Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Disseksjon av Published: March 4, 2014 doi: 10.3791/51118
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut Curie, Centre Universitaire, 2Université Paris Sud, Centre Universitaire, 3CNRS UMR 3347, Centre Universitaire, 4INSERM U1021, Centre Universitaire

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan å dissekere premigratory kranie neural crest (NC) fra Xenopus laevis neurulas. Disse explants kan bli belagt på fibronectin og dyrket in vitro, eller i podet inn i vertsembryoer. Denne teknikken gjør det mulig å studere mekanismene for NC epitel-til-mesenchyme overgang, migrasjon, og differensiering.

Abstract

Den neural crest (NC) er en transient dorsal neural tube cellepopulasjon som gjennomgår en epitel-til-mesenchyme overgang (EMT) ved enden av neurulation, vandrer i stor utstrekning mot forskjellige organer, og differensierer til mange typer av derivater (neuroner, gliaceller, brusk og ben, pigmenterte og endokrine celler). I denne protokollen beskriver vi hvordan å dissekere premigratory kranie NC fra Xenopus laevis embryo, for å studere NC utvikling in vivo og in vitro. Frosken modellen gir mange fordeler å studere tidlige utvikling, rike partier er tilgjengelige, embryoer utvikler seg raskt, in vivo gevinst og tap av funksjon strategier tillate manipulering av genuttrykk før NC disseksjon i donor og / eller verts embryoer. De NC explants kan bli belagt på fibronectin og anvendt for in vitro studier. De kan dyrkes i flere dager i et serum-fritt definert medium. Vi beskriver også hvordan å pode NC eksplantater tilbakeinn i vertsembryoer for å studere NC migrering og differensiering in vivo.

Introduction

Den neural crest (NC) er en transient embryocellepopulasjon som fremkommer fra det nevrale røret ved slutten av neurulation i virveldyr embryoer. Signalering og genetiske hendelser som styrer NC spesifikasjonen starte så tidlig som gastrulation. NC er spesifisert på grensen mellom det nevrale og ikke-nevrale ektoderm av signaler fra omkringliggende rygg vev. På slutten av neurulation, NC celler gjennomgå en epitel-til-mesenchyme overgang (EMT) og vandrer mye i embryoet følgende stereotype ruter ved å svare på rundt guiding signaler. Når de har nådd sin endelige destinasjon, skille de inn i et stort utvalg av derivater, f.eks nevroner, gliaceller, bein, brusk, og pigmenterte celler 1-5. På grunn av deres bidrag til mange celletyper og embryonale vev, mangler ved ethvert trinn av NC celler utvikling, fra induksjon til finalen differensiering, kan forårsake medfødte syndromer som heter neurocristopathies seks. Experimental manipulering av utviklings NC på ulike stadier - spesifikasjon, EMT, migrasjon og differensiering - vil forbedre vår forståelse av neurocristopathies og la design av potensielle terapeutiske strategier.

Den Xenopus laevis embryo er en modell av valget å studere NC utvikling. Et stort antall av embryoer er lett å få tak i, og ekstern befruktning gir tilgang til de aller første skritt i utviklingen. Mange verktøy er tilgjengelige for å eksperimentelt manipulere X. laevis embryoutvikling. Gene gain-of-funksjon og knockdown er enkle å utføre ved microinjecting individuelle celler i tidlige blastulas. Embryonale vev kan kuttes for in vitro assosiering 7-11 eller back-pode analyser 12,13.

I denne protokollen beskriver vi hvordan å dissekere ut premigratory kranie NC i X. laevis sene neurulas, før migrasjon. Disse eksplantater kan dyrkes på fibronectin-belad plater for å studere migrasjon og differensiering i kontrollerte in vitro eksperimentelle forhold. NC eksplantater kan også bli podet inn i normale eller manipulert verts embryo for å studere deres migrasjon og differensiering in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter samsvar med nasjonale og europeiske forskrifter om vern av dyr som brukes til vitenskapelige formål og med internasjonalt etablerte prinsipper for erstatning, reduksjon og raffinement.

En. Utarbeidelse av Fibronektin-belagte Retter 14

  1. Pipetter 500 ml av 10 mg / ml kulturkvalitet fibronektin fortynnet i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) inn i en standard plastpetriskål (diameter 40 x 11 mm). Inkuber ved 37 ° C i 1 time. Merk: Hvis du bruker glass retter eller glass dekkglass for senere bildebehandling, bruker en 100 mg / ml fibronek løsning.
  2. Skyll tre ganger med 1x PBS.
  3. Bytt PBS med 500 ml 1x PBS/0.1% Bovine Serum Albumin (BSA). Inkuber ved 37 ° C i 30 min.
  4. Skyll tre ganger med 1x PBS.
  5. Fyll opp med 1x PBS og holde ved 4 ° C inntil bruk (vanligvis i 24-48 timer).

2. Disseksjon av NC explants

<ol>
  • Forbered 3/4 Normal Amphibian Medium (NAM) (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO3, 0,2 x PBS, 50 mg / ml gentamycin 10,15). Ikke holde mer enn en uke for disseksjon, oppbevares ved 4 ° C. Eldre NAM kan brukes for fremstilling av agarose-overtrukket disseksjon retter (nedenfor).
  • Forbered 60 mm petriskåler for disseksjon, belagt med 10 ml 2% agarose i 3/4 NAM.
  • Samle Disseksjonsverktøyer: plast Pasteur pipetter, montert en fineste insekt pin på pinneholderen (se materialer tabell for referanse), en "øyenbryn kniv" (laget med øyenbryn hår innebygd i parafin på tuppen av et glass Pasteur pipette 16), to bot disseksjon tang, P1000 pipette og tips, en kikkert stereoskop med forstørrelse 8-40X til 50, en sterk lyskilde med optiske fibre guider. Alle dissekere verktøy bør holdes ren, og etter hvert forsøk, skyll dem to ganger med destillert vann, når with 100% etanol og la tørke. Oppbevares vekk fra støv.
  • Fyll i disseksjon fatet med ferske NAM nesten til toppen.
  • Skaffe X. laevis embryoer i henhold til standard prosedyrer 10 og eldes dem før de når neurula fasen 16 (i henhold til Nieuwkoop og Faber utviklings tabell 17).
  • Plasser stadium 16 embryoer inn i disseksjon fatet ved hjelp av plast Pasteur pipette.
  • Utføre alle etterfølgende trinn under kikkerten omfang. Fjern vitelline membran med to par tang. Vær forsiktig så du ikke skader rygg del av embryoene.
  • Vent til embryoene har nådd stadium 17 for å starte disseksjon. Trinn 17 er hensiktsmessig ettersom den neural crest er tydelig angitt, bortsett fra det nevrale røret, i motsetning til tidligere stadier. Når trinn 17, starter NC migrering og intermingling med det omkringliggende mesenchyme.
  • Dig et lite hull i agarose med tang for å gjøre en nisje for embryoene for å opprettholdedem under disseksjonen. Plasser ett embryo ryggsiden opp. Merk: kan brukes til å opprettholde embryoene i stedet grave et hull inn i agarose modelleire bli.
  • Lag et snitt i den laterale delen av den fremre neural fold med øyenbrynet kniv og insekt pin. Vær forsiktig så du ikke gå for dypt inn i embryo: sikte på å skjære gjennom 2-3 cellelag (aldri nå så dypt som archenteron!). Under hele prosessen disseksjon, aldri tillate de dissekerte vev til å gå inn i kontakt med den luft-væske-grensesnittet siden X. laevis embryonale vev er lysert ved overflatespenning.
  • Foreta en andre parallell snitt i mer dorsale delen av neural fold ved hjelp av de samme instrumenter.
  • Hvis det er nødvendig, slår fatet rundt 90 °. Foreta en tredje vinkelrett snitt med øyenbrynet kniv og insekt-pin, i den bakre side av de to første snitt. Den NC er en tykk masse av celler under pigmenterte ytre sjikt av ektoderm, lateraltil nevralrøret.
  • Bruk tuppen av øyenbryn kniv til å løsne pigmentert Ektoderm lag fra den underliggende NC, fra den tredje snittet kanten.
  • Bruk side av øyenbryn kniv til å løsne NC vev fra den tredje innsnitt. NC vev er heller gråaktig, mens den underliggende cephalic mesoderm er hvit. Nøye skille NC fra mesoderm.
  • Løsne NC vev anteriorly fra den optiske vesikkel, og kuttet på dette nivået for å frigjøre eksplantering. Som en kontroll for første eksperimenter, sjekke snail2 ekspresjon (en kanonisk NC markør) i enkelte explants ved in situ-hybridisering er anbefalt.

    • Tre. Plating explants på Fibronectin

    1. Fylle inn fibronek belagt skål med Modified Danilchick Medium (MDM, NaCl 53 mm, Na2CO 3 5 mm, K Gluconate 4,5 mM, Na Gluconate 32 mm, MgSo4 1 mM, CaCl 2 1 mM, BSA 0,1%, justere pH til 8,3 med 1 M bicin
    2. Overfør explants inn i fibronektin-belagte tallerken ved hjelp av en pipette P1000. La aldri explants å røre luft-væske-grensesnittet. Først pipettere en væske inn i spissen, da de eksplantater Da vil litt væske på nytt. Ikke la noe luft inn i tuppen mens du overfører explants inn i fibronek-belagt parabolen. Når spissen er inne i væsken av fibronek belagt skål, la eksplantater sakte gå ned av tyngdekraften, eller presse veldig forsiktig. Unngå å mate ut explants for fort.
    3. Plasser 10-30 explants i fatet ved hjelp av øyenbryn kniv. Unngå sidene av formen, som ikke er tilfredsstillende for etterfølgende avbildning.
    4. Prøv ikke å flytte fatet til explants har festet på fibronek (det tar ca 15-30 min). Hvis nødvendig, flytter parabolen veldig nøye.
    5. Sett fatet i en nedkjølt inkubator (mellom 15-20 ° C, for temperatur diagram se 17). Når plassert ved 15 ° C, celler are vanligvis migrere effektivt og spredning etter seks timer med inkubasjon (dette tidspunktet kan variere mellom eksperimenter).

    4. Pode explants inn Host embryo

    1. Skjær et fint glass dekkglass i veldig små biter ved hjelp av grove tang. Størrelsen av stykkene bør være omtrent 1,5 mm 2. Dypp bitene i en petriskål med 3/4 NAM eller PBS med tang.
    2. Utarbeidelse av verten embryo: dissekere ut verten NC i 3/4 NAM som beskrevet i tre) med spesiell forsiktighet for ikke å skade verten embryo mens du fjerner vitelline membran og dissekere den NC. Vevet spenninger har en tendens til å øke størrelsen på ablasjon: la verts embryo leges delvis mens dissekere donor embryo.
    3. I en annen agarose-overtrukket tallerken eller i en annen del av det samme fatet, dissekere ut NC eksplantering fra donor embryo som beskrevet i protokoll 3. Overfør NC transplantat i formen inneholdende verts med forsiktighet, slik som beskrevet iProtokoll 3.
    4. Umiddelbart plassere NC explant på verten ablateres området ved hjelp av tang. Eksplantering skal feste delvis. Sett et stykke glass dekkglass på podet embryo for å opprettholde pode på plass. Velg et stykke glass større enn fosteret for å unngå å skade den. Embryoet vil være litt flat.
    5. Vent i minst 15-20 min, deretter forsiktig fjerne dekkglass. La embryoet gjenopprette for en annen 10 min og nøye pipettere den til en ren fatet fylt med 3/4 NAM ved hjelp av plast Pasteur pipette.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Når belagt på fibronektin, neural crest eksplantater feste raskt (15-30 min) og explant sprer flat innen to timer (figur 1A). Etter 3-6 timers celler begynner å spre. Ved 24 timer ved 15 ° C, har mange celler begynte å migrere vekk fra eksplantering (figurene 1B og 1C). Plomme gjør cellene svært lyse under fase kontrast (Figur 1B). Cell utstikkere (filopodes og lamellipodes) er godt synlig etter Phalloidin farging av aktin cytoskjelettet (figur 1C).

    For orthotopic pode eksperiment ble donor embryoer injisert med GFP mRNA for å kunne følge de podede celler i verten umerket embryo. Kranie NC ble ablated på den ene siden av verten, 30-60 min etter operasjonen pode har grodd, og erstatte den tyreoideaektomi vert kranie NC (figur 1D, to timer etter operasjon). Et par timer senere, har GFP-positive cellene migrertut fra explant og fulgte de stereotype vandringsveier NC celler mot ventral kraniofaciale steder (Figur 1E). I rumpetroll, har NC-avledet kraniofaciale strukturer utviklet (figur 1G). Når cranial NC ble ablateres, ble disse konstruksjoner mangler, noe som resulterer i en forkortet ansikt med øyet ved siden av sementkjertel (figur 1 H, røde piler). I podet tadpoles har donor NC-celler bidrar til cranio-facial strukturer, noe som resulterer i en normal ansikt morfologi (figurene 1F og 1I, grønne piler).

    Figur 1
    Figur 1. In vitro-og in vivo-oppførsel av eksplantert cranial NC. AC)   Premigratory NC ble dissekert. B ut fra en scene 17 neurula embryo og belagt på en fibronek belagt fatet. A) 2 timer etter plating, har explant festet og spredning) 24 timer etter plating, har cellene effektivt migrert på fibronek. C) lamellipodia og filopodia ses tydelig i migrere NC celler merket med phalloidin (grønn) DI) Neurula stadium 17 GFP + merket premigratory NC ble tatt fra en GFP-injisert embryo og back-podet inn i en verts embryo, som kranie NC ble ablated på scenen 17. - 18. D) To timer etter pode har explant helbredet. EF) podet NC celler aktivt har vandret ut og befolket kjeve strøm som vist på rumpetroll scenen 31. og 41. G) Kontroll stadium 41 rumpetroll. H) ablating NC har resultert i en dramatisk svikt i ansiktet og øynene utvikling (H: oppmerksom på at sementen gland utvikler tilstøtende til øyet, på grunn av mangelen på NC-celler fyller kjeveområde, røde piler. . Sammenligne å styre rumpetroll i G) F, I) Derimot har de podet NC celler restaurert øyet og kraniofaciale strukturer utvikling (F, I, grønne piler) AC, Scale barer = 100 mm;. DI, Scale bar = 1 mm . D, rygg visning. EI, side utsikt. Dette tallet har blitt forandret fra Milet et al. 12 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Denne protokollen beskriver en enkel teknikk for å eksplanterer premigratory kranie NC i X. laevis embryoer. Embryoene som brukes for slike eksperimenter må være robust og gro godt. Kast alle batch av usunn embryoer. I tillegg blir embryoene ved forskjellige temperaturer (fra 12 til 18 til 20 ° C), for å skjære neural crest ved trinn 17 og ikke senere. Når trinn 17, kan neural crest blandes med cefalisk mesoderm og kan ikke fjernes helt. Xenopus vev leges raskt og deretter mister vedheft til andre vev. Det er viktig å arbeide hurtig og plassere neural crest eksplantater i verten så snart den fjernes fra donor.

    Angå in vitro eksperimenter, kan fibronektin kultur retter bli forurenset med bakterier eller sopp etter et par dager. Bruk antibiotika og rent eller sterilt utstyr og løsninger så ofte som mulig.

    Denne fremgangsmåten er optimalisert feller kranie neural crest. Faktisk er denne cellepopulasjon veldefinert og lokalisert i fase 17 Xenopus embryoer. Dessverre er denne modellen ikke er hensiktsmessig å utføre slike eksperimenter på stammen NC. Bird embryoer er mer egnet for de som er interessert i å manipulere en slik trunk NC cellepopulasjon.

    Eksplantene beskrevet i denne protokollen kan brukes for å studere forskjellige aspekter av NC oppførsel, både in vivo og in vitro. NC molekylær utviklings program er i stor grad bevart i virveldyr 19. Frog utviklingen er en kraftig modell for å studere virveldyr NC EMT, migrasjon og differensiering. X. laevis embryonale celler inneholder nok plomme for å tillate deres overlevelse in vitro i flere dager uten tilsetning av noen ekstern næringsstoff. Således kan in vitro-studier teste effekten av forskjellige vekstfaktorer eller kjemiske forbindelser, på en enkel og fullstendig kontrollert kulturmedium. Slike forsøk har værtutformet for å analysere EMT og migrasjon, herunder å studere effekten av kjemoterapi-tiltrekningsmidler eller kjemoterapi-midler, for aktivering eller blokkering av signalveier, etc. 14,20-24 Denne fremgangsmåten kan også brukes til å utforme forbedrede rettet NC differensierings protokoller. I forbindelse med utvikling av protokoller for regenerativ medisin, skaffe diverse NC-avledet celletyper in vitro kan brukes i narkotika screening for forståelse og behandling av neurocristopathies 25,26.

    NC utvikling er orkestrert av et komplekst samspill mellom cellestyrte forskrifter og signaler fra de omkringliggende vev. Eksperimentelle manipulasjoner av gen-ekspresjon, enten i donor NC eller i verts embryo, tillater diskriminerende celle autonomt fra noncell styrte aspekter ved NC utvikling. Kombinere gain-of-funksjon og knock-down tilnærminger til denne protokollen for in vitro kultur og in vivo pode har blitt bruked 14,21,23,27-36.

    Denne teknikken kan tilpasses for å pode andre vev i vertsembryoer og teste for deres migrering og differensiering potensialer. For eksempel har vi brukt pluripotent blastocoel taket ektoderm ("dyre cap") for å se etter en minimal transcriptional bryter for NC utvikling. Vi har studert effekten av to transkripsjonsfaktorer, pax3 og zic1, på NC engasjement og senere utvikling. Animal caps med pax3 og zic1 gain-of-funksjon ble belagt på fibronektin in vitro eller backgrafted inn verts embryoer. Vi fant ut at Pax3/Zic1-induced celler migrere og differensiere som bona fide NC celler både in vitro og in verts embryoer 12.

    Tallrike molekylære mekanismer som styrer NC EMT og migrasjon er også involvert i metastatisk formidling i kreft 37. Denne protokollen tar sikte på å gi en enkel, billig og effektivitetent verktøy for utviklings biologer og andre forskere å utforske de grunnleggende mekanismene for disse viktige celle atferd.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne har ingenting å avsløre.

    Acknowledgments

    Forfatterne takker Adeline Dolly for bildene av eksplantering på fibronectin, Eric Theveneau for nyttige diskusjoner og Animal Facility av Institut Curie. CM er en postdoktor i Region Ile de France (Domaine d'Interet Majeur Stem Pole), Universite Paris Sud (Attache Temporaire d'Enseignement et de Recherche), og Agence Nationale de la Recherche. Dette arbeidet ble finansiert av Universite Paris Sud (Attractivite 2011), den Centre National de la Recherche Scientifique (Handling Thematique et Incitative sur Programme), Association pour la Recherche contre le Cancer Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cancer, og Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programme Blanc).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin from bovine plasma Sigma F4759-1MG
    Bovine Serum Albumin, Fraction V Euromedex 04-100-811-C Lower quality grade may  be suitable for this application
    Stainless Steel Insect Pins, Size 000 FST 26001
    Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm FST 11252-20

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
    2. Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).
    3. Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction. Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).
    4. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates. Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).
    5. Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos. Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).
    6. Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. Molecular Bases of Human Neurocristopathies. Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).
    7. Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization. J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).
    8. Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation. J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).
    9. Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction. Cell. 50 (5), 749-758 (1987).
    10. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2000).
    11. Monsoro-Burq, A. -H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).
    12. Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).
    13. Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy. Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).
    14. Theveneau, E., et al. Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity. Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).
    15. Slack, J. M., Forman, D. An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).
    16. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
    17. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. New York. (1994).
    18. Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).
    19. Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
    20. Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin. Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).
    21. Fort, P., et al. Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration. Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).
    22. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
    23. Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases. Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).
    24. Hwang, Y. -S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).
    25. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
    26. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs. Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).
    27. Shnitsar, I., Borchers, A. PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration. Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).
    28. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
    29. Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. Wnt11r is required for cranial neural crest migration. Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).
    30. Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).
    31. Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2. Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).
    32. Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration. Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).
    33. Borchers, A., David, R., Wedlich, D. Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification. Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).
    34. Borchers, A., Epperlein, H. -H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).
    35. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).
    36. Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues. Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).
    37. Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).

    Tags

    Developmental Biology Neural crest, Embryo disseksjon pode fibronektin
    Disseksjon av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest for<em&gt; In vitro</em&gt; Eksplantering kultur eller<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantasjon
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Milet, C., Monsoro-Burq, A. H.… More

    Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation. J. Vis. Exp. (85), e51118, doi:10.3791/51118 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter