剖析 Published: March 4, 2014 doi: 10.3791/51118

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Cecile Milet^1,2,3,4, Anne Helene Monsoro-Burq^1,2,3,4

¹Institut Curie, Centre Universitaire, ²Université Paris Sud, Centre Universitaire, ³CNRS UMR 3347, Centre Universitaire, ⁴INSERM U1021, Centre Universitaire

Summary

本协议描述了如何从非洲爪蟾 neurulas解剖premigratory颅神经嵴（NC）。这些外植体可以镀在纤连蛋白和体外培养，或接枝回主机胚胎。这种技术可以让学习数控上皮至间质转变，迁移和分化的机制。

Abstract

神经嵴（NC）是一个短暂的背神经管细胞群，在神经胚形成年底经历了一个上皮至间质转化（EMT），广泛迁移对各个器官，并分化成多种类型的衍生工具（神经元，神经胶质细胞，软骨和骨，色素和内分泌细胞）。在这个协议中，我们描述了如何从非洲爪蟾胚胎解剖premigratory颅数控，以研究开发数控在体内和体外 。青蛙模型提供了许多优势，研究开发初期，大量批的情况下，胚胎发展迅速， 在体内增益和功能丧失的策略允许操纵基因表达前，数控夹层供体和/或主机的胚胎。数控植体可以镀在纤连蛋白和用于体外研究。它们可以在无血清的定义培养基中培养数天。我们还描述了如何嫁接数控植回到宿主胚胎研究的NC迁移和分化的体内 。

Introduction

神经嵴（NC）是一个短暂的胚胎细胞群出现从神经管在神经胚形成在脊椎动物胚胎的末端。控制NC规范的信令和遗传事件早原肠胚形成开始。 NC被指定在神经和非神经外胚层通过从周围背部组织的信号之间的边界。在神经胚形成的端部，NC细胞经历了上皮至间质转化（EMT），并广泛地在胚胎移植以下刻板航线通过响应周围指导线索。一旦他们达到他们的最终目的地，它们分化 ​​成衍生物， 如神经元，神经胶质细胞，骨，软骨和色素细胞^1-5繁多。因为他们有许多类型的细胞和胚胎组织，在数控细胞发展的任何步骤中的缺陷，从感应到最终分化的贡献，可引起命名neurocristopathies ⁶先天性综合征。 Ë发展数控xperimental操作在不同的阶段 - 规范，EMT，迁移和分化 - 将提高我们neurocristopathies的认识，并允许潜在的治疗策略设计。

非洲爪蟾胚胎选择的模型来研究数控的发展。大量的胚胎很容易获得，并且体外受精可进入发展的第一个步骤。许多工具可用来操纵实验十蟾胚胎发育。基因增益的功能和击倒很容易通过显微注射的早期囊胚单个细胞来执行。胚胎组织可切体外复性^7-11或背嫁接试验^12,13。

在这个协议中，我们描述了如何解剖出premigratory颅NC在十蟾晚neurulas，迁移之前。这些外植体可以在纤连蛋白金属线进行培养D平板学习迁移和分化的控制， 在体外实验条件。数控植，也可嫁接到正常或操纵宿主胚胎，以研究它们的迁移和分化的体内 。

Protocol

实验符合的用于科学目的和更换，减少和细化的国际公认原则的动物的保护国家和欧洲的监管。

1。纤连蛋白包被的培养皿¹⁴的制备

1. 移液器500毫升的10毫克/毫升培养级纤连蛋白稀释在1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中插入标准塑料培养皿中（直径40×11毫米）。在37℃下1小时。注意：如果使用玻璃餐具或盖玻片后续成像，使用100毫克/毫升纤维连接蛋白的解决方案。
2. 漂洗三次，用1×PBS。
3. PBS替换用500毫升1X PBS/0.1％牛血清白蛋白（BSA）的。在37°C为30分钟。
4. 漂洗三次，用1×PBS。
5. 填充用1×PBS，并保持在4℃直至使用（通常为24-48小时）。

2。数控植体解剖

<醇>

准备四分之三普通两栖动物中等（NAM）（110 mM氯化钠，2mM的氯化钾，1毫米的Ca（NO _3）2，1mM的MgSO ₄干燥，0.1mM的EDTA，1mM的_碳酸氢钠 ，0.2×PBS，50毫克/毫升庆大霉素^10,15）。不要让超过1周解剖，储存于4°C。较旧的NAM可用于制备琼脂糖包被的解剖菜（如下）。

准备60毫米培养皿解剖，涂有四分之三NAM10毫升2％的琼脂糖。

收集清扫工具：塑料巴斯德移液管，一个最好的昆虫针安装在销钉保持器（见材料表供参考），一“眉毛刀”（与眉毛包埋于石蜡中以玻璃巴斯德移液管¹⁶的前端制成），两个细解剖钳，P1000移液器和技巧，双目体视镜放大倍数与8-40X〜50，与光纤导一个明亮的光源。所有的解剖工具应保持清洁，每一个实验后，他们冲洗两次，用蒸馏水，一旦无线TH 100％的乙醇，并让干燥。储存远离灰尘。

在解剖盘新鲜的不结盟运动几乎顶端填补。

获得十根据标准程序¹⁰和老化直到它们到达神经胚阶段16（根据Nieuwkoop和费伯发育表^17） 蟾胚胎。

舞台放置16个胚胎到使用塑料巴斯德吸管解剖盘。

开展下的双目范围内的所有后续步骤。有两对镊子取出卵黄膜。要小心，不要损坏胚胎的背侧部分。

等到胚胎已经达到了17级，开始清扫。 17级是合适的，因为神经嵴明显设置除了神经管，而相比之下，早期阶段。 17级后，NC开始迁移，并与周围的间质交织。

挖一个小孔，在琼脂糖用钳子做一个利基的胚胎，以保持他们在解剖。将一个胚胎背侧。注意：橡皮泥可用于保持，而不是挖一个洞到琼脂糖的胚胎。

使前牙神经褶用眉刀和昆虫脚的外侧部切口。要小心，不要去太深入胚：目标是通过2-3层细胞（永远达不到深如原肠！）削减。在整个解剖过程中， 绝不允许解剖组织，以与自X 的气-液界面接触进入 非洲爪蟾胚胎组织是由表面张力裂解。

拨打第二个切口平行于神经的背更加折叠部分使用相同的仪器。

如果需要的话，转身90°的菜。使三分之一垂直切口与眉刀和昆虫针，在第一次两个切口的后侧。数控是厚厚团细胞的外胚层的色素外层下方，侧以神经管。

使用的眉刀尖端从底层数控分离色素外胚层层，从第三个切口边缘开始。

使用的眉刀一边拆下数控组织从第三切口开始。数控组织是相当灰色，而底层的头侧中胚层是白色的。小心地从胚层分离的NC。

从视泡前方拆下数控组织，并削减在这个水平上，以释放外植体。至于第一个实验中，通过原位杂交技术在某些外植体检查snail2表达（一个规范的NC标记）的控制建议。

3。对纤维连接蛋白电镀植

1. 填充在纤维连接蛋白包被的培养皿改性Danilchick中等（MDM，氯化钠53毫米，Na2CO ₃ 5毫米，钾葡萄糖4.5毫米，钠葡萄糖32毫米， _硫酸镁 1毫米， _氯化钙 1毫米，BSA的0.1％，调节pH值8.3用1 M BICINE
2. 转植到使用P1000的移液管的纤维连接蛋白包被的培养皿。切勿让植触气 - 液界面。首先，吸取一些液体进入尖，然后将外植体，然后一些液体了。不要让任何空气进入尖而转植到纤维连接蛋白包被的培养皿。一旦该尖端部是纤连蛋白包被的培养皿中的液体内，让外植体慢慢地通过重力下降，或推非常平缓， 避免喷射植太快 。
3. 将10-30植在使用眉刀盘。避免盘的两侧，这是不足够的后续成像。
4. 尝试，直到植已附着在纤维连接蛋白（大约需要15-30分钟）不动的菜。如果需要，将菜非常谨慎 。
5. 放置在冷藏保温箱的菜（在15-20℃，温度图表见^17）。当放置在15℃，将细胞ARË通常有效迁移和6小时培养后散射（此时间可能实验之间会发生变化）。

4。植嫁接到主机胚胎

1. 切细的玻璃盖玻片到使用粗镊子非常小的碎片。件的尺寸应为大约1.5mm ^2。沉浸在片放入含3/4 NAM或PBS使用镊子培养皿。
2. 准备主机胚胎：如3）所述特别小心，不要损坏主机胚胎同时去除卵黄膜和解剖数控解剖出主机NC 3/4 NAM。该组织张力往往会增加消融的大小：让主机胚胎愈合局部解剖，而捐赠者的胚胎。
3. 在另一个琼脂糖包被的培养皿或在同一盘的另一部分，如在方案3中所述解剖出NC外植体从供体胚胎。转移NC移植到含小心主机的菜，如第协议3。
4. 紧随数控植上放置使用镊子主机消融区。外植体应重视部分。把一块玻璃盖玻片上移植胚胎，以维持移植物到位。选择一块玻璃大于胚胎，以避免损坏。胚胎将是一个有点扁平。
5. 等待至少15-20分钟，然后轻轻取出盖玻片。让胚胎收回另外10分钟，小心吸取到一个干净的盘子装满3/4 NAM，使用塑料巴斯德吸管。

Representative Results

当镀上纤连蛋白，神经嵴外植体附着快速（15-30分钟）和植传播平面内2小时（ 图1A）。经过3-6小时的细胞开始分散。在24小时后在15℃下，许多细胞已开始迁移远离外植体（ 图1B和1C）。蛋黄使得细胞在相衬（ 图1B）非常明亮。细胞突起（filopodes和lamellipodes）都清晰可见鬼笔环肽与肌动蛋白细胞骨架（ 图1C）染色后。

对于原位移植实验中，供体胚胎，以遵循移植细胞在未标记的宿主胚胎注射了绿色荧光蛋白的mRNA。颅NC烧蚀在主机的一侧;手术后30〜60分钟的接枝已经愈合，取代了烧蚀主机颅NC（ 图1D，嫁接后2小时）。几个小时后，GFP阳性细胞已迁移从外植体，随后数控细胞向腹侧颅面位置（ 图1E）的千篇一律的迁徙路线。在蝌蚪，数控源性颅面结构开发（ 图1G）。当颅NC被烧蚀，这些结构被丢失，从而缩短脸与眼睛相邻的水泥腺（ 图1H，红色箭头）。在接枝蝌蚪，供体细胞的NC促成了颅面结构，从而在正常的面部形态（ 图1F和1I，绿色箭头）。

图1中， 在体外和取出的颅NC的体内行为。 AC）   Premigratory数控解剖从一个阶段17神经胚胚和镀到纤连蛋白包被的培养皿中。 甲 ）电镀后的2小时后，将外植体已经附着和扩散B）24小时后镀敷后，细胞已有效地迁移对纤连蛋白C）的伪足和丝状伪足都清楚地看到在迁移NC细胞标记鬼笔环肽（绿色），DI）神经胚阶段17的GFP +标记premigratory NC是取自一个GFP注射的胚胎和后端接枝到宿主胚胎，从中颅NC烧蚀在阶段17 - 18 D）嫁接后2小时内，外植体已经痊愈。 英法 ）接枝数控细胞都积极迁移出并填充下颌流如图所示在蝌蚪阶段31和41。G）控制阶段41蝌蚪H）消融的NC已经导致面部和眼睛发育戏剧性的失败（H：请注意，水泥格兰ð开发与眼睛相邻，由于缺乏NC细胞填充颚区域，红色的箭头。 。比较来控制蝌蚪在G）F，I）与此相反，嫁接数控细胞已恢复眼和颅面结构的发展（F，I，绿色箭头） 交流 ，比例尺= 100毫米; DI，比例尺为1mm ，D，背视图。EI，侧视图。这个数字已经被修改米莱特等 ¹² 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

本协议描述了一个简单的方法来植体premigratory颅NC在非洲爪蟾胚胎。用于这些实验的胚胎必须健全和愈合良好。丢弃任何批次不健康的胚胎。此外，胚胎生长在不同的温度（12〜18〜20℃），以切除神经嵴在阶段17，而不是以后。阶段17后，神经嵴可与头侧中胚层混合，并不能完全除去。 爪组织迅速愈合，然后失去其粘附到其他组织。它能够快速工作，并把神经嵴植入宿主，只要它是从供体切除是很重要的。

至于在体外实验中，纤维连接蛋白的培养皿后，可以几天受到感染与细菌或真菌。使用抗生素和干净或无菌的材料和解决方案，尽可能多地。

这个过程被优化f或颅神经嵴。事实上，这种细胞群被明确界定，并在局部阶段17 爪蟾胚胎。不幸的是，这种模式是不恰当的进行这样的试验主干数控。鸟类胚胎更适合那些有兴趣谁在操纵这样的主干数控细胞群。

在这个协议中所述的外植体可以被用来研究NC行为的各个方面， 在体内和体外 。数控分子发育程序在很大程度上是保守的脊椎动物^19。青蛙的发展是一个强大的模型来研究脊椎动物数控EMT，迁移和分化。 十。蟾胚胎细胞中含有足够的蛋黄，让他们在体外存活数天不添加任何外部的营养。因此， 在体外研究中可以测试各种生长因子或化学的影响，在一个简单并完全控制培养基中。这种实验已经用于分析的EMT和迁移，包括研究激活或阻断这种方法也可以用来设计改进定向NC分化协议信号传导途径等 ^14,20-24的化疗诱或化学-驱虫剂的影响，。在制定规范再生医学，获得体外多样NC-衍生的细胞类型可用于药物筛选的理解和治疗neurocristopathies ^25,26的上下文中。

数控发展是由细胞自治条例和信号之间复杂的相互作用从周围组织策划。基因表达的实验操作，无论是在捐助NC或在主机胚胎，允许从数控发展的非细胞自主性方面的歧视性细胞自主。结合功能获得和击倒接近这个协议用 ​​于在体外培养和体内移植已成功使用^{ð14,21,23,27-36。}

这种技术可以适用于接枝其它组织到宿主胚胎，并测试它们的迁移和分化潜能。例如，我们使用了多能性囊胚屋顶外胚层（「该动物上限」），以寻找一个最小的转录开关常闭的发展。我们研究了两种转录因子，PAX3和ZIC1，数控承诺和后续发展的影响。动物帽与PAX3功能获得的和ZIC1铺板于纤连蛋白在体外或backgrafted到宿主细胞胚。我们发现，Pax3/Zic1-induced细胞迁移和分化像真正的数控细胞在体外和在宿主胚胎^12。

支配数控EMT和移民众多的分子机制也参与肿瘤³⁷转移性传播。该协议的目的是提供一种简单，廉价和effici耳鼻喉科工具，发育生物学家和其他研究人员能够探索这些关键的细胞行为的基本机制。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F4759-1MG
Bovine Serum Albumin, Fraction V	Euromedex	04-100-811-C	Lower quality grade may  be suitable for this application
Stainless Steel Insect Pins, Size 000	FST	26001
Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm	FST	11252-20