Summary
Denne metoden forklarer hvordan du skal bygge og drive et kontinuerlig 13 C og 15 N isotop merking kammer for uniform eller differensial plantevev merking. Representative resultater fra metabolske og strukturelle merking av Andropogon gerardii blir diskutert.
Abstract
Tracing sjeldne stabile isotoper fra plantemateriale gjennom økosystemet gir den mest sensitive opplysninger om økosystemprosesser, fra CO 2 flussmidler og organisk materiale i jord dannelse til småskala stabil-isotop biomarkør sondering. Kobling av flere stabile isotoper som for eksempel 13 C med 15 N, 18 O eller 2, H har potensial til å avsløre enda mer informasjon om komplekse støkiometriske forhold under biokjemiske transformasjoner. Isotop-merket plantemateriale har vært brukt i forskjellige studier av kullet nedbrytning og jord organisk materiale dannelse 1-4. Fra disse og andre studier har det imidlertid blitt klart at konstruksjonsdeler av plantemateriale oppfører seg annerledes enn metabolske komponenter (dvs.. Utlutbare lavmolekylære forbindelser) med hensyn til mikrobiell utnyttelse og langvarig lagring av karbon 5-7. Evnen til å studere strukturelle og metabolske komponenterseparat gir et kraftig nytt verktøy for å fremme forkant av økosystem biogeokjemiske studier. Her beskriver vi en fremgangsmåte for fremstilling av 13 C, og 15 N-merket plantemateriale som enten er jevnt merket gjennom hele anlegget eller differensielt merket i strukturelle og metabolske anleggsdeler.
Her presenterer vi bygging og drift av en sammenhengende 13 C og 15 N merking kammer som kan endres for å møte ulike forskningsbehov. Jevnt merket plantemateriale er produsert av sammenhengende merking fra frøplante å høste, mens differensial merking oppnås ved å fjerne de voksende planter fra kammeret uker før innhøsting. Representative resultater fra voksende Andropogon gerardii Kaw demonstrere systemets evne til effektivt etiketten plantemateriale på målrettede nivåer. Gjennom denne metoden har vi produsert plantemateriale med en 4,4 atom% 13 C og 6,7 atom% 15 </ Sup> N uniform plante etikett, eller materiale som er ulikt merket med inntil 1,29 atom% 13 C og 0,56 atom% 15 N i sin metabolske og strukturelle komponenter (varmt vann utvinnbar og varmt vann rest komponenter, henholdsvis). Utfordringene ligger i å opprettholde riktig temperatur, fuktighet, CO 2-konsentrasjon, og lysnivået i en lufttett 13 C-CO 2 atmosfære for vellykket planteproduksjon. Dette kammeret beskrivelse representerer et nyttig forskningsverktøy for å effektivt produsere jevnt eller differentially multi-isotop merket plantemateriale til bruk i eksperimenter på økosystemet biogeokjemiske sykling.
Introduction
Forstå dynamikken i plante-jord-atmosfære prosesser er avgjørende for nøyaktig forutsi hvordan den globale karbon (C) og nitrogen (N) sykluser funksjon under nåværende og fremtidige miljøforhold. Stabile isotoper er kraftige verktøy i kvantitative studier av plante-jord-atmosfæren C og N sykling. Tracing sjeldne stabile isotoper fra plantemateriale gjennom økosystemet gir sensitiv informasjon i studier av biogeokjemiske sykling, fra CO 2 flussmidler og organisk materiale i jord dannelse til småskala stabil-isotop biomarkør sondering f.eks 4,8,9. Ved å kombinere 13 C merking med 15 N merking, eller andre stabile isotoper som for eksempel 2-H, eller 18 O i plantevev gir en høy-deteksjon, sporbare, men kompleks substrat for bruk ved koblede studier av plante-og jord biokjemi. Evnen til å uniformt eller forskjellig merkelapp strukturelle og metabolsk plantemateriale adds videre evne til å håndtere komplekse spørsmål om C-og N sykling gjennom økosystemer. Fordelen med å bruke isotope merket plantemateriale i kvantitative studier av C-og N regnskap, men er avhengig av evnen til å produsere 13 C, og 15 N-merket materiale som er enten ensartet eller forskjellig merket.
Isotop merking har blitt brukt i studier som omhandler anlegg C og N assimilering 10, tildeling 11 og rhizodeposition 12. Jevnt 13 C og 15 N merket plantemateriale gir en kompleks merket substrat for studier av søppel nedbrytning 1,4, organisk materiale i jord dannelse 2,6, jord CO 2-utslipp 4, jord mat web studerer 13, og studier av jord C oppholdstid 2,14. Studier utnytte 13 C merket biokull fra merket plantemateriale begynner også å avdekke ny informasjon om tidligere oversettjord røye bassenger 15. Mens 15 N, 2 H, og 18 O merking er relativt enkelt å oppnå gjennom behandling vann og gjødsel, finnes utfordringen i å produsere jevnt 13 C merket plantemateriale gjennom 13 C-CO 2 fiksering.
Kontinuerlig isotop merking fra frøplante til forfall i et forseglet kammer gir ensartet isotop merking gjennom hele anlegget. Andre metoder som gjentatte puls merking 16 og bladgjødsling eller fukttransporterende 17,18 ikke produserer jevnt isotop merket plantemateriale, og heller ikke klart differensial merking av spesifikke C-forbindelser (for eksempel stoffskifte vs strukturell) 19. Et viktig hensyn i isotop merking er merking effektivitet, på grunn av den høye kostnaden av sjeldne isotopen anrikede forbindelser som brukes i merking. Selv om kontinuerlig 13 C merking er blitt brukt i det siste 2-4,20, er det ikke til vår kunnskapen publisert detaljert teknisk beskrivelse av en fortløpende merking kammer med tegn på høy merking effektivitet og nøyaktig kontroll av mengde og ensartethet av isotop-merking.
På forkant av kullet nedbrytning og organisk materiale i jord dannelse forskning er konseptet at metabolsk plantemateriale (dvs. utvaskbare, labile, lavmolekylære forbindelser) og strukturell plantemateriale (dvs.. Lignin, cellulose, hemicellulose) behandles ulikt i form av mikrobiell bruke effektivitet, organisk materiale i jord dannelse, og lang sikt jord C lagring 5-7. Plantemateriale, som er differensiert merket i sine strukturelle og metabolske komponenter, derfor er et nyttig verktøy for å fremme kull nedbrytning og organisk materiale i jord dannelse forskning. Differensial merking med to isotoper gir mulighet for sporing av strukturelle og metabolske komponenter separat gjennom økosystemet ved hjelp av en multippel-pool isotopen technique 21.
Kontinuerlig isotop merking med 13 C og andre isotoper i et forseglet kammer krever nøye oppmerksomhet å plante fysiologiske forhold til å maksimere produktiviteten på anlegget og isotop merking effektivitet. Dagtemperatur pigger må reguleres for å hindre planteskade ved dyrking i et lufttett kammer. En optimal spekter av luftfuktighet og temperatur er nødvendig for å opprettholde en åpen plante stomata og CO 2-opptak 22. Høye nivåer av fuktighet årsaken fogging av kammerveggene, noe som minimerer lys tilgjengelighet og kan skade kammerstrukturen. Nøye vurdering isotopseparatorer merking effektivitet ved å eliminere naturlige overflod isotoper fra kammeret (f.eks kommer fra potting med jord organisk materiale) og hindre eksponering for ekstern luft er viktig når du arbeider med dyre heavy-isotop merkede forbindelser.
Her presenterer vi en metode for å bygge og drivekontinuerlig dual 13 C, og 15 N isotop merking kammer for fremstilling av plantemateriale som enten er jevnt merket eller har sin strukturelle og metabolske komponenter merket på forskjellige nivåer. 13C merkingen styres ved kammerets overflate, mens befruktning og 15 N merking er kontrolleres ved den enkelte potten nivå. Representative resultater er vist for å demonstrere evnen som denne fremgangsmåten for å kontrollere temperatur, fuktighet og CO2-konsentrasjon gjennom hele vekstsesongen. Resultater fra voksende Andropogon gerardii, Kaw også demonstrere metodens evne til å produsere jevnt eller differensielt merket plantemateriale. Den spesifikke kammer konstruksjon og drift-ordningen som er beskrevet kan bli modifisert for å dyrke forskjellige plantearter, i tillegg til å imøtekomme 2 H, eller 18 O merking.
Protocol
En. Kammer Construction
- Konstruer merking kammeret i et drivhus for å muliggjøre maksimal naturlig lys potensial for plantevekst. Sørg for at tilstrekkelig strømforsyning er tilgjengelig for å drive alle kammer komponenter.
- Konstruer merking kammeret ved å montere 3,175 mm tykk gjennomsiktig akryl vegger (polykarbonat ville også være egnet) og en 6,35 mm tykk gjennomsiktig akryl tak på en aluminiumsramme med en hvitmalt stål gulvet for å maksimere solenergi refleksjon. Dimensjonene på kammeret kan skreddersys for å passe individuelle forskningsbehov.
- Monter kammer på ¾ i (19 mm) kryssfiner på slagg blokker.
- Bor hull i akrylglass, aluminiumsramme og stålgulv og bruke skruer til å feste alle komponentene sammen.
- Tett alle skjøter med silikon caulk å sikre en lufttett forsegling.
- Konstruer en dør ved å montere en del av akrylpanel på lange skruer, som kan skrus ned ved hjelp removable vingemuttere.
- Tett dør med tetningslister for å hindre luftlekkasje.
- Velg et område i direkte tilknytning til kammeret som kontrollsenteret for å montere alt temperatur, fuktighet, CO 2 kontroller, og overvåkingsutstyr.
- Bore små hull nøye i kammerveggen ved siden av kontrollsenteret for alle elektriske ledninger og gasslange. Bruk silikon caulk å forsegle hullene rundt alle ledninger og slanger for å hindre luftlekkasje.
- Test kammer for luftlekkasje ved å fylle den med et høyt nivå av CO2 (f. eks 800 ppm) og la den stå over natten. Dersom den CO2-konsentrasjonen i kammeret opprettholdes på sitt opprinnelige nivå, og den er lufttett. Hvis konsentrasjonen faller over natten, så alle skjøtene skal undersøkes, og lukkes igjen med silikon fugemasse til en lufttett forsegling oppnås.
- For noen planter tilpasset høye lysforhold, legge til lys som er koblet til et tidsur til umiddelbar utsiden av cHamber å øke lys penetrasjon og planteproduktivitet.
2. Temperatur og fuktighet kontroller
- Regulere kammertemperatur ved å installere en kommersiell delt type klimaanlegg med kjøling (fordamper) sløyfer ligger inne i kammeret og kompressor og kondensator spoler plassert utenfor drivhuset for å spre varmen. Sett klimaanlegget for å opprettholde ønsket temperatur.
- Bruk et lite rom avfukter for å kontrollere luftfuktigheten i kammeret.
- Bor et dreneringshull gjennom gulvet av kammeret som grenser til avfukteren.
- Fjern kondensatsamler fra avfukteren og koble et dreneringsrør fra avfukteren via dreneringshull i bunnen av kammeret.
- Under kammeret, plassere en åpen krukke fylt med vann for luftavfukteren å renne direkte inn. Dette skaper en lufttett, men også gi rom for trykkutligning.
- Koble kontrolleren til avfukting system med en solid-state relé og sette fuktighetskontrolleren med en høy alarm og svinge for å opprettholde optimale vekstforhold i kammeret. Optimal temperatur-og fuktighetsforhold vil variere for ulike plantearter.
Tre. CO 2 Controls
- Den 13 C-CO 2-anrikning oppnås ved hjelp av to rene CO to gassbeholdere, hvorav den ene 10 atom% 13 C-CO 2 eller høyere, og en på 1,1 atom% 13 C-CO 2 (naturlige overflod).
- Overvåk CO 2-konsentrasjon ved å ha en membranpumpe kontinuerlig trekke kammer luft gjennom en infrarød Gas Analyzer (Irga), og deretter å pumpe luft inn i kammeret, og dermed opprettholde et lukket system (figur 1).
- Set en lav alarm og dødsone på Irga-programvare for å opprettholde CO-2-konsentrasjoner innenfor et ønsket område. Her bruker vi en lav alarm på 360 ppm med en 40 ppm dødsonen å opprettholde CO 2 konsentrasjoner mellom 360-400 ppm.
- Koble en doseringsventil til hver tank og nøye justere dem til å nå målet 13 C berikelse nivå. Sett tanken regulatorer til 20 psi.
- Sett en magnetventil mellom måleventil og regulator i hver tank. Delta utløpene av de to doseringsventiler sammen og røret dem inn i midten av kammeret. Wire en solid-state relé til Irga utgang til å styre magnetventiler (figur 1).
4. Web-basert Remote Monitoring System
- Overvåke CO 2-konsentrasjoner fra Irga programvaren ved å logge den til en lokal fil en gang hvert 30 sek.
- Opprette en egendefinert verktøy (f.eks i perl eller annet programmeringsspråk) for å plukkeopp oppføringer fra den lokale CO 2 logging fil, sammen med den nåværende laptop tidsstempel, og laste dem opp til en back-end web-applikasjon.
- Sett webapplikasjon for å søke på fuktighet sensor data temperatur og.
- Bruk et overvåkingssystem for å sjekke status på temperaturen i kammeret hvert femte minutt for å forhindre potensielle temperatur pigger som ville ødelegge plantene hvis klimaanlegget sviktet.
- Overvåke CO 2, temperatur og luftfuktighet data på en hvilken som helst standard nettleser, slik at eventuelle uventede temperatur pigger eller CO 2 dråper kan umiddelbart deltok til.
5. Vanning System
- Bor ett lite hull i veggen av akrylglasskammer per pot.
- Bruk irrigasjonsledningen å lage en dryppvanning ring per pott og mate irrigasjonsledningen gjennom kammeret veggen på utsiden.
- Tett hull rundt irrigasjonsledningen med silikon caulkfor å hindre luftlekkasje.
- På utsiden av kammeret, kobler irrigasjonsledningen til røret for en peristaltisk pumpe.
- Bruk en liten slangeklemme til å stenge av all irrigasjonsledningen å hindre luftlekkasje mellom vanning.
6. Potting planter
- Velg en pott størrelse passer for de plantene som dyrkes. Her, 40, er 15 L potter brukt.
- Lag en jord-free potting blanding ved å blande sand, vermikulitt, og profil porøs keramikk.
- Test vannholdekapasiteten for potting blanding ved å veie en fylt pot tørt, soaking potten med vann og slik at den kan tømmes helt, og en vekt på potten våt. Bruk denne maksimums vann holder kapasitet til å sikre at overflødig merket gjødsel og vann ikke lekker fra pottene under vanning.
- Spire frø i potting jord før plante dem i potter. Dette sikrer at bare lykkes spirte frø blir startet i merkingen kammeret.
- Vaksinere t han seedlings med frisk jord slurry å innføre gunstige mikrober.
- Når frøene har spiret, nøye transplantere frøplanter til grytene i ønsket antall.
- Når potte, beveger pottene inn i kammeret og montere hver potte med en individuell vanningsslangen.
7. Tetting Chamber
- Ved først å forsegle porten til kammeret en stor masse av ekstern luft fyller kammeret plass. Skrubb ut denne eksterne CO 2 ved å koble en brus lime scrubber til luftpumpen til å skrubbe CO 2 konsentrasjonen ned til minst 200-250 ppm før du fyller kammeret tilbake opp til 400 ppm ved hjelp av 13 C-CO 2 tank blanding.
- Prøv å holde kammeret stengt gjennom varigheten av vekstsesongen for å redusere naturlig overflod CO 2 forurensing.
- Monitor plantevekst visuelt og justere gjødsling og vanning i henhold til etterspørselen.
- Bruk en gjødsel-løsning, slik som en modifisert Hoagland løsning 23, for å gjødsle plantene gjennom vanningssystem.
- Merke gjødsel med 15 N ved hjelp av en 15 N-KNO 3 subsolution på målrettet atom% 15 N-nivå ved å blande 98 atom% 15 N-KNO 3 med naturlig overflod 15 N-KNO 3 (0,37 atom% 15 N).
- Bland nok av gjødsel-løsning på hver befruktning arrangement for hele kammeret, basert på vannholdekapasiteten for potting blanding. Plasser riktig mengde gjødsel til én pott i en glasskrukke, og forberede seg så mange krukker er det potter.
- Unclamp vanningsslanger og plassere hver av dem i en krukke med gjødselvann, og deretter koble dem til den peristaltiske pumpen.
- Vann planter ved å pumpe vann gjennom den peristaltiske pumpe gjennom de enkelte drypp irridet stilt slanger jevnlig som plantene trenger det.
- Befruktning med Hoagland løsning bør følge anlegget etterspørsel eller eksperimentell design, med økende næringsbehov som anlegget produktiviteten øker for å maksimere produktiviteten.
- Først pumpe Hoagland løsning gjennom vanningsslangen, så pumpe en vannskylling ved å minimalisere alge-og bakterievekst i rørene.
- Reclamp alle slanger etter befruktning og vanning for å eliminere kammer luftlekkasje.
9. Uniform og Differential Merking
- For differensial merking av strukturelle og metabolske komponenter, fjerne planter fra merking kammer 1-3 uker før innhøsting. Planter som er å være jevnt merket kan forbli i forseglet merking kammeret kontinuerlig til innhøsting og overrislet med 15 N-Hoagland løsning.
- Hold fjernet plantene i drivhuset i løpet av denne tiden, slik at de får nok lysog CO 2 ved naturlig overflod 13 C.
- For differensial 15 N merking, fortsetter å gjødsle og vanne plantene som vanlig, men bruk naturlig overflod 15 N-KNO 3 i Hoagland gjødsel løsning.
10. Innhøsting
- Slutt å vanne plantene en uke før høsting slik at plantene begynner å senesce og pottejord tørker ut.
- Åpne kammeret og flytte pottene ut for umiddelbar klipping og høsting av aboveground biomasse
- Hell ut potting mix og røtter over en grov skjermen.
- Bruke skjermen til å skille ut røttene fra potting mix og riste røttene uten potting mix.
- Plasser røttene på en 2 mm sikt, og skyll med vann for å fjerne eventuell gjenværende potting material. Bruk pinsett til å fjerne ethvert vermikulitt som kan klamre seg til røttene.
- Tillat røtter lufttørke i forberedelse for senere eksperimenter.
- Vei luft-tørke plantemateriale for å bestemme merkekammeret biomasse.
- Grind en subsample for kjemisk analyse.
- Sett 2,0 g ovnstørket (60 ° C) kull i en 125 ml syre vasket kolbe og tilsett 50 ml av deionisert vann.
- Plasser prøven i en forvarmet (60 ° C) røreplate og plassere en rører bar i kolben. Sett omrøring i 200 rpm og tillate prøven å varme opp i 30 min.
- Etter 30 minutter, filtrerer kullet løsningen gjennom et 20 mikrometer nylonduker på et vakuumfiltreringssystem.
- Overfør ekstrakt til en veid på forhånd syre vasket rør og fryse.
- Overfør solid kullet rester til en veid på forhånd aluminium pan og tørr ved 60 ° C. Vei pan og søppel etter tørking for å bestemme varmt vann rester masse.
- Fryse tørke varmtvannsekstrakt og veies for å bestemme den varmtvannsekstrakt masse.
- Analyser ovn-tørket (60 ° C) kull, fryse-tørket varmtvannekstrakt, og ovn-tørket varmt vann rester i en Elemental Analyzer - Isotop Ratio Mass Spectrometer (EA-IRMS).
Representative Results
Vår merking kammeret er 1,2 mx 2,4 mx 3,6 m i størrelse og inneholder 40,15 L potter (figur 1). Den datastyrte Irga kontrollsystem opprettholdt CO 2 konsentrasjoner mellom våre faste verdier på 360 og 400 ppm i løpet av photosynthetically aktiv periode av dagen (figur 2a). Den lave CO 2 alarmfunksjonen på Irga utløst magnetventiler for å tillate CO 2 fra 13 C beriket og naturlig overflod stridsvogner inn i kammeret når konsentrasjonen falt under minstegrensen (f.eks 360 ppm). Den dødbånd funksjon stoppes strømmen når konsentrasjonen nådde den øvre innstillingspunkt (f.eks 400 ppm). ISeries temperatur og fuktighet overvåkingssystem koblet til klimaanlegget og avfukter holdt klimaforhold innenfor de innstilte parametrene gjennom hele vekstsesongen (Figur 2b). Vi brukte en one-ton (3,5 kW) klimaanlegg til keep kammeret kult.
Fjern overvåkingssystem tillot logget data for å bli sett når som helst ved en standard nettleser. CO 2-konsentrasjoner, temperatur og luftfuktighet ble samplet av web-applikasjon for å vise grafer over de siste 24-240 hr, i 24 time hvert. Dette skapte en rask visuell å bekrefte at de daglige svingningene var innenfor de forventede rammer. Vise webgrensesnitt viste også den nåværende kammer status, samt gitt varsler om potensielle problemer som ikke mottar nyere data. Til enhver tid den komplette datasettet kan også lastes ned fra web-grensesnittet.
Vi målte photosynthetically aktiv stråling (PAR) i umiddelbar interiør og eksteriør av kammeret på fire poeng med og uten lysene på i midten av sommeren og midt på dagen ved hjelp av et kvantesprang sensor. Den PAR i kammeret var 31,5% lavere enn det utvendige når kammeret lys were av og 22% lavere enn det utvendige når lysene var på. Således kammeret lys bidra til en betydelig økning PAR penetrasjon inne i kammeret med 9,5% (P <0,05).
Vår kontinuerlige merkesystem var i stand til å produsere 2759 g A. gerardii biomasse, 37% av dette var aboveground biomasse og 63% av disse var belowground biomasse. Vi har oppnådd en 4,4 atom% 13 C hele anlegget etikett i vårt ensartet plantemateriale ved å sette de magnetventiler på de to CO to tanker deretter (figur 1, tabell 1). Vi har oppnådd en 6,7 atom% 15 N hele anlegget etikett i vårt ensartet plantemateriale ved å blande 98 atom% 15 N-KNO 3 med 0,37 atom% 15 N-KNO 3 i KNO 3 subsolution av en modifisert Hoagland løsning 23 (tabell 1) . Vi vannes A. gerardii ukentlig med 750 ml total væske (vann pluss Hoagland løsning) i hele den voksende havetsønn. Vi befruktet med 200-500 ml 15 N merket Hoagland løsning per uke, avhengig av planteproduktivitet.
Vi utnyttet varmt vann utvinning metode for å bestemme om det var isotop-forskjeller mellom den enhetlige og differensielt merket plantemateriale. For differensialt merket planter, ved innhøsting vi fjernet noen blader som var helt død og håndtert disse separat som de var trolig ikke ulikt merket. Når man ser på 13 C innhold, alle fire inkorporering dager var signifikant forskjellige fra hverandre for hele anlegget, og det varme vann ekstrakt, men for det varme vann rester dag 14 og 22 var ikke signifikant forskjellige fra hverandre (tabell 1). Ved sammenligning av plantevev fraksjoner innenfor hver dag, varmtvannsekstrakt og residuet var signifikant forskjellige fra hverandre for alle fire dager, og ved dag 22 i hele anlegget, ekstrakten, og residuet ble tatt significantly forskjellige fra hverandre (Tabell 1). For den 15 N innlemmelse i plante-komponenter, var det forskjeller mellom dager med inkorporering og plantevevet fraksjoner. For varmtvannsekstrakt alle fire av de innlemmelse dager var signifikant forskjellige fra hverandre, i 15 N, og for hele anlegget, og det varme vann rester kortere dager for inkorporering var betydelig annerledes enn de lengre dager etter inkorporering (tabell 1). De plantevevet fraksjoner i de ensartede planter var ikke signifikant forskjellige fra hverandre, i 15 N, men varmt vann ekstrakt og residuet var signifikant forskjellige fra hverandre, i 15 N for de differensielt merket kull.
Alle isotopiske verdier er rapportert ved bruk av atom-prosent (atom%) notasjon (ligning 1), som er en mer nøyaktig notasjon enn% til bruk ved høye nivåer av tungeisotop berikelse 21. For eksempel:
(1)
For denne studien, kjørte vi statistiske analyser ved hjelp av SAS versjon 9.2. Vi testet forskjeller mellom kammer innvendige og utvendige lysnivåer ved hjelp av paret t-test. Vi testet forskjeller mellom 13 C og 15 N merking av varmtvanns ekstrakter og varmt vann rester bruker enveis variansanalyse (ANOVA) i PROC ANOVA. Vi brukte Duncan multippel range test for multiple sammenligninger analyse. Signifikans ble akseptert på en P-nivå på 0,05. Vi brukte en Wilcoxon rank sum test for å teste at dataene møtte forutsetningene i analysen.
Figur 1. Schematic diagram av 40 potten kapasitet kontinuerlig multi-isotop merking kammer fra et fugleperspektiv. Stiplede linjene representerer elektriske ledninger, mens heltrukne linjer representerer gass eller vann slangen. Klikk her for å se større bilde.
. Figur 2 A) Gjennomsnittlig CO 2-konsentrasjon (ppm) (+ / -. SE) over en tjuefire timers periode for en hel vekstsesong B) Gjennomsnittlig temperatur (º C), åpne sirkler, og luftfuktighet (%), lukket sirkler . (+ / - SE) over en tjuefire timers periode for en hel vekstsesong Klikk her for å se større imalder.
| Uniform (0) | Differential (7) | Differential (14) | Differential (22) | ||
| Hele Kull | 13 C Atom% | 4.46 ± 0.02 Aab | 3.93 ± 0.05 Ba | 3,64 ± 0,03 Ca | 3,35 ± 0,06 Db |
| 15 N Atom% | 6.69 ± 0.07 Aa | 6.72 ± 0.01 Aa | 6.33 ± 0.06 Ba | 6.41 ± 0.07 Ba | |
| 13 C Atom% | 4.59 ± 0.04 Aa | 3.35 ± 0.06 Bb | 2.79 ± 0.06 Cb | 2.37 ± 0.03 Dc | |
| 15 N Atom% | 6.69 ± 0.03 Aa | 6.43 ± 0.01 Bb | 5.89 ± 0.07 Db | 6,16 ± 0,05 Cb | |
| Varmt vann rester | 13 C Atom% | 4.37 ± 0.06 Ab | 4.1 ± 0.03 Ba | 3.79 ± 0.10 Ca | 3.66 ± 0.05 Ca |
| 15 N Atom% | 6,57 ± 0,04 Ba | 6.71 ± 0.02 Aa | 6.45 ± 0.02 Ca | 6.44 ± 0.03 Ca |
Tabell 1.
Discussion
Denne utformingen for en kontinuerlig isotop merking kammeret ble brukt til å produsere ensartet og differensielt 13 C, og 15 N er merket A. gerardii for påfølgende felt-og laboratorieforsøk. I løpet av tre vekstsesonger av drift, har kammeret lykkes opprettholdt temperatur, fuktighet og CO 2-konsentrasjoner innenfor de innstilte parametrene (figur 2). Påliteligheten til temperaturkontroll system er kritisk i løpet av midten av sommeren når høy solstråling kan føre til overoppheting i lufttett kammer. Å eliminere overskytende fuktighet som følge av transpirasjon fra de voksende planter sikrer at plantespalteåpningene forblir åpne for fotoopptak 22, og at vannkondensering hemmer ikke lett gjennomtrengning eller skade på strukturen av kammeret.
Den nesten kontinuerlig overvåking av CO 2 konsentrasjonen av Irga programvare vedlikeholdes kontinuerlig13 C merking av plantene, mens de vokste i kammeret. På grunn av den høye fotosyntetiske aktivitet av A. gerardii vokser i denne sal, ble CO 2 injiseres inn i systemet ofte i dagslys timer av peak vekstsesongen når fotosynteseaktiviteten trakk CO 2-konsentrasjoner ned til 360 ppm, omtrent hver 15-20 min. Målingen av anriket og naturlige overflod 13 C-CO-to tanker som er tillatt for en kontrollert 4,4 atom% 13 C atmosfæren gjennom hele vekstsesongen for ensartet plantevev merking. 13. C-CO 2-produksjon kan også oppnås ved å blande 13 C-natrium bikarbonat eller 13 C-natrium-karbonat-og saltsyre, men denne type av system er mer komplisert og krever mer overvåking og vedlikehold, så anbefales anvendelse av 13 C-CO 2-gass. En viktig faktor for å overvåke CO 2 concentrations ved hjelp av en Irga er at infrarøde analysatorer taper to tredeler av deres følsomhet når du måler 13 C-CO 2. Dette undervurdering av om lag 2,9% ppm for våre 4,4% 13 C-CO 2 blanding var ikke av stor bekymring for oss, men kan bli en mer betydelig problem når merking ved høyere 13 C nivå 27.
A. gerardii er en varm årstid flerårig Grass Prairie graminoid arter. Utformingen av dette kammer var optimalisert for A. gerardii produksjon (figur 1). Størrelsen og høyden av kammeret ble valgt av hensyn til maksimal høyde produktiviteten til A. gerardii på feltet, så vel som for den ønskede plantebiomasseproduksjon for fremtidige eksperimenter. A. gerardii er kjent for å være lys begrenset i feltet 24,25. PAR innenfor et drivhus kan bli redusert med 30-47% i forhold til ytre nivåer 26. Siden vårt anleggs ble dyrket i et akrylglass kammer inne i et drivhus, PAR begrensning var en bekymring. Når den er slått på, lysrør økt PAR i kammeret med 9,5%, noe som kan ha bidratt til å øke produktiviteten i denne lette følsomme arter. Når du bruker denne sal design for å vokse andre typer planter spesifikke fysiologiske behov som størrelse, belysning, næringsbehov, temperatur følsomhet, og jordfuktighet bør nøye skreddersydd for å opprettholde optimale vekstforhold for plantene.
Når man arbeider med kostbare isotopisk merkede forbindelser, for eksempel 10 atom% 13 C-CO 2 og 98 atom% 15 N-KNO 3, effektiviteten av merking er en viktig faktor. Dette kammer konstruksjon optimaliserer 13 C merking ved å gjøre alle anstrengelser for å forsegle kammeret og minimere luftlekkasje inn i og ut av kammeret. Hvis dette kammeret er aldri åpnet i vekstsesongen, da ingen av de 13 C etikettened CO 2 fra kammeret er lekket ut til atmosfæren. Den CO 2 bygge opp i løpet av natta åndedrett synes ikke å skade den voksende planter, og er raskt tatt opp etter soloppgang (figur 2). Under differensial merking, ble kammeret kort åpnet for å fjerne differensialt merket potter, men dette synes ikke å fortynne målrettet 4,4 atom% 13 C merking av kontinuerlig merket planter (Tabell 1). 13 C merking ble også optimalisert ved å skrubbe ut innledende atmosfærisk luft fanget i kammeret ved tetting. Under foreløpige tester på kammeret uten en innledende skrubb av atmosfærisk CO 2, ble plantene målt til å ha en fortynnet 13 C-nivå i de første bladene produsert enn i de senere bladene produsert. Den innledende skrubb av atmosfærisk CO 2 på kammeret nedleggelse ser ut til å eliminere dette problemet ved å tillate for kontinuerlig 13 C merking frafrøplante til forfall. Opprettholde et jord-fri potting blanding av sand, vermikulitt, og leire eliminerer også naturlig overflod CO 2 forurensning fra jord åndedrett. Elimineringen av jord fra systemet krever forsiktig befruktning og inokulasjon betraktninger, som kan være unike for forskjellige plantearter. 15. N merking gjennom målrettet 7 atom% 15 N Hoegland løsning fremstilt sterkt merket plantemateriale til 6,7 atom% 15 N (tabell 1). En svak fortynning fra det målrettede 15 N etiketten kan være forårsaket av noen naturlige overflod N i potting blanding eller fra det stedlige masser inokulasjon.
Under biosyntesen av forbindelsene, forekommer naturlig diskriminering av 13 C (eller 15 N) som følge av kinetisk fraksjonering og nonstatistical isotop fordeling i de syntetiserte forbindelser. Således, i tilfelle av C, sekundære produkter (for eksempel lipider, av fenol-forbindelser) er generelt utarmet på 13 C, sammenlignet med primære produkter (karbohydrater). Denne naturlige 13 C diskriminering synes å vedvare også når plantene dyrkes i en anriket 13 C atmosfæren, som kan sees i det liten forskjell i atom% 13 C av de varme vannekstrakter og varmt vann rester av de uniformt merkede planter (tabell 1 ). Denne naturlige bevegelsesfraksjonering er meget liten i forhold til berikelse og forringer ikke jevnheten av merking.
Differensial merking av strukturelle og metabolske plantemateriale er en ny metode med potensial for videre studier i kullet nedbryting, mikrobiell økologi og organisk materiale i jord formasjon. Forskjellen i 13 C og 15 N for varmt vann ekstrakter og varmt vann rester indikerer en betydelig fortynning av 13 C, og 15 N i utvaskbare, lavmolekylvekt-forbindelser (varmtvann utdrag) fra den strukturelle plantemateriale (varmtvann rester) etter 7, 14 og 22 dager etter differensial merking (P <0.005). Denne differensial merking av plantevev kan anvendes for å spore skjebnen til strukturelle og metabolske komponenter hver for seg gjennom et økosystem. Den 13 C differensial merking var mer ekstrem enn 15 N differensial merking. Dette kan være på grunn av umiddelbarhet av 13 C fortynning når du fjerner plantene fra 13 C-CO 2 merket atmosfære, mens 15 N etiketten gjenstår fortsatt i potting mix for noen tid, og 15 N fortynning skjer saktere. For mer drastiske differensial merking av 15 N, kan man vurdere å skylle pottene med vann før naturlig overflod befruktning i løpet av de siste ukene av vekst utenfor kammeret.
Utforming og drift av denne kontinuerlige 13 </ Sup> C og 15 N merkesystem for ensartet eller differensial, metabolske og strukturelle, plantevev merking tilveiebringer en ny fremgangsmåte for fremstilling av isotopisk merket plantemateriale for avansert forskning. Utformingen og operasjonelle detaljer av dette kammeret har blitt valgt for 4,4 atom% 13 C og 7 atom% 15 N merking av A. gerardii, men kan skreddersys til andre plantetyper og isotop merking nivåer. Vekstforhold som er beskrevet her bør tilpasses for å passe størrelse, temperatur, luftfuktighet, lys, vann og næringsstoffer krav til spesielle plantearter av interesse. Merking med 18 O-eller 2 H kan også oppnås ved å merke det vann som brukes i vanningssystem. Systemet er beskrevet her tar for mange av utfordringene i uniform og forskjells 13 C merking av plantemateriale. Denne grunnleggende kammer design kan brukes av andre forskningsmiljøer til å produsere svært merket plantemateriale for advanced studier i økosystemet biogeokjemi.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Spesiell takk til Plant Growth Facility og EcoCore analytisk anlegg ved Colorado State University og til de mange elever og lærere som hjalp på dette prosjektet. Dette arbeidet er finansiert av NSF DEB stipend # 0918482, USDA National Needs Fellowship, og Cotrufo-Hoppess fond for jord økologi forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 in Remote Tower Fan | Living Accents | FS10-S3R-A | |
| 42 in Electric Tower Fan with remote control | LASKO | 2559 | |
| Mr. Slim Split-type air conditioner | Mitsubishi Electric | R410A | |
| Electronic 24 hr time switches | Intermatic | ET100C | Operates Fluorescent Light System |
| iSeries Humidity and Temp Controller | Omega | CHiTH-i8DV33-5-El | |
| Solid State Relay | Omega | SSRL240 | |
| CKR Series Solid State Relay | Crydon | ||
| Solenoid Coils | Dayton | 6X543 | |
| GasHound CO2 Analyzer | LI-COR | LI-800 | |
| Dehumidifier | Dayton | 1DGX4 | |
| Specialty gas regulator | Airgas | CGA 580 | |
| T5 Hight Output Commercial Fluorescent Light System | Hydro Farm | FLT48 | |
| Air pump | Thermo Scientific | 420-1901 | |
| Masterflex Cartridge Pump HeadSystem | Cole Parmer | 7553-70 | |
| 1900 Series Network Switch | Catalyst | ||
| Profile Porus Ceramic Top Dressing | Greens Grade | ||
| Industrial Quartz 40 mesh | Unimin | 4095 | |
| Mycorrhizae Professional Growing Medium | ProMix | ||
| Vermiculite and Perlite | Thermo-Ran | C633 | |
| Potassium Nitrate- 15N 98 atom % | Sigma-Aldrich | 335134 | |
| Carbon-13C Dioxide 10 atom % | Sigma-Aldrich | 600180 | |
| Medical grade CO2 | Airgas | ||
| Regulator | Airgas | CGA 350 | |
| 4 in box fans | Grainger | ||
| Masterflex PharMed BPT Tubing | Cole Parmer | HV-06508-24 |
References
- Bird, J. A., Torn, M. S. Fine roots vs. Needles: A comparison of (13)C and (15)N dynamics in a ponderosa pine forest soil. Biogeochemistry. 79, 361-382 (2006).
- Bird, J. A., van Kessel, C., Horwath, W. R. Stabilization of C-13-carbon and immobilization of N-15-nitrogen from rice straw in humic fractions. Soil Sci. Soc. Am. J. 67, 806-816 (2003).
- Denef, K., Six, J. Contributions of incorporated residue and living roots to aggregate-associated and microbial carbon in two soils with different clay mineralogy. Eur. J. Soil Sci. 57, 774-786 (2006).
- Rubino, M. Carbon input belowground is the major C flux contributing to leaf litter mass loss: Evidences from a C-13 labelled-leaf litter experiment. Soil Biol. Biochem. 42, 1009-1016 (2010).
- Cotrufo, M. F., Wallenstein, M. D., Boot, C. M., Denef, K., Paul, E. The Microbial Efficiency-Matrix Stabilization (MEMS) framework integrates plant litter decomposition with soil organic matter stabilization: do labile plant inputs form stable soil organic matter. Glob. Change Biol. 19, 988-995 (2013).
- Mambelli, S., Bird, J. A., Gleixner, G., Dawson, T. E., Torn, M. S. Relative contribution of foliar and fine root pine litter to the molecular composition of soil organic matter after in situ degradation. Org. Geochem. 42, 1099-1108 (2011).
- Prescott, C. E. Litter decomposition: what controls it and how can we alter it to sequester more carbon in forest soils. Biogeochemistry. 101, 133-149 (2010).
- Denef, K., Roobroeck, D., Wadu, M., Lootens, P., Boeckx, P. Microbial community composition and rhizodeposit-carbon assimilation in differently managed temperate grassland soils. Soil Biol. Biochem. 41, 144-153 (2009).
- Bird, J. A., Kleber, M., Torn, M. S. C-13 and N-15 stabilization dynamics in soil organic matter fractions during needle and fine root decomposition. Org. Geochem. 39, 465-477 (2008).
- Andresen, L. C., Jonasson, S., Strom, L., Michelsen, A. Uptake of pulse injected nitrogen by soil microbes and mycorrhizal and non-mycorrhizal plants in a species-diverse subarctic heath ecosystem. Plant Soil. 313, 283-295 (2008).
- Horwath, W. R., Pregitzer, K. S., Paul, E. A. C-14 Allocation in tree soil systems. Tree Physiol. 14, 1163-1176 (1994).
- Denef, K. Community shifts and carbon translocation within metabolically-active rhizosphere microorganisms in grasslands under elevated CO2. Biogeosciences. 4, 769-779 (2007).
- Pollierer, M. M., Langel, R., Korner, C., Maraun, M., Scheu, S. The underestimated importance of belowground carbon input for forest soil animal food webs. Ecol. Lett. 10, 729-736 (2007).
- Stewart, D. P. C., Metherell, A. K. Carbon (C-13) uptake and allocation in pasture plants following field pulse-labelling. Plant Soil. 210, 61-73 (1999).
- Santos, F., Torn, M. S., Bird, J. A. Biological degradation of pyrogenic organic matter in temperate forest soils. Soil Biol. Biochem. 51, 115-124 (2012).
- Bromand, S., Whalen, J. K., Janzen, H. H., Schjoerring, J. K., Ellert, B. H. A pulse-labelling method to generate 13C- enriched plant materials. Plant Soil. 235, 253-257 (2001).
- Putz, B. A simple method for in situ-labelling with 15N and 13C of grassland plant species by foliar brushing. Methods Ecol. Evol. 2, 326-332 (2011).
- Wichern, F., Mayer, J., Joergensen, R., Müller, T. Evaluation of the wick method for in situ <sup>13</sup>C and <sup>15</sup>N labelling of annual plants using sugar-urea mixtures. Plant Soil. 329, 105-115 (2010).
- Fahey, T. J. Transport of Carbon and Nitrogen Between Litter and Soil Organic Matter in a Northern Hardwood Forest. Ecosystems. 14, 326-340 (2011).
- Stewart, C. E., Paustian, K., Conant, R. T., Plante, A. F., Six, J. Soil carbon saturation: Evaluation and corroboration by long-term incubations. Soil Biol. Biochem. 40, 1741-1750 (2008).
- Fry, B. Stable Isotope Ecology. , Springer. (2006).
- Nippert, J. B., Fay, P. A., Carlisle, J. D., Knapp, A. K., Smith, M. D. Ecophysiological responses of two dominant grasses to altered temperature and precipitation regimes. Acta Oecol. Int. J. Ecol. 35, 400-408 (2009).
- Hoagland, D. R. aA., I, D. The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil. , The College of Agriculture, University of California, Berkeley. Berkeley, CA. (1950).
- Lett, M. S., Knapp, A. K. Consequences of shrub expansion in mesic grassland: Resource alterations and graminoid responses. J. Veg. Sci. 14, 487-496 (2003).
- Knapp, A. K., Seastedt, T. R. Detritus Aaccumulation limits productivity of tallgrass prairie. Bioscience. 36, 662-668 (1986).
- Ting, K. C., Giacomelli, G. A. Solar photosynthetically active radiation transmission through greenhouse glazings. Energy Agric. 6, 121-132 (1987).
- McDermitt, D. K., Welles, J. M., Eckles, R. D. Effects of Temperature, Pressure and Water Vapor on Gas Phase Infrared Absorption by CO2. , Li-Cor, Inc.. Lincoln, NE. Forthcoming.
