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Aufbau und Betrieb einer Dauer Published: January 16, 2014 doi: 10.3791/51117
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,3
1Natural Resource Ecology Laboratory, Colorado State University, 2Soil Plant Nutrient REsearch, USDA-ARS, 3Department of Soil and Crop Sciences, Colorado State University

Summary

Dieses Verfahren wird erläutert, wie Bau und Betrieb einer kontinuierlichen 13 C-und 15 N-Isotopenmarkierung Kammer für eine einheitliche oder Differenzpflanzengewebe Kennzeichnung. Repräsentative Ergebnisse aus Stoffwechsel-und Struktur Kennzeichnung von Andropogon gerardii werden diskutiert.

Abstract

Tracing selten stabile Isotope aus Pflanzenmaterial durch das Ökosystem bietet die sensible Informationen über Ökosystemprozesse, von CO 2-Flussmittel und organische Bodensubstanz Bildung kleinen stabilen Isotopen Biomarker Sondieren. Kopplung mehrerer stabiler Isotope wie 13 C mit 15 N, 18 O oder H 2 hat das Potenzial, noch mehr Informationen über komplexe stöchiometrischen Beziehungen während biogeochemischen Transformationen offenbaren. Isotopen-markierten Pflanzenmaterial wurde in verschiedenen Studien der Streuzersetzung und der organischen Bodensubstanz Bildung 4.1 verwendet. Aus diesen und anderen Studien, aber es hat sich gezeigt, dass die Strukturkomponenten von Pflanzenmaterial anders als Stoffwechselkomponenten (dh. Auswaschbaren niedermolekulare Verbindungen) in Bezug auf die mikrobielle Nutzung und langfristige Kohlenstoffspeicherung 7.5 verhalten. Die Fähigkeit, strukturelle und metabolische Komponenten zu untersuchenstellt getrennt ein leistungsfähiges neues Instrument für die Förderung der Spitze der biogeochemischen Ökosystem-Studien. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von 13 C-und 15 N-markiertem Pflanzenmaterial, die entweder einheitlich in der gesamten Anlage markiert oder unterschiedlich in Struktur-und Stoffwechselanlagenkomponenten gekennzeichnet.

Hier präsentieren wir den Bau und Betrieb einer kontinuierlichen 13 C-und 15 N-Markierung Kammer, die geändert werden, um verschiedene Forschungsbedarf zu erfüllen. Einheitlich markierten Pflanzenmaterial wird durch kontinuierliche Kennzeichnung vom Keimling bis zur Ernte produziert, während Differenz Kennzeichnung durch Entfernen der Pflanzen von den Kammer Wochen vor der Ernte erreicht. Repräsentative Ergebnisse aus wachsenden Andropogon gerardii Kaw demonstrieren die Fähigkeit des Systems, um effizient Label Pflanzenmaterial bei der gezielten Ebenen. Durch dieses Verfahren haben wir Pflanzenmaterial mit einem 4,4 Atom-% 13 C und 6,7 Atom-% 15 <hergestellt/ Sup> N einheitliche Anlage Label oder Material, die unterschiedlich von bis zu 1,29 Atom-% 13 C und 0,56 Atom-% 15 N markiert ist, in seinem Stoffwechsel-und Strukturkomponenten (Warmwasser und Warmwasser extrahierbaren Restkomponenten, beziehungsweise). Herausforderungen liegen in der Aufrechterhaltung der richtigen Temperatur, Luftfeuchtigkeit, CO 2-Konzentration und Lichtstärken in einem luftdichten 13 C-CO 2-Atmosphäre für die erfolgreiche Pflanzenproduktion. Diese Kammer Beschreibung stellt eine nützliche Recherche-Tool, um effektiv gleichmäßig oder unterschiedlich Multi-Isotop Pflanzenmaterial produzieren für den Einsatz in Experimenten auf Ökosystem biogeochemische Kreisläufe.

Introduction

Verständnis der Dynamik der Pflanze-Boden-Atmosphäre Verfahren ist für genau vorherzusagen, wie die globale Kohlenstoff (C) und Stickstoff (N)-Funktion Zyklen unter den gegenwärtigen und zukünftigen Umweltbedingungen. Stabile Isotope sind mächtige Werkzeuge in quantitativen Studien der Pflanze-Boden-Atmosphäre-C-und N Radfahren. Tracing selten stabile Isotope aus Pflanzenmaterial durch das Ökosystem bietet sensible Informationen in den Studien von biogeochemischen Stoffkreisläufen, von der CO 2-Flussmittel und organische Bodensubstanz Bildung kleinen stabilen Isotopen Biomarker Sondieren zB 4,8,9. Die Kombination von 13 C-Markierung mit 15 N-Markierung, oder eine andere stabile Isotope, wie 2 H oder 18 O in Pflanzengewebe bietet eine High-Erkennung, nachvollziehbar, aber komplexe Substrat für den Einsatz in gekoppelten Untersuchungen von Pflanzen-und Boden Biochemie. Die Fähigkeit, gleichmäßig oder unterschiedlich zu kennzeichnen strukturelle und metabolische Pflanzenmaterial adds weitere Fähigkeit, komplexe Fragen zu C-und N-Radtouren durch die Ökosysteme zu adressieren. Der Vorteil der Verwendung von isotopenmarkierten Pflanzenmaterial in quantitativen Studien von C und N Buchhaltung, hängt jedoch von der Fähigkeit, 13 C-und 15 N-markiertes Material, das entweder gleichmäßig oder unterschiedlich markiert ist, zu erzeugen.

Isotopenmarkierung hat in Studien zu Werk C-und N-Assimilation 10, 11 und Zuteilung Rhizodeposition 12 verwendet worden. Einheitlich 13 C-und 15 N-markiertem Pflanzenmaterial bietet eine komplexe markierten Substrat für die Untersuchung der Streuzersetzung 1,4, organische Bodensubstanz Bildung 2,6-, Boden-CO 2-Emissionen 4, Bodennahrungsnetz untersucht 13, und Untersuchungen von Boden C Verweilzeiten 2,14. Studien mit 13 C-markierten Biokohle aus Pflanzenmaterial beschriftet beginnen auch neue Informationen über die früher übersehen zeigenBoden char Pools 15. Während 15 N, 2 H und 18 O-Markierung sind relativ leicht durch Wasser und Dünger Behandlung zu erreichen, besteht die Herausforderung in der Herstellung von gleichmäßig 13 C-markiertem Pflanzenmaterial bis 13 C-CO 2-Fixierung.

Kontinuierliche Isotopenmarkierung von Keimling bis zur Reife in einer abgedichteten Kammer erzeugt einen gleichmäßigen Isotopenmarkierung in der gesamten Anlage. Andere Methoden, wie wiederholt Puls-Markierung 16 und Blattapplikation oder Docht 17,18 nicht gleichmäßig Isotop Pflanzenmaterial, noch klare Differential Kennzeichnung bestimmter C-Verbindungen (zB Stoffwechsel vs Struktur) 19 zu produzieren. Eine wichtige Überlegung bei Isotopenmarkierung ist die Kennzeichnung Effizienz, aufgrund der hohen Kosten für seltene Isotop angereicherten Verbindungen in der Kennzeichnung verwendet. Obwohl kontinuierliche 13 C-Markierung ist in der Vergangenheit 2-4,20 verwendet wurden, gibt es nicht unsere Kenntnisseveröffentlicht eine ausführliche technische Beschreibung eines kontinuierlichen Kennzeichnung Kammer mit dem Nachweis der hohen Markierungseffizienz und genaue Steuerung der Menge und Einheitlichkeit der Isotopenmarkierung.

Auf der Spitze der Streuzersetzung und der organischen Bodensubstanz Bildung Forschung ist das Konzept, dass metabolische Pflanzenmaterial (dh auswaschbaren, labile, niedermolekulare Verbindungen) und Strukturpflanzenmaterial (dh. Lignin, Cellulose, Hemicellulose) unterschiedlich in Bezug auf die mikrobielle verarbeitet Nutzungseffizienz, die organische Bodensubstanz Bildung und langfristige Boden C Lagerung 7.5. Pflanzenmaterial, die unterschiedlich in ihrer Struktur-und Stoffwechselbestandteile beschriftet, daher ist ein nützliches Werkzeug bei der Förderung der Streuzersetzung und der organischen Bodensubstanz Bildung Forschung. Differential Kennzeichnung mit Dual-Isotope ermöglicht die Rückverfolgung von strukturellen und metabolischen Komponenten getrennt durch das Ökosystem mit einem Mehrfach Pool Isotop technique 21.

Kontinuierliche Isotopenmarkierung mit 13 C-und andere Isotope in einer abgedichteten Kammer erfordert eine sorgfältige Aufmerksamkeit auf physiologischen Bedingungen zu pflanzen, um die Produktivität der Anlage und Isotopenmarkierungseffizienz zu maximieren. Tagestemperaturspitzen müssen kontrolliert werden, um Pflanzenschäden zu verhindern, wenn wächst in einer luftdichten Kammer. Eine optimale Palette von Feuchtigkeit und Temperatur sind erforderlich, um offene Pflanze Spaltöffnungen und die CO 2-Aufnahme 22 zu halten. Hohe Luftfeuchtigkeit Ursache Beschlagen der Kammerwände, die Lichtverfügbarkeit reduziert und kann die Kammerstruktur beschädigen. Die sorgfältige Abwägung zu Markierungseffizienz durch die Beseitigung natürlicher Häufigkeit Isotope aus der Kammer (z. B. aus dem Topfen mit der organischen Bodensubstanz kommen) und die Verhinderung der Exposition gegenüber der Außenluft Isotop ist wichtig bei der Arbeit mit teuren schweren Isotop markierten Verbindungen.

Hier präsentieren wir eine Methode für den Bau und Betrieb einEndlosdoppel 13 C und 15 N-Isotopenmarkierung Kammer für die Herstellung von Pflanzenmaterial, die entweder einheitlich markiert ist oder hat seine Struktur-und Stoffwechselkomponenten in unterschiedlichen Ebenen gekennzeichnet. 13 C-Markierung ist an der Kammerebene gesteuert, während der Befruchtung und 15 N-Markierung ist, auf der individuellen Ebene Topf gesteuert. Repräsentative Ergebnisse sind gezeigt, um die Fähigkeit dieses Verfahrens auf Temperatur, Feuchtigkeit und CO 2-Konzentration in der gesamten Vegetationsperiode zu steuern demonstrieren. Ergebnisse von der wachsenden Andropogon gerardii, Kaw auch dieser Methode Fähigkeit, gleichmäßig oder unterschiedlich markierten Pflanzenmaterial produzieren zu demonstrieren. Die beschriebenen speziellen Kammerkonstruktion und Betriebsschema kann geändert werden, um verschiedene Pflanzenarten wachsen, sowie H 2 O oder 18 Kennzeichnung aufnehmen.

Protocol

1. Chamber Construction

  1. Konstruieren Sie die Kennzeichnung Kammer in einem Gewächshaus, um maximale Tageslicht Potenzial für das Pflanzenwachstum zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass eine ausreichende Stromversorgung vorhanden ist, um alle Kammerkomponenten zu versorgen.
  2. Konstruieren Sie die Kennzeichnung Kammer durch die Montage von 3,175 mm dicke, transparente Acryl-Wände (Polycarbonat auch geeignet sein würde) und eine 6,35 mm dicke, transparente Acryl-Decke auf einem Aluminiumrahmen mit einer weiß lackierten Stahlboden, Solarreflexionsgrad zu maximieren. Die Abmessungen der Kammer kann angepasst werden, um einzelne Forschungs Bedürfnisse.
  3. Montieren Sie die Kammer auf ¾ in (19 mm) Sperrholz auf Betonblöcken.
  4. Die Bohrungen in der Acrylglas, Aluminium-und Stahlrahmen und Boden mit Schrauben, um alle Komponenten miteinander zu verbinden.
  5. Verschließen Sie alle Nähte mit Silikon abdichten, um eine luftdichte Abdichtung zu gewährleisten.
  6. Konstruieren Sie eine Tür durch die Montage einer Sektion des Acrylverkleidung an langen Schrauben, die unten mit remo geschraubt werden kannvable Flügelmuttern.
  7. Verschließen Sie die Tür mit Wetter Strippen, um Luft Auslaufen zu verhindern.
  8. Wählen Sie einen Bereich direkt neben der Kammer als Steuerungszentrale, um alle Temperatur, Luftfeuchtigkeit, CO 2-Kontrollen und Überwachungsgeräte montieren.
  9. Kleine Löcher bohren vorsichtig in die Kammerwand neben der Steuerungszentrale für alle elektrischen Leitungen und Gasschlauch. Verwenden Sie Silikon abdichten, um die Löcher herum alle Drähte und Schläuche versiegeln, um Luftverlust zu verhindern.
  10. Testen Sie die Kammer für Luftverlust, indem es mit einem hohen CO 2 (zB 800 ppm) und lässt sie über Nacht stehen. Wenn der CO 2-Konzentration in der Kammer wird auf seinen ursprünglichen Pegel gehalten, dann ist es luftdicht. Wenn die Konzentration fällt über Nacht dann alle Nähte sollten untersucht und mit Silikon abdichten wieder verschlossen werden, bis eine luftdichte Abdichtung erreicht wird.
  11. Für einige Pflanzen eine hohe Lichtbedingungen angepasst, fügen Lichter zu einem Timer auf die unmittelbaren Außenbereich des c verbundenHamber Lichteinfall und die Produktivität der Anlage zu erhöhen.

2. Temperatur-und Feuchtigkeitsregelung

  1. Regulate Kammertemperatur durch die Installation einer kommerziellen Split-Klimaanlage mit den Kühl (Verdampfer) Spulen im Inneren der Kammer und in den Kompressor und Kondensatorspulen außerhalb des Gewächshauses, um die Wärme abzuführen entfernt. Stellen Sie die Klimaanlage, um die gewünschte Temperatur zu halten.
  2. Verwenden Sie einen kleinen Raum Entfeuchter gegen Feuchtigkeit in der Kammer zu steuern.
    1. Bohren Sie ein Drainageloch durch den Boden der Kammer neben dem Entfeuchter.
    2. Entfernen des Kondensatsammlers aus dem Entfeuchter und schließen ein Drainagerohr aus dem Entfeuchter durch das Ablaufloch in dem Boden der Kammer.
    3. Unterhalb der Kammer, legen ein offenes Glas mit Wasser für den Luftentfeuchter direkt in ablassen gefüllt. Dies schafft eine luftdichte Abdichtung, sondern ermöglichen auch für Druckausgleich.
  3. Schließen Sie den Controller an den Entfeuchtungs-System mit einer Solid-State-Relais und den Feuchteregler mit hoher Alarm-und schwingen, um optimale Wachstumsbedingungen in der Kammer zu halten. Optimale Temperatur-und Feuchtigkeitsbedingungen für verschiedene Pflanzenarten unterscheiden.

3. CO 2 Steuer

  1. Die 13 C-CO 2-Anreicherung unter Verwendung von zwei reinen CO 2-Gastanks, eines von 10 Atom-% erreicht 13 C-CO 2 oder höher und einem 1,1 Atom-% 13 C-CO 2 (natürliche Häufigkeit).
  2. Überwachung der CO 2-Konzentration, indem er eine Membranpumpe kontinuierlich ziehen Kammer Luft durch einen Infrarot-Gas Analyzer (IRGA) und dann pumpen die Luft zurück in die Kammer, damit die Aufrechterhaltung eines geschlossenen Systems (Abbildung 1).
  3. Seta Low-Alarm und tote Band auf der IRGA Software, um CO 2-Konzentrationen in einem gewünschten Bereich zu halten. Hier verwenden wir ein Low-Alarm von 360 ppm bei 40 ppm Totzone zu CO 2-Konzentrationen zwischen 360 bis 400 ppm zu halten.
  4. Schließen Sie ein Dosierventil in jedem Tank und stellen Sie sie, um das Ziel 13 C-Anreicherungsgrad zu erreichen sorgfältig. Stellen Sie die Tankregler auf 20 psi.
  5. Legen Sie ein Magnetventil zwischen dem Dosierventil und dem Regler von jedem Tank. Verbinden Sie die Ausgänge der zwei Dosierventile zusammen und Rohr sie in der Mitte der Kammer. Draht ein Solid-State Relais in die Ausgangs IRGA um die Magnetventile (Abbildung 1) zu steuern.

4. Web-basierte Remote Monitoring System

  1. Überwachung der CO 2-Konzentrationen aus dem IRGA Software, indem Sie sie in einer lokalen Datei einmal alle 30 Sekunden.
  2. Erstellen Sie eine benutzerdefinierte Dienstprogramm (zB in Perl oder einer anderen Programmiersprache) zu holenup-Einträge aus der lokalen CO 2-Logging-Datei, zusammen mit der aktuellen Laptop Zeitstempel und laden Sie zu einem Back-End-Web-Anwendung.
  3. Stellen Sie die Web-Anwendung, die Temperatur-und Feuchtigkeitssensor-Daten abfragen.
  4. Verwenden Sie ein Monitoring-System, um den Status der Temperatur in der Kammer alle fünf Minuten, um mögliche Temperaturspitzen, die die Pflanzen zerstören würde, wenn die Klimaanlage ausgefallen verhindern zu überprüfen.
  5. Überwachen Sie die CO 2-, Temperatur-und Feuchtedaten auf jedem Standard-Web-Browser, so dass unerwartete Temperaturspitzen oder CO 2 Tropfen können sofort besucht zu werden.

5. Bewässerungssystem

  1. Bohren Sie ein kleines Loch in der Wand der Kammer Acrylglas pro Topf.
  2. Verwenden Bewässerungsschlauch an ein Tropfbewässerungsring pro Topf zu erstellen und füttern die Bewässerungsschlauch durch die Kammerwand nach außen.
  3. Verschließen Sie die Löcher um den Bewässerungsschlauch mit Silikon abdichtenum Luftleckage zu verhindern.
  4. Auf der Außenseite der Kammer, schließen die Bewässerungsschlauch mit dem Schlauch für eine peristaltische Pumpe.
  5. Verwenden Sie einen kleinen Schlauchklemme schließen Sie alle Bewässerungsschlauch an Luftverlust zwischen dem Gießen verhindern.

6. Topfpflanzen

  1. Wählen Sie einen Pot-Größe für die Pflanzen angebaut angemessen. Hier, 40, 15 L Töpfe verwendet.
  2. Erstellen Sie eine Boden-kostenlos Blumenerde mischen, indem man Sand, Vermiculit und Profil poröse Keramik.
  3. Testen Sie die Wasserhaltekapazität des Blumenerde mischen durch Wiegen eines gefüllten Topf trocken, genießen Sie den Topf mit Wasser und ermöglicht es vollständig ablaufen, und der Topf mit einem Gewicht nass. Verwenden Sie diese maximale Wasserhaltekapazität, um sicherzustellen, dass überschüssigen markierten Dünger und Wasser nicht während der Bewässerung nicht aus den Töpfen auslaufen.
  4. Keimen Samen in Blumenerde vor dem Einpflanzen von ihnen in den Töpfen. Dies stellt sicher, dass nur erfolgreich gekeimten Samen sind in der Kennzeichnung Kammer gestartet.
  5. Impfen t er Sämlinge mit frischem Boden Gülle zu nützlichen Mikroben einzuführen.
  6. Sobald die Samen gekeimt haben, sorgfältig die Sämlinge zu den Töpfen in der gewünschten Anzahl.
  7. Einmal eingemacht, verschieben Sie die Töpfe in die Kammer und montieren jeden Topf mit einem individuellen Bewässerungsschlauch.

7. Die Abdichtung der Kammer

  1. Wenn die erste Dicht die Tür zu der Kammer eine große Masse von Außenluft füllt den Kammerraum. Schrubben Sie dieses externe CO 2 durch den Anschluss eines Natron-Kalk-Wäscher zur Luftpumpe, um die CO 2-Konzentration auf mindestens 200 bis 250 ppm vor dem Befüllen der Kammer wieder auf 400 ppm mit Hilfe der 13 C-CO 2-Tank-Gemisch zu schrubben.
  2. Versuchen Sie, durch die Dauer der Vegetationsperiode halten die Kammer geschlossen, um natürliche Häufigkeit CO 2-Kontamination zu minimieren.
  3. Überwachung des Pflanzenwachstums und passen optisch Düngung und Bewässerung je nach Bedarf.
itel "> 8. Düngung und Bewässerung

  1. Verwenden eine Düngerlösung, beispielsweise eine modifizierte Hoagland-Lösung 23, um die Pflanzen durch das Bewässerungssystem zu befruchten.
  2. Beschriften Sie die Dünger mit 15 N mit Hilfe eines 15 N-KNO 3 Teillösung an der gezielten Atom-% 15 N Ebene durch Mischen von 98 Atom-% 15 N-KNO 3 mit natürlichen Häufigkeit 15 N-KNO 3 (0,37 Atom-% 15 N).
  3. Mixen Sie genug von der Düngerlösung bei jeder Befruchtung Ereignis für die gesamte Kammer, bezogen auf die Wasserhaltekapazität des Blumenerde mischen. Legen Sie die richtige Menge an Dünger für ein Topf in einem Glas, und bereiten so viele Gläser gibt es Töpfe.
  4. Ausspannen Bewässerungsschläuche und legen jede von ihnen in einem Glas mit der Düngerlösung, und dann verbinden Sie sie mit der Schlauchpumpe.
  5. Wasserpflanzen durch das Pumpen von Wasser durch den Schlauchpumpe durch die einzelnen Tropf IRRIsuchung Schläuche regelmäßig, wie die Pflanzen brauchen.
  6. Düngung mit Hoagland-Lösung sollte die Pflanze Nachfrage oder experimentellen Design zu folgen, mit zunehmender Nährstoffbedarf wie die Produktivität der Anlage erhöht die Produktivität zu maximieren.
  7. Zuerst pumpen die Hoagland-Lösung durch den Bewässerungsschlauch, dann Pumpe mit Wasser spülen bis hin zu Algen-und Bakterienwachstum in den Rohren zu minimieren.
  8. Umspannen alle Schläuche nach der Befruchtung und Bewässerung zu Kammer Luftverlust zu beseitigen.

9. Uniform-und Differenz Labeling

  1. Für Differenz Kennzeichnung von Struktur-und Stoffwechselbestandteile, entfernen Sie Pflanzen aus Etikettierkammer 1-3 Wochen vor der Ernte. Pflanzen, die einheitlich gekennzeichnet werden können in der verschlossenen Kammer Kennzeichnung kontinuierlich bis zur Ernte zu bleiben und mit den 15 N-Hoagland-Lösung bewässert.
  2. Bewahren Sie die entfernten Pflanzen im Gewächshaus während dieser Zeit, so dass sie ausreichend Licht erhaltenund CO 2 in natürlicher Häufigkeit 13 C.
  3. Für Differenz 15 N-Markierung, weiter zu düngen und bewässern die Pflanzen wie üblich, sondern verwenden natürliche Häufigkeit 15 N-KNO 3 in der Hoaglands Düngerlösung.

10. Ernte

  1. Stoppen Bewässerung von Pflanzen bis 1 Woche vor der Ernte so Pflanzen beginnen zu altern und Blumenerde Medium trocknet aus.
  2. Öffnen Sie die Kammer und bewegen Sie die Töpfe für sofortige Clipping und Ernte der oberirdischen Biomasse
  3. Gießen Sie das Blumenerde mischen und Wurzeln über ein grobes Sieb.
  4. Verwenden Sie den Bildschirm, um aus der Blumenerde mischen trennen die Wurzeln und schütteln die Wurzeln frei von Blumenerde mischen.
  5. Legen Sie die Wurzeln auf einem 2-mm-Sieb und spülen Sie sie mit Wasser, um alle verbleibenden Einbettungsmaterial zu entfernen. Pinzette, jede Vermiculit, die zu den Wurzeln festhalten können, zu entfernen.
  6. Lassen Wurzeln an der Luft trocknen in der Vorbereitung für zukünftige Experimente.

  1. Wiegen der Luft trocknen Pflanzenmaterial auf die Kennzeichnung Kammer Biomasse zu bestimmen.
  2. Grind eine Teilstichprobe für die chemische Analyse.
  3. Zeigen 2,0 g Ofen (60 ° C) in einem Wurf 125 ml Flasche mit Säure gewaschen und 50 ml VE-Wasser.
  4. Legen Sie die Probe auf einer vorgewärmten (60 ° C) Rührer Platte und setzen Sie ein Rührstab in den Kolben. Stellen Sie das Rühren für 200 min und damit die Probe für 30 Minuten zu erhitzen.
  5. Nach 30 min, filtern Sie die Lösung durch einen Wurf 20 um Nylonnetz auf einer Vakuum-Filtersystem.
  6. Der Extrakt mit einem vorgewogenen Säure gewaschen Rohr und einfrieren.
  7. Übertragen Sie die Fest Wurf Rückstand einer vorher gewogenen Aluminiumschale und trocken bei 60 ° C Wiegeschale und Wurf nach dem Trocknen, um heißes Wasser Rest Masse zu bestimmen.
  8. Gefriertrockne die Heißwasserextrakt und wiegen um die Heißwasserextrakt Masse zu bestimmen.
  9. Analysieren Ofen getrocknet (60 ° C) Wurf, gefriergetrocknet WarmwasserExtrakt und im Ofen getrocknet Warmwasserrest in einem Elemental Analyzer - Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (EA-IRMS).

Representative Results

Unsere Kennzeichnung Kammer ist 1,2 mx 2,4 mx 3,6 m groß und hält 40,15 L Töpfe (Abbildung 1). Das EDV-System gepflegt IRGA Steuer CO 2-Konzentrationen zwischen unseren eingestellten Werte von 360 und 400 ppm während der photosynthetisch aktiven Zeit des Tages (Abbildung 2a). Die niedrige CO 2-Alarm-Funktion auf dem IRGA ausgelöst Magnetventile, damit CO 2 aus der 13 C angereichert und natürlichen Häufigkeit Tanks in die Kammer, wenn die Konzentration sank unter der Mindestgrenze (zB 360 ppm). Die Toten Band-Funktion den Fluss gestoppt, wenn die Konzentration des oberen Sollwert (zB 400 ppm) erreicht. Die iSeries Temperatur-und Feuchtigkeitsüberwachungssystem der Klimaanlage und Entfeuchter in der gesamten Vegetationsperiode statt Klimabedingungen innerhalb der eingestellten Parameter verbunden (Bild 2b). Wir haben eine Ein-Tonnen (3,5 kW) Klimaanlage nach KEep die Kammer cool.

Das Fernüberwachungssystem erlaubt die protokollierten Daten zu jeder Zeit von einem Standard-Web-Browser angezeigt werden. Die CO 2-Konzentration, Temperatur-und Feuchtewerte wurden von der Web-Anwendung abgetastet, um Diagramme in den letzten 24-240 h anzuzeigen, in 24-Stunden-Schritten. Dies schuf eine schnelle visuelle, um zu bestätigen, dass die täglichen Schwankungen lagen innerhalb der erwarteten Grenzen. Anzeigen der Web-Oberfläche zeigten auch die aktuelle Kammer-Status, sowie Warnungen versehen, um potenzielle Probleme, wie die jüngsten Daten nicht erhalten. Zu jeder Zeit der komplette Datensatz könnte auch von der Web-Oberfläche heruntergeladen werden.

Wir messen photosynthetisch aktiven Strahlung (PAR) in der unmittelbaren Innen-und Außenseite der Kammer an vier Punkten mit und ohne die Lichter auf in der Mitte des Sommers und der Mitte des Tages mit einem Quantensensor. Die PAR in der Kammer betrug 31,5% niedriger als im Außenraum, wenn die Lichter wehe aus und 22% niedriger als der äußere, wenn die Lichter waren. So helfen die Kammerleuchten PAR Penetration innerhalb der Kammer deutlich um 9,5% (P <0,05).

Unsere kontinuierliche Kennzeichnungssystem konnte 2759 g A. produzieren gerardii Biomasse, 37% auf die oberirdische Biomasse und 63% auf die unterirdische Biomasse. Wir erreichten eine 4,4 Atom% C 13 ganze Pflanze Etikett in unserem einheitlichen Pflanzenmaterial, indem die Magnetventile an den beiden CO 2 Tanks entsprechend (Abbildung 1, Tabelle 1). Wir erreichten eine 6,7 Atom-% 15 N ganze Pflanze Etikett in unserem einheitlichen Pflanzenmaterials durch Mischen von 98 Atom-% 15 N-KNO 3 mit 0,37 Atom-% 15 N-KNO 3 in der KNO 3 Teillösung eines modifizierten Hoagland-Lösung 23 (Tabelle 1) . Wir tränkte die A. gerardii wöchentlich mit insgesamt 750 ml Flüssigkeit (Wasser plus Hoagland-Lösung) während der gesamten Vegetations MeerSohn. Wir befruchtet mit 200-500 ml 15 N markiert Hoagland-Lösung pro Woche je nach Anlagenproduktivität.

Wir nutzten das heiße Wasser-Extraktions-Verfahren, um festzustellen, ob es Unterschiede zwischen der Isotopen einheitliche und unterschiedlich markierten Pflanzenmaterial. Für die unterschiedlich markierten Pflanzen, ernten wir auf alle Blätter entfernt, die völlig tot waren und diese separat behandelt, da sie wahrscheinlich nicht unterschiedlich markiert wurden. Beim Blick auf 13-C-Gehalt, wurden alle vier Tage Einarbeitung deutlich voneinander verschieden für die gesamte Anlage und dem Heißwasserextrakt, aber für das heiße Wasser Rest Tag 14 und 22 waren nicht signifikant voneinander verschieden (Tabelle 1). Beim Vergleich der Pflanzengewebefraktionen innerhalb jeder Tag wurden die Heißwasserextrakt und Rückstand deutlich voneinander verschieden für alle vier Tage und 22 Tage nach der ganzen Pflanze, zu extrahieren, und Rest waren significantly voneinander verschieden (Tabelle 1). Für die 15 N-Einbau in Anlagenteilen, gab es Unterschiede zwischen den Tagen der Gründung und Pflanzengewebe Fraktionen. Für Heißwasserextrakt alle vier der Einbau Tage waren signifikant unterschiedlich voneinander 15 N, und für die gesamte Anlage und das heiße Wasser Rest die kürzeren Tagen Einarbeitung deutlich anders als die längeren Tage des Einbaus (Tabelle 1). Das Pflanzengewebe Fraktionen in den einheitlichen Pflanzen waren nicht signifikant unterschiedlich voneinander in 15 N, aber die Heißwasserextrakt und Rückstand waren signifikant unterschiedlich voneinander in 15 N für die differentiell markierten Treu.

Alle Isotopenwerte werden mit Hilfe der Atomprozent (Atom-%) Notation (Gleichung 1), die eine genauere Bezeichnung als% auf einem hohen Niveau von Schwer verwenden ist gemeldetIsotopenanreicherung 21. Zum Beispiel:

(1)

Für diese Studie liefen wir statistische Analysen mit SAS Version 9.2. Wir testeten Unterschiede zwischen den Innen-und Außenraum Lichtverhältnissen mit einem gepaarten t-Test. Wir testeten Unterschiede zwischen 13 C und 15 N-Markierung von heißem Wasser extrahiert und Warmwasser-Rückstände mit einer Varianzanalyse (ANOVA) in PROC ANOVA. Wir haben mehrere Testbereich Duncan für Mehrfachvergleiche Analyse. Signifikanz wurde bei einem p-Wert von 0,05 angenommen. Wir verwendeten einen Wilcoxon-Rangsummentest, um zu testen, dass die Daten die Annahmen erfüllt der Analyse.

Figur 1
Fig. 1 ist. Schematic Diagramm der 40 Topf Kapazität kontinuierliche Mehrisotopenmarkierung Kammer von Augenansicht des Vogels. Gepunktete Linien stellen elektrische Leitungen, während feste Linien stellen Gas-oder Wasserschläuche. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 2
. Abbildung 2 A) Durchschnittliche CO 2-Konzentration (ppm) (+ / -. SE) über einen 24 Stunden Zeit für eine gesamte Vegetationsperiode B) Durchschnittstemperatur (º C), offene Kreise und Feuchte (%), geschlossene Kreise . (+ / - SE) über einen 24 Stunden Zeit für eine gesamte Vegetationsperiode Klicken Sie hier, um größere im sehenAlter.

Uniform (0) Differential (7) Differential (14) Differential (22)
Whole Wurf 13 Atom-% C 4,46 ± 0,02 Aab 3,93 ± 0,05 Ba 3,64 ± 0,03 Ca 3,35 ± 0,06 Db
15 Atom-% N 6,69 ± 0,07 Aa 6,72 ± 0,01 Aa 6.33 ± 0.06 Ba 6,41 ± 0,07 Ba
13 Atom-% C 4,59 ± 0,04 Aa 3,35 ± 0,06 Bb 2,79 ± 0,06 Cb 2,37 ± 0,03 Dc
15 Atom-% N 6.69 ± 0.03 Aa 6,43 ± 0,01 Bb 5,89 ± 0,07 Db 6.16 ± 0.05 Cb
Hot Water Rückstands 13 Atom-% C 4.37 ± 0.06 Ab 4,1 ± 0,03 Ba 3,79 ± 0,10 Ca 3,66 ± 0,05 Ca
15 Atom-% N 6,57 ± 0,04 Ba 6,71 ± 0,02 Aa 6,45 ± 0,02 Ca 6,44 ± 0,03 Ca

Tabelle 1.

Discussion

Dieser Entwurf für eine kontinuierliche Isotopenmarkierung Kammer wurde verwendet, um einheitlich und differentiell produzieren 13 C-und 15 N-markierten A. gerardii für nachfolgende Feld-und Laborversuchen. Während drei Vegetationsperioden des Betriebs, hat die Kammer erfolgreich behauptet Temperatur, Luftfeuchtigkeit und CO 2-Konzentrationen innerhalb der eingestellten Parameter (Abbildung 2). Die Zuverlässigkeit der Temperaturregelung während der Peak des Sommers bei hoher Sonneneinstrahlung kann zu einer Überhitzung in der luftdichten Kammer kritisch. Die Beseitigung überschüssiger Feuchtigkeit durch Transpiration verursacht von den wachsenden Pflanzen sorgt dafür, dass Spaltöffnungen für die photosynthetischen Pflanzenaufnahme 22 und, dass Wasser keine Kondensation Lichteinfall hemmen oder die Struktur der Kammer beschädigen bleiben offen.

Die in der Nähe von kontinuierlichen Überwachung der CO 2-Konzentration durch die IRGA Software hat sich kontinuierlich13 C-Markierung der Pflanzen während sie in der Kammer steigt. Aufgrund der hohen Photosyntheseaktivität von A. gerardii in dieser Kammer wächst, CO 2 wurde in das System häufig bei Tageslicht des Spitzenvegetationsperiode, wenn die photosynthetische Aktivität zog CO 2-Konzentrationen bis zu 360 ppm, etwa alle 15-20 min injiziert. Die Dosierung der bereichert und natürliche Häufigkeit 13 C-CO 2-Panzer für eine kontrollierte 4,4 Atom-% 13 C-Atmosphäre erlaubt durch die Vegetationszeit für eine einheitliche Kennzeichnung Pflanzengewebe. 13. C-CO 2-Produktion kann auch durch Mischen 13 C-Natrium erreicht werden Bicarbonat oder 13 C-Natriumcarbonat und Salzsäure, aber diese Art von System ist komplizierter und erfordert mehr Überwachung und Wartung, so dass wir empfehlen, mit 13 C-CO 2-Gas. Eine wichtige Überlegung für die Überwachung von CO 2 concentrations mit einem IRGA ist, dass Infrarot-Analysatoren verlieren zwei Drittel ihrer Empfindlichkeit bei der Messung von 13 C-CO 2. Diese Unterschätzung von rund 2,9% ppm für unsere 4,4% 13 C-CO 2-Gemisch war nicht von großer Bedeutung für uns, aber könnte ein wichtiges Thema bei der Markierung bei höheren 13 C-Spiegel 27 geworden.

A. gerardii ist eine warme Saison mehrjährige gras tallgrass graminoid Arten. Das Design dieser Kammer wurde von A. optimiert gerardii Produktion (Abbildung 1). Die Größe und die Höhe der Kammer in Rücksicht auf die maximale Höhe der Produktivität von A. gewählt gerardii auf dem Feld, als auch für die gewünschte Anlage Biomasseproduktion für zukünftige Experimente. A. gerardii ist bekannt, dass Licht in dem Bereich 24,25 begrenzt sein. PAR in einem Gewächshaus durch 30-47% vermindert im Vergleich zur äußeren Ebenen 26 werden. Da unsere Anlages wurden in einem Acrylglaskammer in einem Gewächshaus angebaut, PAR Einschränkung war ein Anliegen. Wenn eingeschaltet, erhöht die Leuchtstofflampen PAR innerhalb der Kammer um 9,5%, was dazu beigetragen haben kann, um die Produktivität in diesem lichtempfindlichen Arten zu erhöhen. Bei der Verwendung dieses Kammer-Konstruktion, um andere Arten von Pflanzen spezifischen physiologischen Bedürfnisse wie Größe, Beleuchtung, Nährstoffansprüche, Temperaturempfindlichkeit und Bodenfeuchte wachsen sollte sorgfältig abgestimmt werden, um optimale Wachstumsbedingungen für die Pflanzen zu halten.

Wenn mit teuren isotopenmarkierte Verbindungen, beispielsweise 10 Atom-% 13 C-CO 2 und 98 Atom-% 15 N-KNO 3, Effizienz der Markierung ist ein wichtiger Gesichtspunkt. Diese Kammer-Design optimiert die 13 C-Markierung durch alle Anstrengungen, um die Kammer zu versiegeln und minimieren Luftverlust in die und aus der Kammer. Wenn diese Kammer nie während der Vegetationsperiode geöffnet, dann wird keiner der 13 C-Labeled CO 2 aus der Kammer in die Atmosphäre ausgetreten. Die CO 2-Aufbau während der Nacht die Atmung wird nicht angezeigt, um die wachsenden Pflanzen schädigen und wird schnell bis nach Sonnenaufgang (Abbildung 2) übernommen. Während Differential Markierung wurde die Kammer kurzzeitig geöffnet, um die differentiell markierten Töpfe zu entfernen, aber dies nicht angezeigt, um die Ziel 4,4 Atom-% 13 C-Markierung der markierten kontinuierlich Pflanzen (Tabelle 1) zu verdünnen. 13 C-Markierung wurde durch Auswaschen der optimierten beim Abdichten in der Kammer anfänglichen atmosphärischen Luft gefangen. In Vorversuchen an der Kammer ohne Anfangspeeling der atmosphärischen CO 2 wurden die Pflanzen gemessen, um eine verdünnte 13 C-Ebene in den ersten Blätter produziert als in den späteren Blättern hergestellt haben. Die Anfangspeeling der atmosphärischen CO 2 beim Kammerverschluss scheint dieses Problem, indem sie für den Dauer 13 C-Markierung aus beseitigenSämling bis zur Fälligkeit. Die Aufrechterhaltung einer Boden-kostenlos Blumenerde Mischung aus Sand, Vermiculit und Ton beseitigt auch natürliche Häufigkeit CO 2-Kontamination von Bodenatmung. Die Beseitigung der Erde aus dem System nicht erfordern eine sorgfältige Düngung und Impfung Überlegungen, die einzigartig für verschiedene Pflanzenarten sein können. 15 N-Markierung durch die gezielte 7 Atom-% 15 N Hoegland hoch markierten Pflanzenmaterial mit 6,7 Atom-% 15 N (Tabelle hergestellte Lösung 1). Eine leichte Verwässerung durch die gezielte 15 N Markierung kann durch einige natürliche Fülle N in der Blumenerde mischen oder aus dem heimischen Boden Impfung verursacht werden.

Während der Biosynthese von Verbindungen tritt natürliche Unterscheidung der 13 C (oder 15 N) als Ergebnis der kinetischen Fraktionierung und nicht-statistische Isotopenverteilung in der synthetisierten Verbindungen. Somit wird in dem Fall von C, Nebenprodukte (z. B. Lipide,, Phenol-Verbindungen) werden in der Regel bei 13 C im Vergleich zu abgereichertem Primärprodukte (Kohlenhydrate). Diese natürlichen 13 C-Diskriminierung wird auch beibehalten, wenn die Pflanzen in einem 13 C-angereicherten Atmosphäre gezüchtet, wie in dem kleinen Unterschied in Atom-% 13 C der Heißwasser-und Heißwasserextrakten Reste der einheitlich markierten Pflanzen (Tabelle 1 ersichtlich, ). Diese natürliche kinetische Auftrennung sehr klein ist im Vergleich zu der Anreicherung und nicht die Gleichmäßigkeit der Etikettierung beeinträchtigt.

Differential Kennzeichnung von Struktur-und Stoffwechselpflanzengewebe ist eine neuartige Technik mit Potenzial für weiterführende Studien in Streuabbau, mikrobielle Ökologie und Bildung der organischen Bodensubstanz. Der Unterschied in der 13 C und 15 N von der Heißwasser-und Heißwasserextrakten Resten zeigt eine beträchtliche Verdünnung von 13 C und 15 N in der auslaugbaren, niedrigemolekulare Verbindungen (Heißwasserextrakte) aus dem Strukturpflanzenmaterial (Warmwasserreste) nach 7, 14 und 22 Tagen nach der Differential-Kennzeichnung (P <0,005). Dieser Differenz Kennzeichnung von Pflanzengeweben verwendet werden, um das Schicksal von Struktur-und Stoffwechselkomponenten getrennt durch ein Ökosystem zu verfolgen. Die 13 C-Differential Kennzeichnung war extremer als 15 N Differential-Kennzeichnung. Dies kann aufgrund der Unmittelbarkeit 13 C Verdünnung bei der Entnahme der Pflanzen aus dem 13 C-markiertem CO 2-Atmosphäre, während das Etikett noch 15 N in der Blumenerde bleibt für einige Zeit und 15 N Verdünnung langsamer auftritt. Für weitere drastische Differenz Kennzeichnung von 15 N, kann man überlegen, Spülen der Töpfe mit Wasser vor der natürlichen Häufigkeit der Befruchtung in den letzten Wochen des Wachstums außerhalb der Kammer.

Die Konstruktion und der Betrieb dieser kontinuierlichen 13 </ Sup> C-und 15 N-Beschriftungssystem zur Uniform oder Differential-, Stoffwechsel-und Struktur, Pflanzengewebe Kennzeichnung stellt ein neues Verfahren zur Herstellung von isotopenmarkierten Pflanzenmaterial für die fortgeschrittene Forschung. Das Design und die praktischen Einzelheiten dieser Kammer wurden für 4,4 Atom-% 13 C und 7 Atom-% 15 N Kennzeichnung von A. gewählt gerardii, kann aber auf andere Pflanzenarten und-Isotopenmarkierung Stufen angepasst werden. Die hier beschriebenen Wachstumsbedingungen sollten angepasst werden, um die Größe, Temperatur, Feuchtigkeit, Licht, Wasser und Nährstoffansprüche der einzelnen Pflanzenarten von Interesse zu entsprechen. Markierung mit 18 O 2 oder H kann auch durch Markieren der in dem Bewässerungssystem verwendete Wasser erreicht werden. Das hier beschriebene System greift viele der Herausforderungen des einheitlichen und Differential 13 C-Kennzeichnung von Pflanzenmaterial. Diese Grund Kammer-Konstruktion kann von anderen Forschungsgruppen zu hoch markierten Pflanzenmaterial für adv verwendet werdenERWEITERTE Studien Ökosystem Biogeochemie.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Besonderer Dank gebührt dem Pflanzenwachstumsfazilität EcoCore analytische Anlage an der Colorado State University und an die vielen Schüler und Lehrer, die an diesem Projekt geholfen. Diese Arbeit wird von der NSF DEB Zuschuss # 0918482, USDA National Needs Fellowship und der Cotrufo-Hoppess Fonds für Bodenökologie Forschung finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40 in Remote Tower Fan Living Accents FS10-S3R-A
42 in Electric Tower Fan with remote control LASKO 2559
Mr. Slim Split-type air conditioner Mitsubishi Electric R410A
Electronic 24 hr time switches Intermatic ET100C Operates Fluorescent Light System
iSeries Humidity and Temp Controller Omega CHiTH-i8DV33-5-El
Solid State Relay Omega SSRL240
CKR Series Solid State Relay Crydon
Solenoid Coils Dayton 6X543
GasHound CO2 Analyzer LI-COR LI-800
Dehumidifier Dayton 1DGX4
Specialty gas regulator Airgas CGA 580
T5 Hight Output Commercial Fluorescent Light System Hydro Farm FLT48
Air pump Thermo Scientific 420-1901
Masterflex Cartridge Pump HeadSystem Cole Parmer 7553-70
1900 Series Network Switch Catalyst
Profile Porus Ceramic Top Dressing Greens Grade
Industrial Quartz 40 mesh Unimin 4095
Mycorrhizae Professional Growing Medium ProMix
Vermiculite and Perlite Thermo-Ran C633
Potassium Nitrate- 15N 98 atom % Sigma-Aldrich 335134
Carbon-13C Dioxide 10 atom % Sigma-Aldrich 600180
Medical grade CO2 Airgas
Regulator Airgas CGA 350
4 in box fans Grainger
Masterflex PharMed BPT Tubing Cole Parmer HV-06508-24

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References

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Umweltwissenschaften Heft 83, Anlage stabile Isotopenmarkierung, Stoffwechselverbindungen strukturelle Verbindungen Heißwasserextraktion
Aufbau und Betrieb einer Dauer<sup&gt; 13</sup&gt; C und<sup&gt; 15</sup&gt; N Labeling Kammer für Uniform oder Differential, Stoffwechsel-und Struktur, Pflanze Isotope Labeling
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Soong, J. L., Reuss, D., Pinney, C., … More

Soong, J. L., Reuss, D., Pinney, C., Boyack, T., Haddix, M. L., Stewart, C. E., Cotrufo, M. F. Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling. J. Vis. Exp. (83), e51117, doi:10.3791/51117 (2014).

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