Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

متعدد الطبقات لتركيب المدى الطويل المجهر الضوئي ورقة من الزرد

doi: 10.3791/51119 Published: February 27, 2014

Summary

يمكن اتباعها لتطوير الزرد خلال الأيام مع المجهري ورقة الضوء عندما يتم تضمين الأجنة في أنابيب البوليمر واضحة بصريا مع منخفضة التركيز الاغاروز.

Abstract

المجهر الضوئي ورقة هي تقنية التصوير المثالي لدراسة التطور الجنيني الزرد. بسبب الحد الأدنى الصور سمية والتبييض، ويناسب ذلك وخاصة على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير على مدى ساعات طويلة تصل إلى عدة أيام. ومع ذلك، هناك حاجة إلى استراتيجية مناسبة تركيب العينة أن يقدم كل من الولادة والتطور الطبيعي للعينة. متعدد الطبقات المتزايدة، وهي تقنية جديدة باستخدام التضمين المنخفضة تركيز الاغاروز في أنابيب واضحة بصريا، ويتغلب الآن هذا القيد وتطلق العنان لكامل إمكانات المجهر ضوء ورقة في الوقت الحقيقي البيولوجيا التطورية.

Introduction

لفهم الأحداث والتفاعلات المعقدة خلال مرحلة التطور الجنيني، والبحوث في البيولوجيا التطورية هو المزيد والمزيد من التحرك من المجهري للخلايا وحيدة وأجهزة لفي الجسم الحي التصوير من الكائنات بأكملها. تفشل تقنيات الفحص المجهري التقليدية عادة لتقديم القرار المكانية والزمانية لمتابعة الأحداث السريعة على مدى فترة طويلة من الزمن، وغالبا ما تسبب تبيض أو التأثيرات الضوئية في العينة 1. نحن وغيرنا وجدت ورقة المجهر الضوئي (الشكل 1) أن الأسلوب المثالي لفي الجسم الحي التصوير من الزرد 2-4. إضاءة العينة مع ورقة رقيقة من ضوء الليزر، ومتعامد على محور الكشف، ويقدم باجتزاء بصري سريع لقرار مكانية عالية وكذلك التقليل من الصور سمية 5. في نفس الوقت، ونتيجة لهذا الترتيب بصرية فريدة من نوعها، وتقنيات التركيب عينة التقليدية باستخدام أطباق بتري أو دوائر الثقافة ليست مناسبة. في ضوء نموذجيالمجهر رقة ثلاثة محركات متعدية ومحرك التناوب عقد العينة، بحيث يمكن وضعه على وجه التحديد، وتحولت وينظر إليها من أي اتجاه. في العينات للفحص المجهري ورقة الماضي الضوء وغالبا ما كان جزءا لا يتجزأ من 1-2٪ الاغاروز داخل الزجاج الشعرية 6،7. في هذه الحالة هو مقذوف الاسطوانة الاغاروز طدت مع العينة جزءا لا يتجزأ من الزجاج الشعرية في حجرة العينة مليئة المتوسطة مثل الماء للتصوير. الاغاروز لديها معامل الانكسار على مقربة من المياه وبالتالي فهي مناسبة تماما لفي الجسم الحي المجهري ورقة الخفيفة التي يسهل الإضاءة والكشف البصريات تصحيح الماء. يقتصر العينة في الاغاروز جامدة ويمكن تصويرها بشكل جيد لفترة قصيرة من الوقت، ولكن يعانون من ضعف بشدة التغييرات التخلق ونمو الجنين عند التصوير لعدة ساعات 7،8. على الرغم من حلول لتطبيقات أخرى تم تطويرها وموسع على المدى الطويل الوقت الفاصل بين الزرد إمكانية التصوير المجهري ورقة ضوء لا يمكن استغلالها باستخدام التقليدية 1.5٪ الاغاروز التضمين.

لذا قمنا بتطوير استراتيجية جديدة للتصاعد في الجسم الحي المجهري ورقة ضوء الأجنة الزرد 10. هي التي شنت العينة في 0.1٪ الاغاروز مع 200 ملغم / لتر تريكين داخل أنبوب مصنوع من البوليمر واضحة بصريا المفلورة الإثيلين البروبيلين (محطة إثراء الوقود). الجنين جزءا لا يتجزأ من تطور عادة بسبب اللزوجة المنخفضة من المتوسط. في نفس الوقت، وأنبوب محطة إثراء الوقود يحصر المتوسطة وعينة لمدة التجربة. ونحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لتقنية جديدة وتركيب البيانات الحالية تعكس مزاياه عبر بروتوكول التقليدية. علينا أن نبرهن أنه مع أسلوبنا التنمية الزرد يمكن تصويرها بشكل مستمر مع القرار المكانية والزمانية عالية على مدى فترة من أكثر من يومين.

5IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg "/>
الشكل 1. مبدأ المجهر رقة الخفيفة. يمكن ترجمتها A الزرد شنت في أنبوب مصنوع من الإيثيلين البروبيلين المفلورة (محطة إثراء الوقود) واستدارة من خلال البؤري للهدف الكشف. ومن المتوقع ورقة رقيقة من ضوء الليزر (ورقة الضوء) عن طريق الهدف الإضاءة في المستوى البؤري للهدف الكشف وينير سوى جزء البصرية رقيقة من العينة. يتم جمع إشارة مضان المنبعثة من الهدف كشف وتسجيلها على شريحة الكاميرا.

Protocol

1. إعداد المواد

  1. إعداد أنابيب FEP
    1. تنظيف محطة إثراء الوقود أنبوب (الشكل 2A) من قبل بيغ السوائل (في الخطوات المذكورة أدناه) من خلال أنبوب وباستخدام حقنة مرفقة مع نهاية حادة قنية (الشكل 2B) ملاحظة 1:. استخدام القفازات في جميع أنحاء الداخلي ملاحظة 2: نوصي قطع الأنبوب في قطعة من كاليفورنيا. 1 متر في الطول وتنظيف تلك بالتوازي.
      1. أول تدفق أنبوب مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم بشكل متكرر. ثم نقل إلى أنبوب 50 مل أنبوب الطرد المركزي مليئة 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم وultrasonicate ذلك لمدة 10 دقيقة.
      2. نقل أنبوب البوليمر لحوض صغير مع DDH 2 O. طرد الأنبوب الأول مع [ده 2 O ثم مع 70٪ ETOH.
      3. في وقت لاحق نقل أنبوب محطة إثراء الوقود إلى أنبوب الطرد المركزي الطازجة مع 70٪ ETOH. مرة أخرى هذا ultrasonicate أنبوب الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة.
    2. قطع أنبوب محطة إثراء الوقود تنظيفها إلى قطعمن حوالي 3 سم (طول نموذجي للاستخدام في تصاعد الزرد والتصوير) وتصويب عليها إذا لزم الأمر. تخزين أنابيب FEP تنظيفها في 50 مل أنبوب الطرد المركزي الطازجة مليئة ده 2 O (الشكل 2C).
  2. إعداد محلول المخزون تريكين
    1. إعداد محلول المخزون 0.4٪ تريكين عن طريق إذابة 400 ملغ تريكين (MS-222) في 97.9 مل DDH 2 O. بعد مسحوق قد حلت تماما، وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام 2.1 مل 1M تريس (الرقم الهيدروجيني 9.0). حماية الحل بعيدا عن الضوء. مخزن aliquots في -20 درجة مئوية.
  3. إعداد 3٪ ميثيل
    1. إعداد 3٪ محلول ميثيل للطلاء الداخلي للأنابيب محطة إثراء الوقود كما هو موضح أدناه. تسخين E3 11 في زجاجة إلى ما يقرب من 60-70 درجة مئوية، وإضافة كمية مناسبة من مسحوق ميثيل. إضافة شريط التحريك وإثارة في 4 درجات مئوية. حالما يتم تبريد الحل وصولا الى أقل من 30 درجة مئوية، إضافة إلى حل تريكين ج النهائيoncentration من 100 ملغ / لتر. الحفاظ على اثارة في 4 درجات مئوية خلال الليل.
  4. إعداد 1.5٪ و 0.1٪ الاغاروز في E3
    1. تذوب كمية مناسبة من نقطة انصهار منخفضة مسحوق الاغاروز في حجم محدد من E3 في قارورة زجاجية. تسخين الخليط في الميكروويف والتخلص منه مرة واحدة في حين، حتى يظهر الحل الاغاروز متجانسة، من دون أي بلورات المتبقية.
    2. إعداد 1 مل aliquots من 0.1٪ الاغاروز حل في 1.5 مل أنابيب رد الفعل. يمكن تخزين aliquots في 4 درجات مئوية.
    3. استخدام الحل 1.5٪ إلى معطف طبق بتري البلاستيكية. يجب أن يكون سمك طبقة الاغاروز كاليفورنيا. 2 مم. بعد توطد الاغاروز، إضافة E3 المتوسطة على أعلى من طبقة لمنعها من الجفاف. يمكن تخزين طبق المغلفة في 4 درجات مئوية.
  5. إعداد الزرد
    1. الحفاظ على الزرد (دانيو rerio) البالغين والأجنة في 28.5 درجة مئوية، والتعامل معها وفقا للبروتوكولات المعمول 11،12.
    2. إعداد الأسماك الذكور والإناث في فترة ما بعد الظهر وفصلها باستخدام المفرق. إزالة المفرق في صباح اليوم التالي لآخر التزاوج من الأسماك.
    3. جمع الأجنة في صحن مليء E3 وفحصها باستخدام stereomicroscope.
    4. في 24 HPF (أو المرحلة التنموية ذات الاهتمام الخاص بك)، حدد الجنين الزرد مضان للتعبير ونقل الإيجابية إلى طبق جديد مع E3 الطازجة.
    5. dechorionate بعناية الأجنة باستخدام اثنين من ملقط حاد (أرقام 2D و 2E). استخدام ملقط لانتزاع أول وعقد المشيمه وملقط الثانية المسيل للدموع فتحه وتسحبه بعيدا ملاحظة 1: تنفيذ هذه الخطوة مع مساعدة من stereomicroscope.

2. تصاعد متعدد الطبقات

  1. طلاء أنبوب محطة إثراء الوقود
    1. إرفاق قنية نهاية حادة لحقنة. إدراج قنية بعناية لحوالي 3 ملم في واحدة من نهاية تنظيفها وقطع قطعة من. محطة إثراء الوقود أنبوب (أرقام 2F و 2G) ملاحظة 1: استخدام القفازات وتجنب الانحناء أو أي عصر من الأنبوب.
    2. تراجع نهاية خالية من أنبوب محطة إثراء الوقود إلى 3٪ ميثيل وملء الأنبوب مع الحل.
    3. الإفراج عن ببطء ميثيل بالضغط على حقنة. تجاهل الحل.
    4. كرر الخطوات من 2.1.2 و2.1.3 باستخدام E3 ملاحظة 1: الأنابيب المغلفة بحاجة إلى أن تستخدم لتركيب على الفور.
  2. نقل الزرد إلى الاغاروز
    1. تسخين قسامة واحدة من 0.1٪ الاغاروز إلى 70 درجة مئوية في كتلة الحرارة. دوامة لفترة وجيزة أنبوب تفاعل وتحويلها إلى كتلة الحرارة لتعيين 38 ° C (الشكل 2H).
    2. اتخاذ رد فعل أنبوب الخروج من كتلة الحرارة واتركها تبرد لفترة وجيزة. إضافة تريكين إلى تركيز النهائي من 133-200 ملغم / لتر ودوامة مرة أخرى (الشكل 2I).
    3. اختيار واحد من الأجنة الزرد dechorionated وحوالة. ص إلى أنبوب تفاعل مع مسخن 0.1٪ الاغاروز باستخدام ماصة باستير الزجاج (أرقام 2J و2K) ملاحظة 1: في محاولة لنقل أقل قدر ممكن E3 إضافية.
  3. تركيب الزرد
    1. يستغرق الجنين مع المرفقة حقنة محطة إثراء الوقود أنبوب (الشكل 2L). وينبغي أن تملأ أنبوب تماما مع 0.1٪ الاغاروز، مع الجنين وضعه على مقربة من طرفي الأنبوب ومع رئيس لافتا نحو افتتاح أنبوب ملاحظة 1: تأكد من تناول بعض الاغاروز قبل تناول الأسماك. ملاحظة 2: سحب بلطف شديد على حقنة لتجنب الفقاعات ملاحظة 3: الحفاظ على أنبوب في اتجاه أفقي لتجنب تسرب محتواه (أرقام 2M و2N).
  4. توصيل أنبوب
    الرقم 2
    الشكل 2. متعدد الطبقات المتزايدة للالأجنة الزرد. A) الإيثيلين البروبيلين المفلورة (محطة إثراء الوقود) أنابيب على أسطوانة كابل قبل التحضير. B) A المحاقن مع نهاية حادة قنية المرفقة. C) وتنظيفها وقطع أنبوب محطة إثراء الوقود. D، E) Dechorionation من 24 HPF الأجنة الزرد. F) ربط أنبوب إلى نهاية قنية حادة. G) والمحاقن مع قنية وأنبوب المرفقة. H) قسامة من 0.1٪ الاغاروز داخل أنبوب رد فعل حين نقله إلى كتلة الحرارة. الأول) vortexing لمن ذاب الاغاروز. J) من امتصاص الجنين dechorionated باستخدام ماصة الزجاج. K) نقل الجنين إلى الاغاروز ذاب. L) كمية من الجنين مع توضيح الاغاروز في أنبوب محطة إثراء الوقود. M، N) الجنين الزرد داخل أنبوب محطة إثراء الوقود . P) يسد الأنبوب عن طريق استخدام طبق المغلفة الاغاروز. س) الجنين داخل أنبوب موصول. R) إعداد العينة النهائية في حامل معدني. اضغط هنا ل عرض صورة أكبر.
    1. استخدام شفرة حلاقة لقطع أنبوب قبالة قنية (الشكل 2O).
    2. العصا ببطء نهاية الأنبوب الذي يحتوي على الأسماك من خلال طبقة كاملة من 1.5٪ الاغاروز في طبق من البلاستيك لسد الأنبوب (الشكل 2P) ملاحظة 1: تجنب تشكيل فقاعات ومحاولة الحصول على سطح المكونات على التوالي من خلال عقد . أنبوب بالضبط عمودي على سطح الاغاروز ملاحظة 2: تدوير الأنبوب قليلا للحصول على المكونات لطيفة.
    3. الحفاظ على العينة التي شنت في أنبوب 1.5 مل التفاعل مع E3 لتجنب التجفيف. العينة هو نآه جاهزة للتصوير. قبل التصوير، والتحقق ما إذا كان السمك هو يجلس على قمة المكونات (أرقام 2Q و2R). تأكد من إضافة أيضا إلى تريكين المتوسطة داخل غرفة التصوير في نفس التركيز كما في المتوسطة المتزايدة.

Representative Results

التصوير Multiday من اسماك الزرد الأوعية الدموية التنمية

نستخدم 1 DPF تيراغرام (kdrl: GFP) 13 الزرد للتدليل على مزايا استراتيجية متعددة الطبقات المتزايدة على المدى الطويل المجهري ورقة الخفيفة. والهدف من ذلك هو صورة تطوير الأوعية الدموية في الزرد بأكملها على مدار أيام 2. وقد شنت الجنين الزرد في 0.1٪ الاغاروز داخل ميثيل المغلفة أنبوب البوليمر. هنا، لا يقتصر الزرد من تصاعد المتوسطة ويمكن أن تتطور بشكل طبيعي. يرفع رأسه، والذيل يمتد ويظهر تنتشر الأوعية الدموية دون عوائق (الشكل 3).

الرقم 3
الشكل 3. التصوير Multiday للتنمية الأوعية الدموية الزرد. والأوعية الدموية من multilaشنت ريال يمني 1 DPF تيراغرام (kdrl: GFP) 13 الزرد يتطور دون عوائق في ضوء المجهر رقة على مدار يومين. ورقة ضوء الليزر 488 نانومتر متحمس مضان وتم الكشف عن إشارة باستخدام 10X/0.3 الهدف W وكاميرا EMCCD. تم الحصول عليها Z-المداخن على أربعة مناصب المتاخمة كل 10 دقيقة ومخيط مع فيجي 15 في وقت لاحق. وتظهر التوقعات كثافة اكبر من مجموعة فرعية من نقاط الوقت. شريط مقياس: 500 ميكرون اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

التصوير من اسماك الزرد مرحلة التطور الجنيني المبكر

هنا، علينا أن نظهر قدرة أنابيب محطة إثراء الوقود كوسيلة لدعم تصاعد للفحص المجهري ورقة ضوء مرحلة التطور الجنيني المبكر الزرد خلال اليوم الأول بعد الإخصاب. 8 HPF تيراغرام (H2A: GFP) أقيم 14 الجنين الزرد مع المشيمه لها سليمة داخل أنبوب E3 شغل مع طقطر nner من 1 ملم. أن النتائج في لقط طفيف في المشيمه. جميع العمليات التنموية خلال مرحلة التطور الجنيني لا تتأثر التركيب ويمكن تصور أمثل باستخدام المجهر رقة الخفيفة. في هذا المثال، ونحن تصوير العينة على مسار 12 ساعة (الشكل 4). يتغير شكل نموذجي خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر، مثل استطالة متزايدة من صفار البيض وسماكة الأنسجة على طول خط الوسط، سيكون المظلوم عند استخدام التركيب التقليدية دون المشيماء في 1.5٪ الاغاروز.

الرقم 4
الشكل 4 التصوير في وقت مبكر من مرحلة التطور الجنيني الزرد A تيراغرام (H2A: GFP). يمر 14 الزرد خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر. تم الكشف عن ورقة ضوء الليزر 488 نانومتر GFP متحمس وإشارة مضانمع الهدف W 10X/0.3 وكاميرا EMCCD. تم الحصول عليها Z-أكوام من زاويتين كل 3 دقائق على مدار 12 ساعة. وتظهر التوقعات كثافة اكبر من تطبيع مجموعة فرعية من مرور الوقت. مرئية الضبابية في 19 HPF النتائج من الوخز الجنين خلال الاستحواذ، حيث تم استخدام أي مخدر. شريط مقياس: 150 ميكرون اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

Discussion

تقنيات الفحص المجهري المتقدمة مثل المجهر ورقة ضوء تمكننا من تسجيل بيانات الصورة مع القرار الزماني والمكاني عالية على مدى عدة أيام، ولكن أيضا تتطلب تقنيات تركيب العينة إلى تحسين. نقدم بروتوكول مفصلة من متعدد الطبقات المتزايدة للفحص المجهري ورقة ضوء التطور الزرد. طريقة واضحة لتنفيذ ونستخدمها في مختبرنا على أساس يومي.

أنابيب FEP

المكونات الأساسية لاستراتيجيتنا هي تركيب أنابيب مصنوعة من الإيثيلين البروبيلين البوليمر المفلورة (محطة إثراء الوقود). قررنا استخدام محطة إثراء الوقود في المقام الأول بسبب معامل الانكسار لها من 1.338، والذي يشبه إلى المياه وبالتالي فهي مناسبة بشكل مثالي للفحص المجهري ورقة خفيفة مع أهداف المياه وغمس العينة التي تتطلب الوسط المائي. الأنابيب مع 0.8 ملم وقطرها الداخلي 0.4 مم سماكة الجدار تناسب الزرد النامية بشكل جيد للغاية، ويمكن استخدامها مع أصحاب عينة نموذجية مناسبة لل1.6 مم والشعيرات الدموية هي خيارنا الاول لطريقة عرض في تصاعد مستمر. نحن اختبار لهم بدقة في منطقتنا الاجهزة المدمج المنزل وكذلك في النظام التجاري "Lightsheet Z.1" من قبل كارل زايس المجهر وجدت أن أنابيب FEP توفر الاستقرار على المدى الطويل، لها تأثير ضئيل فقط على الأداء البصري وnonfluorescent هي 10. و، ومع ذلك، فإنها لا تتناسب مع عينات للتطبيقات التي تتطلب معامل الانكسار مختلفة، مثل مسح العينة.

تتوفر أنابيب فضلا عن رقائق مصنوعة من محطة إثراء الوقود في مجموعة متنوعة من أقطار وسمك. بالإضافة إلى ذلك، محطة إثراء الوقود يمكن ذاب في 260 درجة مئوية، وبالتالي تقدم احتمالات لا نهاية لها تقريبا لعينة الدعم حسب الطلب في تصاعد مستمر. أنابيب البوليمر تميل إلى أن يتم توفير غير المعقمة، وهذا هو السبب يتضمن البروتوكول تنظيف عدة خطوات لضمان أفضل جودة البصرية. طلاء مع ميثيل يضمن أن أي جزء من الجنين الزرد المتزايد تتمسك البوليمر.

الحمار = "jove_step"> والمتوسطة المتزايدة

ويستند القرار ل0.1٪ الاغاروز على اختبارات مكثفة من معدل النمو والجمود في تركيزات مختلفة من الاغاروز وميثيل 10. تركيزات الاغاروز أعلاه 0.1٪ وأظهرت بالفعل تأثير شديد على معدل نمو 24 HPF الزرد. بالإضافة إلى ذلك نستخدم جرعات منخفضة من تريكين المخدرات التخدير. إمكانات كتل تريكين العمل، مما يحول دون نقل الإشارات بين الدماغ والعضلات ويمنع تقلصات العضلات 16. A تركيز 133-200 ملغم / لتر يضمن تجميد كافية من الزرد بين 24-72 HPF. ومع ذلك، تريكين والمخدرات التخدير أخرى اختبرنا جرعة تظهر الآثار الجانبية تعتمد مثل الوذمة القلبية. بالإضافة إلى الجرعة المطلوبة من تريكين يختلف مع المرحلة التنموية للجنين. لذا نوصي الحد من تركيز تريكين إلى المبلغ اللازم للمراحل التنموية التي يتم تصويرها. لضمان أفضل الاداءم، ومنع تشكيل السامة والمنتجات، وينبغي أن تستخدم محلول المخزون تريكين الطازجة أو مطلق، محمية من الضوء وليس يسخن فوق 30 درجة مئوية.

التضمين في أنابيب FEP يسمح أيضا للتعديل من السهل المتوسطة المتزايدة لحساب احتياجات محددة. للالوقت الفاصل بين التصوير من القلب، ونحن نوصي باستخدام 3٪ ميثيل و 100 ملغم / لتر تريكين بدلا من 0.1٪ الاغاروز و 200 ملغم / لتر للتركيب. ميثيل هو أكثر لزوجة من 0.1٪ الاغاروز وبالتالي توفير أعلى الجمود من تلقاء نفسه ويحتاج إلى أقل تريكين استخدامها لضمان الحبس من الجنين.

تريكين حساس لدرجات حرارة تتجاوز 30 درجة مئوية، ويمكن أيضا أن تضعف من المتوسطة في غرفة التصوير، مما يؤدي إلى انخفاض الأداء والوخز ممكن من الجنين. لذلك، تأكد من استخدام تريكين أيضا في التصوير المتوسطة التي تغمر العينة التي شنت. إذا تجاربك تتطلب استخدام أعلىدرجات الحرارة، نوصي تبادل المتوسطة في غرفة التصوير إما باستمرار باستخدام نظام نضح أو يدويا مع أنبوب والمحاقن بين اثنين من نقاط الوقت.

الخطوات الحاسمة

الخطوات الحاسمة خلال عملية تركيب العينة هي كمية من العينة في أنبوب والإدراج من المكونات الاغاروز. يحدد كمية الموقف المبدئي للجنين، والتي هي مرهقة للتغيير بعد ذلك. يجب أن تكون العينات المتعددة المتاحة لتركيب وينبغي رصد نوعية تصاعد مع stereomicroscope. إذا كان التوجه عينة ليست مرضية، وتغيير سرعة وضع العينة وتجنب الحركات اللاحقة من المكبس قد تساعد في كثير من الأحيان وهذا يلوي الجنين. الاغاروز المكونات 1.5٪ ضروري لتجنب تسرب من الاغاروز 0.1٪. يجب أن يكون سطح المكونات داخل الأنبوب شقة لعدم التأثير على التوجه عينة خلال التنمية. لتحقيق الأمواج جيدةالآس، سمك طبقات مختلفة من الاغاروز تحتاج لفحصها ويحتاج الأنبوب ليتم وضعه في الاغاروز العادي إلى السطح. الدورية للأنبوب قليلا وسحب الأنبوب النشرات بعناية المكونات من الطبق. يجب فحص جودة التركيب مع stereomicroscope قبل التصوير.

التصوير Multiview

واحدة ميزة كبيرة من ورقة المجهر ضوء التصوير multiview، والقدرة على تدوير العينة، واكتساب ض أكوام من زوايا متعددة، وبعد ذلك تسجيل وتلتحم بها. طريقة أنشئت لتسجيل ض مداخن في الفضاء 3D هو تسجيل القائم على حبة باستخدام الخرز الفلورسنت المحيطة العينة كعلامات الائتمانية 17. ولكن هذه الطريقة تعتمد على وسيط الصلبة تصاعد مثل 1.5٪ الاغاروز وبالتالي يبدو لتكون متوافقة مع تصاعد متعدد الطبقات المقدمة هنا. ولكن العديد من الحلول البديلة تعمل بالاعتماد على التطبيق. أولا، يمكن للالخرز الفلورسنتأن تدمج المكونات الاغاروز، والتي يجب أن تكون في مجال الرؤية أثناء عملية الاستحواذ. الثانية، مواقف مرحلة يمكن معايرة قبل التجارب الفعلية باستخدام 1.5٪ العمود الاغاروز مع حبات الفلورسنت. الثالث، علامات بديلة مثل نوى الفلورسنت يمكن استخدامها لتحديد موقف ض مداخن بالنسبة لبعضها البعض.

تبخر

نموذجية الاجهزة المجهري ورقة ضوء استخدام حجرة العينة المفتوحة، الأمر الذي يؤدي إلى تبخر لا مفر منه على المدى المتوسط. منذ المتوسط ​​هو ضروري لبقاء العينة، لتقييد تبخر المتوسطة المتزايدة ومعامل الانكسار الصحيح بين البصريات وعينة، ونحن نوصي اتخاذ واحد أو أكثر من التدابير التالية لمنع التبخر. الأولى، والمتوسطة في غرفة يمكن تبادلها باستمرار من قبل نظام الارواء. الثانية، والمتوسطة يمكن تعبئتها يدويا. ثالثا، يمكن تغطيتها الغرفة مع غطاء أو رقائق مرنة.

تم تطوير محطة إثراء الوقود البوليمر على تحمل مجموعة كبيرة ومتنوعة من المواد الكيميائية وبالتالي فهي قوية، خامل كيميائيا وnonpermeable إلى الغاز. في حالة تصاعد الأكسجين متعدد الطبقات يمكن ان تخترق إلا من خلال المكونات الاغاروز واجهة الاغاروز الهواء، ولكن يبقى أن يظهر إذا امدادات الاوكسجين في تركيب متعدد الطبقات أقل بشدة بالمقارنة مع 1.5٪ في تصاعد الاغاروز دون دعم أنبوب البوليمر. لكن، وكما تصاعد في 1.5٪ الاغاروز يمكن أن تستخدم إلا لمدة ساعتين تقريبا قبل يتأثر التشكل الزرد متعدد الطبقات تصاعد يبدو أن الحل الشامل للتصوير متفوقة على المدى الطويل.

تصوير المراحل الأولى من التطوير

متعدد الطبقات المتزايدة أصبح الآن لدينا تقنية التضمين القياسية للفحص المجهري ورقة ضوء الوقت الفاصل بين الزرد الأكبر سنا من 24 HPF. وبالاضافة الى ذلك، ونحن أيضا استخدام أنابيب البوليمر لتصوير الأجنة مرحلة مبكرة. البريدتبقى mbryos في chorions وتقام في أنبوب محطة إثراء الوقود مع القطر الداخلي من 1 ملم ومليئة E3. الزرد يمكن أن تتطور بحرية داخل المشيماء ومازال يمكن تصويرها بشكل جيد باستخدام المجهر رقة الخفيفة.

توقعات

وقدم عينة متعدد الطبقات تصاعد تطلق العنان لكامل إمكانات المجهر ضوء ورقة في الوقت الحقيقي البيولوجيا التطورية مع الزرد. يمكن بسهولة أن يتم اعتمادها لتقنيات الفحص المجهري أخرى مثل التصوير المقطعي البصري الإسقاط (الأراضي الفلسطينية المحتلة) والكائنات الحية الأخرى. ونحن نعتقد أن محطة إثراء الوقود أنابيب من الحجم العادي ليست سوى الخطوات الأولى نحو تقنيات التركيب عينة مصممة خصيصا لتلبية الاحتياجات المحددة.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نشكر جمعية ماكس بلانك، وبرنامج العلوم الحدودي الإنسان (HFSP) وبورنغير إنغلهايم فون للتمويل والدعم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes Bola S 1815-04 0.8/1.6 mm inner/outer diameter, other sizes available
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe B. Braun Melsungen AG 9161406 V
Sterican Single-Use Cannula, blunt B. Braun Melsungen AG 9180109 0.8 mm x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430829
1 M NaOH
0.5 M NaOH 
70% EtOH
Methylcellulose Sigma M0387 supplied as powder
E3 medium (for zebrafish embryos)
1.5 ml Reaction Tube Eppendorf 3810X
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414 supplied as powder
Petri Dish Greiner 633180 plastic, 94 mm x 16 mm
Tricaine Sigma E10521 synonyms:  Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate 
10X/0.3 W Microscope Objective Lens Leica HCX APO L
EMCCD Camera Andor Technology iXon 885 EMCCD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136, (12), 1963-1975 (2009).
  2. Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nat. Methods. 10, (5), 413-420 (2013).
  3. Swoger, J., Muzzopappa, M., López-Schier, H., Sharpe, J. 4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies. J. Biophoton. 4, (1-2), 122-134 (2011).
  4. Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J. Biophoton. 1-11 (2012).
  5. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, (5), 566-572 (2011).
  6. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, (5686), 1007-1009 (2004).
  7. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Prot. 2010, (5), (2010).
  8. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy. Curr. Opin. Neurobiol. 18, (6), 624-632 (2008).
  9. Desmaison, A., Lorenzo, C., Rouquette, J., Ducommun, B., Lobjois, V. A versatile sample holder for single plane illumination microscopy. J. Microsc. 10, (2013).
  10. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, (17), 3242-3247 (2012).
  11. Nusslein-Volhard, C., Zebrafish Dahm, R. Oxford University Press. (2002).
  12. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J. Vis. Exp. (69), (2012).
  13. Jin, S. -W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -N., Stainier, D. Y. R. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, (23), 5199-5209 (2005).
  14. Pauls, S., Geldmacher-Voss, B., Campos-Ortega, J. A. A zebrafish histone variant H2A.F/Z and a transgenic H2A.F/Z:GFP fusion protein for in vivo studies of embryonic development. Dev. Genes Evol. 211, (12), 603-610 (2001).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  16. Frazier, D. T., Narahashi, T. Tricaine (MS-222): effects on ionic conductances of squid axon membranes. Eur. J. Pharmacol. 33, (2), 313-317 (1975).
  17. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
متعدد الطبقات لتركيب المدى الطويل المجهر الضوئي ورقة من الزرد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J. Vis. Exp. (84), e51119, doi:10.3791/51119 (2014).More

Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J. Vis. Exp. (84), e51119, doi:10.3791/51119 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter