket plantemateriale, som enten er ensartet mærket i hele planten eller differentielt mærket i strukturelle og metaboliske anlægsdele.

Her præsenterer vi opførelse og drift af en kontinuerlig 13 C og 15 N mærkning kammer, der kan ændres for at imødekomme forskellige forskningsbehov. Ensartet mærket plantemateriale er produceret af vedvarende mærkning fra sætteplante til høst, mens differentieret mærkning opnås ved at fjerne de voksende planter fra kammeret uger før høst. Repræsentative resultater fra den voksende Andropogon gerardii Kaw demonstrere systemets evne til effektivt label plantemateriale på de målrettede niveauer. Gennem denne metode har vi produceret plantemateriale med en 4,4 atom% 13 C og 6,7 atom-% 15 </ Sup> N ensartet plante etiket, eller materiale, der differentielt mærket med op til 1,29 atom% 13 C og 0,56 atom% 15 N i dets metaboliske og strukturelle komponenter (varmt vand ekstraherbare og varmt vand resterende komponenter, henholdsvis). Udfordringer ligger i at opretholde en ordentlig temperatur, luftfugtighed, CO2-koncentration, og lysniveauer i en lufttæt 13 C-CO 2 atmosfære for en vellykket planteproduktion. Dette kammer beskrivelse er et nyttigt forskning værktøj til effektivt at producere ensartet eller forskelligt multi-isotop mærket plantemateriale til brug i forsøg på økosystemet biogeokemiske kredsløb.

Introduction

Forstå dynamikken i plante-jord-atmosfære processer er afgørende for præcist at forudsige, hvordan det globale kulstof (C) og kvælstof (N) cyklusser funktion under nuværende og fremtidige miljøforhold. Stabile isotoper er stærke værktøjer i kvantitative undersøgelser af plante-jord-atmosfære C og N cykling. Sporing sjældne stabile isotoper fra plantemateriale gennem økosystemet indeholder følsomme oplysninger i undersøgelser af biogeokemiske kredsløb, fra CO 2-strømme og jordens organiske materiale dannelse til små stabil-isotop biomarkør sondering fx 4,8,9. Ved at kombinere 13C mærkning med 15N mærkning eller andre stabile isotoper såsom 2 H eller 18 O i plantevæv giver en høj-opdagelse, sporbart, men alligevel komplekse substrat til brug i koblede studier af plante og jord biokemi. Evnen til ensartet eller differentieret mærke strukturelle og metaboliske plantemateriale annonceds yderligere evne til at løse komplekse spørgsmål om C og N cykle gennem økosystemer. Fordelen ved at bruge isotop mærket plantemateriale i kvantitative undersøgelser af C-og N regnskab, afhænger imidlertid af evnen til at producere 13 C og 15 N mærkede materiale, som enten er ensartet eller differentieret mærket.

Isotopmærkning har været anvendt i undersøgelser vedrørende plante C og N assimilation 10, tildeling 11 og rhizodeposition 12. Ensartet 13C og 15N mærkede plantemateriale giver en kompleks mærket substrat til studier af kuld nedbrydning 1,4, jordens organiske materiale dannelse 2,6 CO 2-emissionerne 4, jordens fødekæde studerer 13, samt undersøgelser af jordens C opholdstider jord 2,14. Forsøg med 13C mærket biochar fra mærket plantemateriale er også begyndt at afsløre nye oplysninger om tidligere oversetjord char pools 15. Mens 15 N, 2 H, og 18 O mærkning er relativt let at opnå gennem vand og gødning behandling eksisterer udfordring i at producere en ensartet 13C mærket plantemateriale til 13 C-CO 2-fiksering.

Kontinuerlig isotopmærkning fra sætteplante til modenhed i en forseglet kammer producerer ensartet isotopmærkning i hele planten. Andre metoder, såsom gentagen mærkning puls 16 og bladpåføring eller vægevirkning 17,18 producerer ikke ensartet isotop mærket plantemateriale eller klart differentieret mærkning af specifikke C-forbindelser (f.eks metabolisk vs strukturelle) 19. En vigtig overvejelse i isotop mærkning mærkning effektivitet, på grund af den høje pris på sjældne isotop berigede forbindelser, der anvendes i mærkning. Selvom kontinuerlig 13C mærkning er blevet anvendt i fortiden 2-4,20, der ikke er for vores videnen offentliggjort detaljeret teknisk beskrivelse af en kontinuerlig mærkning kammer med tegn på høj mærkning effektivitet og præcis styring af mængden og ensartetheden af ​​isotop mærkning.

På forkant med kuld nedbrydning og jordens organiske materiale dannelse forskning er konceptet, at metaboliske plantemateriale (dvs. udvaskelig, labile, lavmolekylære forbindelser) og strukturel plantemateriale (dvs.. Lignin, cellulose, hemicellulose) behandles forskelligt med hensyn til mikrobiel bruge effektivitet, organisk materiale i jorden dannelse, og på lang sigt jord C opbevaring 5-7. Plantemateriale, der er forskelligt mærket i sine strukturelle og metaboliske komponenter er derfor et nyttigt redskab i at fremme kuld nedbrydning og organisk stof dannelse forskning. Differential mærkning med dobbelte isotoper giver mulighed for sporing af strukturelle og metaboliske komponenter separat gennem økosystemet ved hjælp af en multiple-pulje isotop technique 21..

Kontinuerlig isotop mærkning med 13C og andre isotoper i en forseglet kammer kræver omhyggelig opmærksomhed til at plante fysiologiske betingelser for at maksimere planteproduktivitet og isotopmærkning effektivitet. Dagtemperatur pigge skal kontrolleres for at forhindre, når de vokser i en lufttæt kammer skader plante. En optimal vifte af luftfugtighed og temperatur er forpligtet til at opretholde et åbent plante stomata og CO 2-optagelse 22. Høje niveauer af fugtighed årsag dugger af kammeret vægge, hvilket minimerer lys tilgængelighed og kan skade kammeret struktur. Omhyggelig overvejelse og isotop mærkning effektivitet ved at fjerne naturlige overflod isotoper fra kammeret (fx kommer fra potning med organisk materiale i jorden) og forebyggelse af udsættelse for ekstern luft er vigtig, når man arbejder med dyre heavy-isotop mærkede forbindelser.

Her præsenterer vi en metode til at bygge og drive enkontinuerlig dual 13C og 15N isotopmærkning kammer til produktion af plantemateriale, som enten ensartet mærket eller har sine strukturelle og metaboliske komponenter mærket på forskellige niveauer. 13C mærkning styres på kammeret niveau, mens befrugtning og 15 N mærkning kontrolleres på det individuelle pot-niveau. Repræsentative resultater er vist for at demonstrere evnen af denne fremgangsmåde til at kontrollere temperatur, luftfugtighed og CO2-koncentration i hele vækstsæsonen. Resultater fra voksende Andropogon gerardii, Kaw også demonstrere denne metode evne til at producere ensartet eller forskelligt mærkede plantemateriale. Den specifikke kammer design og funktion, der er beskrevet kan modificeres til at vokse forskellige plantearter, samt til at rumme 2 H eller 18 O mærkning.

Protocol

1.. Afdeling Byggeri

  1. Construct mærkning kammer i et drivhus for at tillade maksimal naturligt lys potentiale for plantevækst. Sørg for, at tilstrækkelig strømforsyning er til rådighed til at drive alle kammer komponenter.
  2. Konstruere mærkningen kammer ved at montere 3,175 mm tyk gennemsigtig akryl vægge (polycarbonat ville også være passende) og en 6,35 mm tyk gennemsigtig akryl loft på en aluminiumsramme med en hvidmalet stål gulv for at maksimere sol reflektans. Dimensionerne af kammeret kan skræddersys til individuelle forskningsbehov.
  3. Monter kammeret på ¾ i (19 mm) krydsfiner på brandhærgede blokke.
  4. Bor huller i akrylglas, aluminiumsramme og stål gulv og skruer til at fastgøre alle komponenter sammen.
  5. Forsegl alle sømme med silikone caulk at forsikre en lufttæt forsegling.
  6. Konstruere en dør ved at montere en sektion af akryl paneler på lange skruer, der kan skrues ned ved hjælp af removerbare vingemøtrikker.
  7. Forsegle døren med tætningslister for at forhindre luft lækage.
  8. Vælg et område, der støder direkte op til kammeret, da vagtcentralen til at montere alle temperatur, fugtighed, CO 2-kontroller og overvågningsudstyr.
  9. Bore forsigtigt små huller i kammeret væggen ved siden af ​​kontrol center for alle elektriske ledninger og gas slange. Brug silikone caulk at forsegle huller omkring alle ledninger og slanger for at forhindre luft lækage.
  10. Test kammeret til luftlækage ved at fylde den med et højt niveau af CO 2 (fx 800 ppm) og lade det sidde natten over. Hvis CO 2-koncentrationen i kammeret holdes på sit oprindelige niveau, så er det lufttæt. Hvis koncentrationen falder natten over så alle sømme bør undersøges og lukkes igen med silikone caulk indtil en lufttæt forsegling er opnået.
  11. For nogle anlæg er tilpasset til høje lysforhold tilføje lys er forbundet med en timer til umiddelbar ydre af cHamber at øge lysgennemtrængning og plante produktivitet.

2. Temperatur og luftfugtighed Controls

  1. Regulere kammer temperatur ved at installere en kommerciel split type klimaanlægget med køling (fordamper) spoler placeret inde i kammeret og kompressor og kondensator spoler placeret uden for drivhuset for at sprede varmen. Indstil klimaanlægget til at opretholde den ønskede temperatur.
  2. Brug en lille rum affugter til at styre fugtigheden i kammeret.
    1. Bore et drænhul gennem gulvet af kammeret ved siden af ​​affugteren.
    2. Fjern kondensat indsamler fra affugteren, og tilslut et dræn fra affugteren gennem dræning hul i gulvet af kammeret.
    3. Under kammeret, placere en åben krukke fyldt med vand for affugteren at dræne direkte ind. Dette skaber en lufttæt forsegling, men også give mulighed for trykudligning.
  3. Tilslut controlleren til affugtningsanlæg med en solid-state relæ og indstille fugtigheden controller med en høj alarm og swing til at opretholde optimale vækstbetingelser i kammeret. Optimale temperatur-og fugtighedsforhold vil afvige for forskellige plantearter.

3. CO 2 Controls

  1. 13C-CO 2 berigelse opnås ved anvendelse af to rene CO 2 gastanke, en af 10 atom% 13 C-CO 2 eller højere, og en af 1,1 atom-% 13C-CO2 (naturlig overflod).
  2. Monitor CO 2-koncentration ved at have en membranpumpe kontinuerligt trække kammer luft gennem en infrarød Gas Analyzer (Irga), og derefter pumpe luften tilbage i kammeret, og derved bevare et lukket system (figur 1).
  3. Seta lav alarm og døde bånd på Irga software til at fastholde CO 2-koncentrationer inden for et ønsket område. Her bruger vi en lav alarm på 360 ppm med en 40 ppm død band til at fastholde CO 2-koncentrationer mellem 360-400 ppm.
  4. Tilslut en doseringsventil til hver tank og omhyggeligt justere dem for at nå målet 13C berigelse niveau. Sæt tanken regulatorer til 20 psi.
  5. Indsæt en magnetventil mellem doseringsventilen og tilsynsmyndigheden for hver tank. Slutte sig til udløbene fra de to doseringsventiler sammen og rør dem i midten af ​​kammeret. Wire en solid-state relæ til Irga output til at styre magnetventiler (Figur 1).

4.. Webbaseret system til fjernovervågning

  1. Monitor CO 2-koncentrationer fra Irga software ved at logge det til en lokal fil en gang hver 30 sek.
  2. Opret en brugerdefineret nytte (fx i perl eller andet programmeringssprog) at plukkeup poster fra lokale CO 2 logfil, sammen med den nuværende laptop timestamp, og uploade dem til en back-end web-applikation.
  3. Indstil webapplikation at forespørge temperatur og luftfugtighed sensor data.
  4. Brug et overvågningssystem for at kontrollere status for temperaturen i kammeret hvert femte minut for at forebygge potentielle temperatur pigge, der ville ødelægge planterne, hvis klimaanlægget mislykkedes.
  5. Overvåg CO 2, temperatur og luftfugtighed data på enhver standard web browser, så uventede temperatur spikes eller CO 2 dråber kan straks gik til.

5.. Vandingssystem

  1. Bor et lille hul i væggen af ​​akrylglas kammeret per pot.
  2. Brug skylleslange at oprette en drypvanding ring per potte og foder skylleslangen gennem kammeret væg til det ydre.
  3. Luk hullet omkring skylleslangen med silikone caulkfor at forhindre luftlækage.
  4. På ydersiden af ​​kammeret, tilslut skylleslangen til slangen til en peristaltisk pumpe.
  5. Brug en lille slange klemme til at lukke alle skylleslange at forhindre luft lækage mellem vanding.

6.. Potting Planter

  1. Vælg en gryde passende størrelse for planterne dyrkes. Her, 40, er 15 L potter anvendes.
  2. Opret en jord-fri potteblanding ved at blande sand, vermikulit og profil porøs keramik.
  3. Test vandholdende kapacitet potteblanding ved vejning en fyldt gryde tør, iblødsætning potten med vand og lade den dræne helt, og vejer potten våd. Brug denne maksimale vandholdende evne til at sikre, at overskydende mærket gødning og vand ikke lække fra potterne under vanding.
  4. Spire frø i pottemuld før plantning dem i potter. Dette sikrer, at kun held spiret frø er startet i mærkningen kammer.
  5. Podes t han frøplanter med frisk jord opslæmningen at indføre gavnlige mikrober.
  6. Når frøene er spiret, omhyggeligt transplanterede frøplanter til potter i det ønskede nummer.
  7. Når pottet flytte potterne ind i kammeret og samle hver potte med en individuel kunstvanding slange.

7.. Tætning mødesalen

  1. Når først at forsegle døren til kammeret en stor masse af ekstern luft fylder kammeret. Skrub ud denne eksterne CO 2 ved at tilslutte en natronkalken skrubber til luftpumpe til at skrubbe af CO 2-koncentrationen ned til mindst 200-250 ppm før påfyldning kammeret tilbage op til 400 ppm ved hjælp af tankblanding 13 C-CO 2.
  2. Prøv at holde kammeret lukket gennem varigheden af vækstsæsonen for at minimere naturlig overflod CO 2 forurening.
  3. Overvåg plantevækst visuelt og justere gødskning og kunstvanding i forhold til efterspørgslen.
FSNIT "> 8. Befrugtning og kunstvanding

  1. Brug en gødning opløsning, såsom en modificeret Hoaglands opløsning 23 at befrugte planter gennem vandingsanlæg.
  2. Mærk gødningen med 15 N ved hjælp af en 15 N-KNO 3 subsolution på målrettet atom% 15 N-niveau ved at blande 98 atom% 15 N-KNO 3 med naturlig overflod 15 N-KNO 3 (0,37 atom% 15 N).
  3. Bland op nok af gødningen opløsning ved hver befrugtning begivenhed for hele kammeret, baseret på vandholdende kapacitet potteblanding. Placer den rette mængde gødning til en gryde i et glas, og forberede så mange krukker der er potter.
  4. Unclamp kunstvanding slanger og placere hver af dem i en krukke med gødning løsning, og derefter tilslutte dem til peristaltisk pumpe.
  5. Vandplanter ved at pumpe vand gennem den peristaltiske pumpe gennem det enkelte dryp irrigelse slanger regelmæssigt som planterne har brug for det.
  6. Befrugtning med Hoagland løsning bør følge efterspørgslen plante eller eksperimentel design, med stigende efterspørgsel næringsstoffer som planten produktivitetsstigninger at maksimere produktiviteten.
  7. Først pumpe Hoaglands opløsningen gennem vanding slange, så at pumpe vand skylles igennem for at minimere alge og bakterievækst i rørene.
  8. Spænd alle slanger efter befrugtningen og kunstvanding for at fjerne kammer luft lækage.

9.. Uniform og Differential Mærkning

  1. For differentieret mærkning af strukturelle og metaboliske komponenter, fjerne planter fra mærkning kammer 1-3 uger før høst. Planter, der skal være ensartet mærket kan forblive i den forseglede mærkning kammer kontinuerligt indtil høst og vandes med 15 N-Hoagland løsning.
  2. Hold fjernede planter i drivhuset i løbet af denne tid, så de får tilstrækkelig lysog CO 2 ved naturlig overflod 13 C.
  3. For differentiale 15 N mærkning, fortsætte med at gøde og vande planterne som sædvanlig, men bruger naturlig overflod 15 N-KNO 3 i Hoaglands gødning løsning.

10.. Harvest

  1. Stop vanding af planter 1 uge før høst, så planterne begynder at senesce og pottemuld medie tørrer ud.
  2. Åbn kammeret og flytte potterne ud til øjeblikkelig klipning og høst af de overjordiske biomasse
  3. Hæld potteblanding og rødder over en grov sigte.
  4. Brug skærmen til at adskille rødderne fra potteblanding og ryste rødderne fri for pottemuld mix.
  5. Placer rødderne på en 2 mm sigte og skyl dem med vand for at fjerne eventuelt resterende indkapslingsmateriale. Brug en pincet til at fjerne enhver vermiculit, der måtte klamre sig til rødderne.
  6. Lad rødder lufttørre som forberedelse til fremtidige eksperimenter.

  1. Lufttørre plantemateriale afvejes at bestemme mærkning kammer biomasse.
  2. Grind en delprøve til kemisk analyse.
  3. Placer 2,0 g ovntørret (60 ° C) kuld i en 125 ml syre vasket kolbe og tilsættes 50 ml deioniseret vand.
  4. Anbring prøven på en forvarmet (60 ° C) omrører plade og placere en omrører bar i kolben. Indstil omrøring til 200 rpm og tillade prøven at opvarme i 30 minutter.
  5. Efter 30 minutter filtreres kuld opløsningen gennem en 20 um nylon mesh på en vakuumfiltrering system.
  6. Overfør ekstrakt til en forvejet syrevaskede rør og fryse.
  7. Overfør den faste kuld rest til en i forvejen vejet aluminiumspande og tør ved 60 ° C. Pan og strøelse vejes efter tørring at bestemme varmt vand rest masse.
  8. Frys tørre varmtvandsekstrakt og vejes for at bestemme varmt vand ekstrakt masse.
  9. Analyser ovntørret (60 ° C) kuld, frysetørret varmt vandekstrakt, og ovntørret varmt vand rest i en Elemental Analyzer - isotopforhold Mass Spectrometer (EA-IRMS).

Representative Results

Vores mærkning kammer er 1,2 mx 2,4 mx 3,6 m. i størrelse og rummer 40,15 L potter (Figur 1). Den edb Irga styresystem fastholdt CO 2-koncentrationer mellem vores indstillede værdier for 360 og 400 ppm i løbet af fotosyntetisk aktive periode af dagen (figur 2a). Den lave CO 2-alarm funktion på Irga udløste magnetventiler til at tillade CO 2 fra 13C beriget og naturlige overflod kampvogne ind i kammeret, når koncentrationen faldt under minimumsgrænsen (fx 360 ppm). Dødbåndet Funktionen stoppet strømmen, når koncentrationen nået den øvre setpunkt (fx 400 ppm). ISeries temperatur og luftfugtighed overvågningssystem forbundet til klimaanlægget og affugter holdt klimaforhold inden for de fastsatte parametre i hele vækstsæsonen (figur 2b). Vi brugte en et-ton (3,5 kW) klimaanlæg Keep kammeret cool.

Fjernbetjeningen overvågningssystem tillod de loggede data, der skal ses som helst ved en standard web browser. CO 2-koncentrationer, temperatur og luftfugtighed værdier blev samplet ned af web-applikation til at vise grafer over de seneste 24-240 hr, i intervaller 24 timer. Dette skabte et hurtigt visuelt at bekræfte, at de daglige udsving var inden for de forventede grænser. Visning af web-interface viste også den aktuelle kammer status, samt forudsat advarsler til potentielle problemer såsom ikke modtager de seneste data. På ethvert tidspunkt fuldt datasæt også kan downloades fra web interface.

Vi målte fotosyntetisk aktiv stråling (PAR) i umiddelbar indvendige og udvendige af kammeret på fire punkter med og uden lys på i midten af ​​sommeren og midt på dagen ved hjælp af en kvante-sensor. PAR i kammeret var 31,5% lavere end det ydre, når kammeret lys were off og 22% lavere end det ydre når lysene var tændt. Således kammer lys hjælpe med til at øge PAR indtrængning i kammeret med 9,5% (P <0,05).

