Summary
このプロトコルは、 アフリカツメガエルの neurulasからpremigratory頭蓋神経堤（NC）を分析する方法について説明します。これらの外植片をin vitroで培養フィブロネクチン上に播種、または宿主胚に戻って移植することができる。この技術は、NC上皮から間葉移行、遊走、および分化の機序を研究することができる。
Abstract
神経堤（NC）は、神経胚形成の最後に上皮への間充織転換（EMT）を受けて、過渡背側神経管の細胞集団である様々な臓器に向けて広範囲に移動し、誘導体（ニューロン、グリア、多くのタイプに分化する軟骨や骨、色素性および内分泌細胞）。このプロトコルでは、in vivoおよびin vitroでのNC開発を研究するために、 アフリカツメガエル胚からpremigratory頭蓋NCを分析する方法について説明します。カエルモデルは、初期の開発を研究する多くの利点を提供しています。豊富なバッチは、胚がin vivoでのゲインと機能戦略の損失は前供与体および/ またはホスト胚におけるNC郭清に遺伝子発現の操作を可能にする、迅速な開発、提供しています。 NC植片は、フィブロネクチン上に播種し、インビトロ研究のために使用することができる。これらは、無血清培地中で定義された数日間培養することができる。また、背面のNC植片を移植する方法を説明します生体内でのNCの移行および分化を研究するためのホスト胚へ。
Introduction
神経冠（NC）は、脊椎動物胚における神経胚形成の終了時に神経管から出てくる一過性胚細胞集団である。 NCの仕様を制御するシグナル伝達および遺伝的事象は、早ければ原腸形成として開始します。ノースカロライナ州は、周囲の背側の組織からの信号によって、神経および非神経外胚葉の境界に指定されています。神経胚形成の終了時に、NC細胞が上皮から間葉転換（EMT）を受けると案内手がかりを囲むに応答することによってステレオタイプのルート以下の胚で広く移動する。彼らは彼らの最終的な宛先に到達した後、彼らは誘導体、 例えばニューロン 、グリア、骨、軟骨、および色素性細胞1-5の広大な配列に分化する。多くの細胞種および胚組織への貢献のために、NC細胞開発のどの段階での欠陥は、誘導から最終分化、neurocristopathies 6という先天性の症候群を引き起こす可能性があります。 E様々な段階での開発のNCの新実験操作 - 仕様、EMT、移行、および分化は - neurocristopathiesの我々の理解を向上させ、潜在的な治療戦略の設計ができるようになります。
アフリカツメガエル胚は、NC開発を研究するための最適なモデルです。胚の多数を得るのは容易であり、体外受精は、開発の非常に最初のステップへのアクセスを提供します。多くのツールは、実験的にXを操作するために利用可能である胚発生ツメガエル 。機能獲得型と遺伝子ノックダウンは、初期の胞胚の個々のセルをマイクロインジェクションにより実行するのは簡単です。胚組織は、in vitro再アソシエーション7-11またはバックグラフト12,13のアッセイのために切断することができる。
このプロトコルでは、Xにpremigratory頭蓋NCを分析する方法を説明します移行前に、後半neurulas ツメガエル 。これらの外植片はフィブロネクチンジンジャーブレッドで培養することができるに移行し、分化を研究するDプレートは、in vitroの実験条件で制御。 NC外植片もまた、インビボでそれらの移動および分化を研究するために、通常の操作または宿主胚に移植することができる。
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Protocol
実験は、科学的目的のために使用される動物の保護に関する国家および欧州の規制で、交換、削減、洗練された、国際的に確立された原則に準拠しています。
1。フィブロネクチンコートディッシュ14の調製
- ピペット標準的なプラスチックシャーレ（φ40×11 mm）の中に1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈した10 mg / mlの培養グレードのフィブロネクチンを500ml。 1時間37℃でインキュベートする。注意：以降のイメージング用ガラス食器やガラス製カバースリップを使用している場合は、100 mg / mlのフィブロネクチン溶液を使用してください。
- 1X PBSで3回洗浄します。
- 1XのPBS/0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）の500ミリリットルを含むPBSを交換してください。 30分間37℃でインキュベートする。
- 1X PBSで3回洗浄します。
- 1X PBSでいっぱいにして（通常は24〜48時間の場合）使用するまで4℃で保管してください。
2。 NC植片の解剖
<OL>3。フィブロネクチン上にプレート外植片
- フィルインフィブロネクチンコートディッシュ修正Danilchickミディアム（MDM、NaClの53 mMの、のNa 2 CO 3 5mmのKグルコン酸4.5 mMの、ナトリウムグルコン酸32 mMの硫酸マグネシウム1 mMの、 塩化カルシウム1 mMの、BSA 0.1％、pHを調整1男ビシンと8.3に
- P1000ピペットを用いてフィブロネクチン被覆皿に外植片を移す。外植片を気液界面を接触させないでください。まず、一部の液体もう一度、外植して、先端にいくつかの液体をピペット。フィブロネクチン被覆皿に外植片を転送しながら、先端に空気を許可しないでください。先端がフィブロネクチンコートディッシュの液体の中にあると、外植片をゆっくりと重力で下に行かせ、または非常にゆっくりと押します。 速すぎて外植片を排出することは避けてください 。
- 眉毛のナイフを使用して皿に10から30の外植片を配置します。皿の側面を避けるため、その後の画像化のために十分なされていない。
- （それは約15〜30分かかります）外植片はフィブロネクチンに付着するまで、お皿を移動しないようにしてください。必要であれば、 非常に慎重に料理を移動します。
- 冷蔵インキュベータ（温度グラフ15〜20℃の間で、17を参照）の皿を置きます。 15℃で置かれたとき、細胞は、arはE通常は効率的に移行し、インキュベーションの6時間後に散乱（このタイミングは実験間で異なる場合があります）。
4。ホスト胚に外植片を移植
- 粗鉗子を使用して非常に小さい部分に微細ガラスカバースリップをカット。作品の大きさは約1.5ミリメートル2でなければなりません。ピンセットを用いて3月4日、NAMまたはPBSを含むペトリ皿にピースを浸します。
- 宿主胚の調製：卵黄膜を除去して、NCを解剖しながら、宿主胚を傷つけないよう、特に注意して）3で説明したように3月4日、NAMでホストのNCを解剖する。ドナー胚を解剖しながら、宿主胚が部分的に治癒させて：組織の緊張は、焼灼の大きさを増大させる傾向がある。
- プロトコル3で説明したように、他のアガロースでコーティングされた皿の中で、同じ皿の別の部分では、ドナー胚からのNC植片を解剖する。で説明したように、注意してホストを含む皿にNC移植を転送プロトコル3。
- すぐに鉗子を使用してホストアブレーション領域に、NCの外植片を置く。外植片を部分的に固定してください。所定の位置に移植片を維持するために移植された胚にカバーガラス片を入れてください。それの損傷を防ぐために、胚よりも大きなガラス片を選択します。胚は平らに少しになります。
- 少なくとも15〜20分間待ってから、静かにカバーガラスを取り外します。胚はさらに10分間回復してみようと注意深くプラスチック製パスツールピペットを用いて、3/4 NAMが充填された清浄な皿にそれをピペット。
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Representative Results
フィブロネクチン上にプレーすると、神経堤の外植片が急速に（15〜30分）を取り付けて、外植片は2時間（ 図1A）内でフラットに広がる。 3-6時間の細胞が飛散し始めた後。 15℃で24時間で、多くの細胞が離れて外植片（ 図1Bおよび1C）からの移行を開始しました。卵黄は、位相コントラスト（ 図1B）の下で、細胞が非常に明るくなる。細胞の突起（filopodesとlamellipodes）は、アクチン細胞骨格（ 図1C）のファロイジン染色した後にはっきりと見える。
同所移植実験のために、ドナー胚を非標識宿主胚における移植された細胞を追跡するために、GFP mRNAを注入した。頭蓋のNCは、ホストの片側に切除された。30〜60分、手術後に移植片を切除されたホスト頭蓋NC（ 図1D、移植後2時間）に置き換え、治癒した。数時間後、GFP陽性細胞が移動した外植片から腹頭蓋顔面の位置（ 図1E）に向かって、NC細胞のステレオタイプ移動ルートを追った。オタマジャクシ、ノースカロライナ由来の頭蓋顔面構造は（ 図1G）を開発した。頭蓋NCを切除されたときに、これらの構造は、セメント腺（ 図1H、赤い矢印）に隣接した目で短くした顔で、その結果、欠落していた。移植されたオタマジャクシでは、ドナーのNC細胞は、正常な顔の形態（ 図1Fと1I、緑の矢印）、その結果、頭蓋顔面構造に寄与している。
図1。 インビトロおよび外植頭蓋NCの生体内挙動の 。 AC） Premigratory NCを解剖した出ステージ17神経胚胚からとフィブロネクチンコートディッシュ。A）めっき後2時間上に播種し、外植片が付着し広がっている。B）24時間プレーした後、細胞を効率的にフィブロネクチンに移行している。C）ラメリポディウムと糸状仮足はっきりファロイジン（緑色）で標識したNC細胞の移行が見られるDI）premigratory NCラベル神経胚ステージ17のGFP +は、GFPを注入した胚から採取し、頭蓋NCをステージ17で切除されたホストの胚の中にグラフトされたバック- 18、D）を2時間移植後、外植片が治癒。EFはオタマジャクシステージ31と41で示されるように）グラフトNC細胞が活発に移行され、下顎のストリームを移入している。G）の制御段41オタマジャクシH）のNCを切除しました顔や眼の発生の劇的な失敗に終わった（H：注意して、そのセメントグランDは、顎領域、赤い矢印を取り込むのNC細胞の不足のために、目に隣接して開発しています。 。）G中のオタマジャクシを制御するのに比較し、F、I）とは対照的に、移植されたNC細胞は、目や頭蓋顔面構造の開発（F、I、緑の矢印）を復元した交流 、スケールバー= 100ミリメートル、。DI、スケールバー= 1ミリメートル、D、背ビュー。EI、側面図。この図は、Milet らから変更されている。12 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、 アフリカツメガエル胚においてpremigratory頭蓋NCを植するための簡単な技術が記載されている。このような実験に使用した胚は、堅牢で、よく治癒する必要があります。不健康な胚のいずれかのバッチを廃棄します。また、後段ではなく、17で神経堤を切除するために、（12〜18〜20℃に）様々な温度で胚を成長する。ステージ17の後に、神経堤は頭部中胚葉と混合してもよいし、完全に除去することはできません。 アフリカツメガエルの組織が 迅速に治癒した後、他の組織への接着性を失う。これは、急速に働く時点ですぐにドナーから切除されるように宿主中に神経堤の外植片を配置することが重要です。
試験管内の実験で関わる、フィブロネクチン培養皿は、数日後に細菌または真菌で汚染され得ることができます。多くの場合、可能な限りの抗生物質とクリーンまたは無菌材料とソリューションを使用してください。
この手順は、Fに最適化されていまたは頭蓋神経堤。実際、この細胞集団は、明確に定義され、ステージ17 アフリカツメガエル胚に局在している。残念ながら、このモデルは幹NC上のそのような実験を行うことは適切ではない。鳥の胚は、体幹のNC細胞集団を操作することに興味のある方に適しています。
このプロトコルに記載された外植片、 インビボおよびインビトロの両方で 、NCの動作のさまざまな側面を研究するために使用することができる。 NC分子発生プログラムは、主に脊椎動物19に保存されている。カエルの開発は、脊椎動物のNC EMT、移動および分化を研究するための強力なモデルです。X.ツメガエル胚細胞は、外部の栄養素を添加せずに数日間、in vitroでの生存を可能にするのに十分な卵黄が含まれています。従って、 インビトロ研究は、単純かつ完全に制御された培養培地中で、種々の成長因子または化学化合物の効果を試験することができる。このような実験はされてい14,20-24 等 、シグナル伝達経路を活性化または遮断のため、化学誘引物質または化学忌避剤の効果を研究するなど、EMTおよび遊走を分析するように設計このアプローチは、改善された指向NC分化プロトコルを設計するためにも使用することができる。 インビトロでの多様なNC-由来の細胞型を得る、再生医療のためのプロトコルを開発することの文脈において理解とneurocristopathies 25,26を治療するための薬剤スクリーニングに用いることができる。
NCの開発は、周囲の組織からの細胞の自律的規制や信号間の複雑な相互作用によって編成されている。ドナーノースカロライナ州または宿主胚のいずれかで遺伝子発現の実験操作は、ノースカロライナ開発のnoncell自律側面から識別セルが自律許す。首尾よく使用されているin vitro培養およびin vivo移植に機能獲得を組み合わせてノックダウンすると、このプロトコルへのアプローチD 14,21,23,27-36。
この技術は、宿主胚に他の組織をグラフトし、それらの移動および分化ポテンシャルをテストするために適合させることができる。例えば、我々は、NC開発のための最小限の転写スイッチを探すために、多能性胞胚屋根外胚葉（「アニマルキャップ」）を使用しています。我々は、NCのコミットメントおよびその後の開発に関する2つの転写因子、PAX3およびZIC1の効果を検討した。 PAX3およびZIC1機能獲得したアニマルキャップは、in vitroで 、フィブロネクチン上にめっきまたはホスト胚にbackgraftedた。私たちは、Pax3/Zic1-induced細胞が移動し、in vitroおよびホスト胚12の両方の善意のNC細胞のように分化することがわかった。
ノースカロライナEMTおよび移行を支配する数多くの分子機構はまた、癌37における転移性播種に関与している。このプロトコルは、提供することを目的とする、簡単な、安価でeffici発生生物およびこれらの重要な細胞行動の基本的なメカニズムを探求する他の研究者のためのENTツール。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
作者は有用な議論とキュリー研究所の動物施設のためのフィブロネクチン、エリックTheveneau上の外植片の映像のためアデリーヌドリーに感謝します。 CMは、地方イル=ド=フランス（ドメーヌD'Interet Majeurポール幹細胞）、大学パリシュッド（アタッシェTemporaire D'Enseignementら·デ·ルシェルシュ）、および通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュのポスドクである。この作品は、大学のパリシュッド（Attractivite 2011）、センター国立·デ·ラ·ルシェルシュ科学研究（アクションThematiqueらIncitativeシュールプログラム）によって資金を供給された、協会はラ·ルシェルシュコントルルがんグラントSFI20101201882、リーグコントルルがん、およびアジャン国立デラを注ぐRECHERCHE（アジャン国立·デ·ラ·ルシェルシュ·プログラム·ブラン）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F4759-1MG | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | Euromedex | 04-100-811-C | Lower quality grade may be suitable for this application |
| Stainless Steel Insect Pins, Size 000 | FST | 26001 | |
| Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm | FST | 11252-20 |
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