Vores kontinuerlige mærkningsordning var i stand til at producere 2759 g A. gerardii biomasse, 37% var overjordiske biomasse og 63% var belowground biomasse. Vi opnåede en 4,4 atom% 13 C hele planten etiket i vores uniform plantemateriale ved at fastsætte magnetventiler på de to CO 2 tanke tilsvarende (figur 1, tabel 1). Vi har opnået et 6,7 atom-% 15 N hele planten etiket i vores ensartet plantemateriale ved at blande 98 atom% 15 N-KNO 3 med 0,37 atom% 15 N-KNO 3 i KNO 3 subsolution af en modificeret Hoaglands opløsning 23 (tabel 1) . Vi vandede A. gerardii ugentligt med 750 ml i alt væske (vand plus Hoaglands opløsning) i hele den voksende havsøn. Vi gødet med 200-500 ml 15 N mærket Hoagland løsning per uge afhængig af plante produktivitet.

Vi udnyttede varmtvandsekstraktionsbehandlingen metode til at bestemme, om der var isotopiske forskelle mellem ensartet og differentielt mærket plantemateriale. For differentielt mærkede planter efter høst vi fjernet alle blade, der var helt død og håndteres disse separat som de sandsynligvis ikke forskelligt mærkes. Når man ser på 13 C-indhold, alle fire inkorporering dage var signifikant forskellige fra hinanden i hele anlægget og varmt vand ekstrakt, men for dag varmt vand rest 14 og 22 var ikke signifikant forskellige fra hinanden (tabel 1). Når man sammenligner plantevævet fraktioner inden for hver dag, varmt vand ekstrakt og rest var signifikant forskellige fra hinanden i alle fire dage, og ved dag 22 hele planten, udpakke og rester var alle væsentligt forskellige fra hinanden (tabel 1). For 15 N inkorporering i anlægskomponenter, der var forskelle mellem dage stiftelsesoverenskomsten og plantevævskulturer fraktioner. For varmt vand ekstrakt alle fire inkorporering dage var signifikant forskellige fra hinanden for 15 N, og for hele anlægget og det varme vand restproduktet kortere dage vedtægterne var væsentligt anderledes end de længere dage af vedtægterne (tabel 1). Plantevævet fraktioner i de ensartede planter var ikke signifikant forskellige fra hinanden i 15 N, men varmt vand ekstrakt og rest var signifikant forskellige fra hinanden i 15 N for det differentielt mærkede kuld.

Alle isotope værdier er rapporteret under anvendelse af atomprocent (atom%) notation (ligning 1), der er en mere præcis notation end% til brug ved høje niveauer af tungtisotop berigelse 21.. For eksempel:

(1)

For denne undersøgelse, vi kørte statistiske analyser ved hjælp af SAS-version 9.2. Vi testede forskelle mellem kammeret indvendige og udvendige lysniveauer anvendelse af en parret t-test. Vi testede forskelle mellem 13 C og 15 N mærkning af varmt vand ekstrakter og varmt vand rester ved hjælp af en-vejs variansanalyse (ANOVA) i PROC ANOVA. Vi brugte Duncans multiple områdetest for multiple sammenligninger analyse. Betydning blev accepteret på P-niveau på 0,05. Vi brugte en Wilcoxon rank sum test for at teste, at de data, der mødte de forudsætninger i analysen.

Figur 1
Figur 1. Schematic diagram af 40 pot kapacitet kontinuerlig multi-isotopmærkning kammer fra et fugleperspektiv. Punkterede linier repræsenterer elektriske ledninger, mens ubrudte linjer repræsenterer gas eller vand slange. Klik her for at se større billede.

Figur 2
. Figur 2. A) Gennemsnitlig CO 2-koncentration (ppm) (+ / -. SE) i løbet af en 24 timer periode for en hel vækstsæson B) Gennemsnitlig temperatur (º C), åbne cirkler, og fugtighed (%), lukkede cirkler . (+ / - SE) over en 24 timer periode for en hel vækstsæson Klik her for at se større imalder.

Uniform (0) Differential (7) Differential (14) Differential (22)
Hele kuldet 13C Atom% 4,46 ± 0,02 Aab 3,93 ± 0,05 Ba 3,64 ± 0,03 Ca 3,35 ± 0,06 Db
15 N atom% 6,69 ± 0,07 Aa 6,72 ± 0,01 Aa 6,33 ± 0,06 Ba 6,41 ± 0,07 Ba
13C Atom% 4,59 ± 0,04 Aa 3,35 ± 0,06 Bb 2,79 ± 0,06 Cb 2,37 ± 0,03 Dc
15 N atom% 6,69 ± 0,03 Aa 6,43 ± 0,01 Bb 5,89 ± 0,07 Db 6,16 ± 0,05 Cb
Varmt vand Rest 13C Atom% 4,37 ± 0,06 Ab 4,1 ± 0,03 Ba 3,79 ± 0,10 Ca 3,66 ± 0,05 Ca
15 N atom% 6,57 ± 0,04 Ba 6,71 ± 0,02 Aa 6,45 ± 0,02 Ca 6,44 ± 0,03 Ca

Tabel 1.

Discussion

Dette design for en kontinuerlig isotopmærkning kammer blev brugt til at producere ensartet og varierende 13C og 15N mærket A. gerardii til efterfølgende felt og laboratorieforsøg. I løbet af tre vækstsæsoner drift, har kammeret med succes fastholdt temperatur, fugtighed og CO 2-koncentrationer inden de indstillede parametre (Figur 2). Pålideligheden af ​​temperatur kontrolsystem er kritisk under spidsbelastning af sommeren, hvor høj solstråling kan medføre overophedning i lufttætte kammer. Fjerne overskydende fugtighed forårsaget af transpiration fra planter, sikrer, at anlægget stomata forblive åben for fotosyntetiske optagelse 22 og at kondensvand ikke hæmmer lysgennemtrængning eller beskadige strukturen af kammeret.

Den næsten løbende overvågning af CO 2-koncentrationen ved Irga software vedligeholdes løbende13C mærkning af planterne, mens de voksede i kammeret. På grund af den høje fotosyntetiske aktivitet af A. gerardii vokser i dette kammer, blev CO 2 sprøjtes ind i systemet ofte i dagtimerne af peak vækstsæsonen når fotosyntetiske aktivitet trak CO 2-koncentrationer ned til 360 ppm, cirka hver 15-20 min. Doseringen af den berigede og naturlige overflod 13C-CO 2 tanke er tilladt for en kontrolleret 4,4 atom-% 13C atmosfæren gennem vækstsæsonen for ensartet plantevæv mærkning. 13C-CO 2-produktion kan også opnås ved blanding af 13C-natrium bicarbonat eller 13C-natriumcarbonat og saltsyre, men denne type system er mere kompliceret og kræver mere kontrol og vedligeholdelse, så vi anbefaler anvendelse af 13C-CO 2-gas. En vigtig overvejelse for overvågning af CO 2 koncentrations ved hjælp af en Irga er, at infrarøde analysatorer miste to tredjedele af deres følsomhed, når måler 13 C-CO 2. Denne undervurdering af cirka 2,9% ppm for vores 4,4% 13 C-CO 2-blanding ikke var af stor bekymring for os, men kan blive et mere omfattende problem, når mærkning på højere 13 C niveauer 27.

A. gerardii er en varm årstid staude tallgrass prærie graminoid arter. Udformningen af dette kammer er optimeret til A. gerardii produktion (figur 1). Størrelsen og højden af kammeret blev valgt som vederlag for den maksimale højde produktivitet A. gerardii på området, såvel som for den ønskede plante biomasseproduktion til fremtidige eksperimenter. A. gerardii er kendt for at være lys begrænset på 24,25. PAR indenfor et drivhus kan mindskes med 30-47% i forhold til ydre niveauer 26. Da vores fabriks blev dyrket i en akrylglas kammer inde i et drivhus, PAR begrænsning var en bekymring. Når den er tændt, det fluorescerende lys steg PAR i kammeret med 9,5%, hvilket kan have bidraget til at øge produktiviteten i denne lette følsomme arter. Når du bruger dette kammer design til at vokse andre typer af planter specifikke fysiologiske behov, såsom størrelse, belysning, næringsstof krav, temperatur følsomhed, og jordfugtighed bør omhyggeligt skræddersyet til at opretholde optimale vækstbetingelser for planterne.

Når man arbejder med dyre isotopmærkede forbindelser, såsom 10 atom-% 13C-CO 2 og 98 atom% 15 N-KNO 3, effektivitet mærkning er en vigtig overvejelse. Dette kammer design optimerer 13C mærkning ved at gøre alle bestræbelser på at forsegle kammeret og minimere luft lækage ind i og ud af kammeret. Hvis dette kammer aldrig er åbnet i løbet af vækstsæsonen, så ingen af de 13 C-mærketed CO 2 fra kammeret er lækket ud til atmosfæren. CO 2 bygge op i løbet af natten respiration synes ikke at beskadige voksende planter og er hurtigt taget op efter solopgang (figur 2). Under differentieret mærkning blev kammeret kortvarigt åbnet for at fjerne de forskelligt mærkede gryder, men det syntes ikke at udvande den målrettede 4,4 atom% 13C mærkning af de løbende mærkede planter (tabel 1). 13C mærkning blev også optimeret ved at skrubbe ud indledende atmosfærisk luft fanget i kammeret ved forsegling. Under de indledende tests på kammeret uden en indledende krat af atmosfærisk CO 2 blev planter målt til at have en fortyndet 13 C-niveau i de første blade, der produceres end i de senere blade produceret. Den oprindelige krat af atmosfærisk CO 2 ved lukning kammer ser ud til at eliminere dette problem ved at tillade kontinuerlig 13C mærkning frasætteplante til modenhed. Fastholdelse af en jord-fri pottemuld blanding af sand, vermikulit og ler fjerner også naturlig overflod CO 2 forurening fra jord åndedræt. Fjernelsen af jord fra systemet kræver omhyggelig befrugtning og podningen overvejelser, der kan være unikke for forskellige plantearter. 15N mærkning ved målrettet 7 atom-% 15 N Hoegland opløsning fremstillet stærkt mærket plantemateriale på 6,7 atom-% 15 N (tabel 1). En svag fortynding fra det målrettede 15 N etiketten kan være forårsaget af nogle naturlige overflod N i potteblanding eller fra den indfødte jord podning.

Under biosyntesen af forbindelser, naturlig diskrimination af 13C (eller 15 N) opstår som følge af kinetisk fraktionering og nonstatistical isotop fordeling i de syntetiserede forbindelser. Således i tilfælde af C, sekundære produkter (f.eks lipiderog phenolforbindelser) er generelt formindsket 13C i forhold til primære produkter (kulhydrater). Denne naturlige 13C diskrimination synes også at fortsætte, når planterne dyrkes i et beriget 13C atmosfære, som det kan ses i den lille forskel i atom% 13 C i varmt vand ekstrakter og varmt vand rester af ensartet mærkede planter (tabel 1 ). Denne naturlige kinetiske fraktionering er meget lille i forhold til den berigelse, og går ikke på kompromis ensartethed mærkningen.

Differential mærkning af strukturelle og metaboliske plantevæv er en ny teknik med potentiale for avancerede studier i kuld nedbrydning, mikrobiel økologi og jordens organiske materiale dannelse. Forskellen i 13 C og 15 N i varmt vand ekstrakter og varmt vand rester indikerer en betydelig udvanding af 13 C og 15 N i udvaskelig, lavmolekylvægt (varmt vand uddrag) fra den strukturelle plantemateriale (varmt vand rester) efter 7, 14 og 22 dages differentieret mærkning (P <0,005). Kan bruges Denne differentieret mærkning af plantevæv at spore skæbne strukturelle og metaboliske komponenter separat gennem et økosystem. 13C differentieret mærkning var mere ekstrem end 15 N differentieret mærkning. Dette kan skyldes, at umiddelbarheden i 13C fortynding, når du fjerner planterne fra de 13 C-CO 2 mærket atmosfære, mens 15 N etiket stadig i potning mix i nogen tid og 15 N fortynding sker langsommere. For mere drastiske differentieret mærkning af 15 N, kan man overveje at skylle potterne med vand før naturlig overflod befrugtning i løbet af de sidste uger af vækst uden for kammeret.

Udformningen og driften af denne kontinuerlige 13 </ Sup> C og 15 N mærkningsordning for uniform eller differentiale, metaboliske og strukturelle, plantevæv mærkning giver en ny metode til fremstilling af isotopmærket plantemateriale til avanceret forskning. Designet og operationelle detaljer i dette kammer er blevet valgt til 4,4 atom% 13 C og 7 atom% 15 N mærkning af A. gerardii, men kan tilpasses til andre plantearter og isotopmærkning niveauer. Vækstbetingelserne er beskrevet her bør være skræddersyet til at passe til størrelse, temperatur, fugtighed, lys, vand og næringsstoffer krav til bestemte plantearter af interesse. Mærkning med 18 O eller 2 H kan også opnås ved mærkning af vand, der anvendes i vandingsanlæg. Den her beskrevne system fat på mange af de udfordringer, ensartet og differentieret 13C mærkning af plantemateriale. Denne grundlæggende kammer design kan bruges af andre forskergrupper til at producere meget mærket plantemateriale til advnansieres studier i økosystemet biogeokemi.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Særlige tak til Plant Growth Facility og EcoCore analytisk facilitet på Colorado State University og til de mange studerende og lærere, der har hjulpet med dette projekt. Dette arbejde er finansieret af NSF DEB tilskud # 0918482, USDA nationale behov Fellowship, og Cotrufo-Hoppess fond for jord økologi forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40 in Remote Tower Fan Living Accents FS10-S3R-A
42 in Electric Tower Fan with remote control LASKO 2559
Mr. Slim Split-type air conditioner Mitsubishi Electric R410A
Electronic 24 hr time switches Intermatic ET100C Operates Fluorescent Light System
iSeries Humidity and Temp Controller Omega CHiTH-i8DV33-5-El
Solid State Relay Omega SSRL240
CKR Series Solid State Relay Crydon
Solenoid Coils Dayton 6X543
GasHound CO2 Analyzer LI-COR LI-800
Dehumidifier Dayton 1DGX4
Specialty gas regulator Airgas CGA 580
T5 Hight Output Commercial Fluorescent Light System Hydro Farm FLT48
Air pump Thermo Scientific 420-1901
Masterflex Cartridge Pump HeadSystem Cole Parmer 7553-70
1900 Series Network Switch Catalyst
Profile Porus Ceramic Top Dressing Greens Grade
Industrial Quartz 40 mesh Unimin 4095
Mycorrhizae Professional Growing Medium ProMix
Vermiculite and Perlite Thermo-Ran C633
Potassium Nitrate- 15N 98 atom % Sigma-Aldrich 335134
Carbon-13C Dioxide 10 atom % Sigma-Aldrich 600180
Medical grade CO2 Airgas
Regulator Airgas CGA 350
4 in box fans Grainger
Masterflex PharMed BPT Tubing Cole Parmer HV-06508-24

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bird, J. A., Torn, M. S. Fine roots vs. Needles: A comparison of (13)C and (15)N dynamics in a ponderosa pine forest soil. Biogeochemistry. 79, 361-382 (2006).
  2. Bird, J. A., van Kessel, C., Horwath, W. R. Stabilization of C-13-carbon and immobilization of N-15-nitrogen from rice straw in humic fractions. Soil Sci. Soc. Am. J. 67, 806-816 (2003).
  3. Denef, K., Six, J. Contributions of incorporated residue and living roots to aggregate-associated and microbial carbon in two soils with different clay mineralogy. Eur. J. Soil Sci. 57, 774-786 (2006).
  4. Rubino, M. Carbon input belowground is the major C flux contributing to leaf litter mass loss: Evidences from a C-13 labelled-leaf litter experiment. Soil Biol. Biochem. 42, 1009-1016 (2010).
  5. Cotrufo, M. F., Wallenstein, M. D., Boot, C. M., Denef, K., Paul, E. The Microbial Efficiency-Matrix Stabilization (MEMS) framework integrates plant litter decomposition with soil organic matter stabilization: do labile plant inputs form stable soil organic matter. Glob. Change Biol. 19, 988-995 (2013).
  6. Mambelli, S., Bird, J. A., Gleixner, G., Dawson, T. E., Torn, M. S. Relative contribution of foliar and fine root pine litter to the molecular composition of soil organic matter after in situ degradation. Org. Geochem. 42, 1099-1108 (2011).
  7. Prescott, C. E. Litter decomposition: what controls it and how can we alter it to sequester more carbon in forest soils. Biogeochemistry. 101, 133-149 (2010).
  8. Denef, K., Roobroeck, D., Wadu, M., Lootens, P., Boeckx, P. Microbial community composition and rhizodeposit-carbon assimilation in differently managed temperate grassland soils. Soil Biol. Biochem. 41, 144-153 (2009).
  9. Bird, J. A., Kleber, M., Torn, M. S. C-13 and N-15 stabilization dynamics in soil organic matter fractions during needle and fine root decomposition. Org. Geochem. 39, 465-477 (2008).
  10. Andresen, L. C., Jonasson, S., Strom, L., Michelsen, A. Uptake of pulse injected nitrogen by soil microbes and mycorrhizal and non-mycorrhizal plants in a species-diverse subarctic heath ecosystem. Plant Soil. 313, 283-295 (2008).
  11. Horwath, W. R., Pregitzer, K. S., Paul, E. A. C-14 Allocation in tree soil systems. Tree Physiol. 14, 1163-1176 (1994).
  12. Denef, K. Community shifts and carbon translocation within metabolically-active rhizosphere microorganisms in grasslands under elevated CO2. Biogeosciences. 4, 769-779 (2007).
  13. Pollierer, M. M., Langel, R., Korner, C., Maraun, M., Scheu, S. The underestimated importance of belowground carbon input for forest soil animal food webs. Ecol. Lett. 10, 729-736 (2007).
  14. Stewart, D. P. C., Metherell, A. K. Carbon (C-13) uptake and allocation in pasture plants following field pulse-labelling. Plant Soil. 210, 61-73 (1999).
  15. Santos, F., Torn, M. S., Bird, J. A. Biological degradation of pyrogenic organic matter in temperate forest soils. Soil Biol. Biochem. 51, 115-124 (2012).
  16. Bromand, S., Whalen, J. K., Janzen, H. H., Schjoerring, J. K., Ellert, B. H. A pulse-labelling method to generate 13C- enriched plant materials. Plant Soil. 235, 253-257 (2001).
  17. Putz, B. A simple method for in situ-labelling with 15N and 13C of grassland plant species by foliar brushing. Methods Ecol. Evol. 2, 326-332 (2011).
  18. Wichern, F., Mayer, J., Joergensen, R., Müller, T. Evaluation of the wick method for in situ <sup>13</sup>C and <sup>15</sup>N labelling of annual plants using sugar-urea mixtures. Plant Soil. 329, 105-115 (2010).
  19. Fahey, T. J. Transport of Carbon and Nitrogen Between Litter and Soil Organic Matter in a Northern Hardwood Forest. Ecosystems. 14, 326-340 (2011).
  20. Stewart, C. E., Paustian, K., Conant, R. T., Plante, A. F., Six, J. Soil carbon saturation: Evaluation and corroboration by long-term incubations. Soil Biol. Biochem. 40, 1741-1750 (2008).
  21. Fry, B. Stable Isotope Ecology. , Springer. (2006).
  22. Nippert, J. B., Fay, P. A., Carlisle, J. D., Knapp, A. K., Smith, M. D. Ecophysiological responses of two dominant grasses to altered temperature and precipitation regimes. Acta Oecol. Int. J. Ecol. 35, 400-408 (2009).
  23. Hoagland, D. R. aA., I, D. The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil. , The College of Agriculture, University of California, Berkeley. Berkeley, CA. (1950).
  24. Lett, M. S., Knapp, A. K. Consequences of shrub expansion in mesic grassland: Resource alterations and graminoid responses. J. Veg. Sci. 14, 487-496 (2003).
  25. Knapp, A. K., Seastedt, T. R. Detritus Aaccumulation limits productivity of tallgrass prairie. Bioscience. 36, 662-668 (1986).
  26. Ting, K. C., Giacomelli, G. A. Solar photosynthetically active radiation transmission through greenhouse glazings. Energy Agric. 6, 121-132 (1987).
  27. McDermitt, D. K., Welles, J. M., Eckles, R. D. Effects of Temperature, Pressure and Water Vapor on Gas Phase Infrared Absorption by CO2. , Li-Cor, Inc.. Lincoln, NE. Forthcoming.

Tags

Miljøvidenskab , plante stabil isotop mærkning Metaboliske forbindelser strukturelle forbindelser varmtvandsekstraktion
Design og drift af en kontinuerlig<sup&gt; 13</sup&gt; C og<sup&gt; 15</sup&gt; N Mærkning Afdeling for Uniform eller differentiale, Metabolisk og Konstruktioner, Plant isotopmærkning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soong, J. L., Reuss, D., Pinney, C., More

Soong, J. L., Reuss, D., Pinney, C., Boyack, T., Haddix, M. L., Stewart, C. E., Cotrufo, M. F. Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling. J. Vis. Exp. (83), e51117, doi:10.3791/51117 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter