Summary
斑马鱼的发展可以遵循以上光片镜天，当胚胎嵌在光学透明的聚合物管与低浓度琼脂糖。
Abstract
光薄片显微镜是理想的成像技术来研究斑马鱼胚胎发育。由于最小的光毒性和漂白，它特别适合用于长期延时成像在许多小时到几天。然而，适当的样品安装策略是必要的，同时提供隔离和样品的正常发育。多层安装，使用低浓度的琼脂糖在光学透明管一个新的嵌入技术，现在克服了这个限制，并释放出光片显微镜进行实时发育生物学的全部潜力。
Introduction
理解胚胎发育过程中的复杂事件和相互作用，研究在发育生物学是越来越多地从单个细胞和器官的显微移动到体内成像整个生物体。传统显微镜技术通常不能提供的空间和时间分辨率以上的很长一段时间，以跟随快速的事件常常造成脱色或示例1中的光毒性效果。我们和其他人发现光片显微镜（ 图1）是理想的技术在活体成像斑马鱼2-4。样品用薄板的激光的，正交的检测轴，该照明提供快速的光学切片的高空间分辨率，以及最小化的光毒性5。同时，由于这种独特的光学布置，使用的培养皿或培养腔室的传统样品的安装技术是不适合的。在一个典型的光片显微镜三个平移马达和旋转马达保持样本，以使得它可以被精确地定位，打开，并从任何方向看。在过去的标本进行光片显微镜常常被嵌入在1-2％琼脂糖玻璃毛细管6,7内。在这种情况下，与嵌入标本凝固的琼脂糖圆筒被挤压出来的玻璃毛细管进入充满水状介质用于成像的样品室。琼脂糖的折射率接近的水，因此是非常适合于在体内光片镜，有利于水校正照明和检测光学系统。样品被限制在刚性的琼脂糖和可成像很好的时间很短，但形态变化和胚胎的生长成像数小时7,8时被强烈地受到损害。虽然对于其它应用的解决方案已被开发如图9所示 ，非侵入性的长期的时间推移斑马鱼光片显微成像的潜力不能使用传统的1.5％琼脂糖包埋利用。
因此，我们开发了一个新的安装策略，斑马鱼胚胎10 在体内光片镜。样品被安装在0.1％琼脂糖有由光学透明的聚合物氟化乙烯丙烯（FEP）的管内200 mg / L的三卡因。嵌入式胚胎正常发展，由于介质的粘度低。在同一时间，该FEP管限制所述介质和样品在实验的持续时间。在这里，我们提供了新的安装技术和现在的数据反映其优于传统协议的详细协议。我们证明，我们的方法斑马鱼发育，可连续成像的高空间和时间分辨率在一段超过两天。
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图1：光片显微镜的原理。安装在制造氟化乙烯丙烯（FEP）的试管A斑马鱼可以翻译并通过检测目标的焦平面旋转。激光（光片）的一个薄片被照明的目标投射到检测目标的焦平面上并照亮试样的仅一个薄的光学部分。所发射的荧光信号被检测物镜收集并记录在摄像机芯片。
Protocol
1。材料准备
- FEP管的制备
- 通过管冲洗液（在下文所述的步骤），并使用附有钝端套管（ 图2B）的注射器清洁FEP管（ 图2A）注1：使用手套，整个过程注2：我们建议切割管中的CA件。在长度1米和清洗那些并联。
- 首先冲洗管1 M氢氧化钠反复。然后将管转移到50ml离心管中填充用0.5M NaOH和ultrasonicate它10分钟。
- 聚合物管转移到一个小盆地与双蒸2 O。冲洗管首先用双蒸2 O，然后用70％的乙醇。
- 随后，FEP管，用70％EtOH中转移到一个新的离心管中。再次ultrasonicate此离心管10分钟。
- 切开洗净FEP管成片约3厘米（典型长度在斑马鱼的安装和成像使用），并在必要时抚平。存储清洗FEP管在新的50ml离心管中充满了双蒸2 O（ 图2C）。
- 通过管冲洗液（在下文所述的步骤），并使用附有钝端套管（ 图2B）的注射器清洁FEP管（ 图2A）注1：使用手套，整个过程注2：我们建议切割管中的CA件。在长度1米和清洗那些并联。
- 的股票三卡因溶液的制备
- 准备0.4％三卡因原液在97.9毫升双蒸2 O溶解400毫克三卡因（MS-222）后的粉末完全溶解后，用2.1毫升1M的Tris（pH值9.0），将pH调节至7.0。由轻保护的解决方案。店铺等分于-20℃下
- 3％甲基纤维素的制备
- 制备3％的甲基纤维素溶液为如下所述的FEP管的内涂层。升温E3 11在玻璃瓶中，以约60-70℃，并加入甲基纤维素粉末的适当的量。添加搅拌棒搅拌，在4°C。一旦溶液冷却至30℃以下，加入三卡因溶液至最终Çoncentration 100毫克/升。保持在4℃下过夜搅拌。
- 1.5％的制备及其在E3 0.1％琼脂糖
- 溶解在E3中的玻璃烧瓶中定义的量的低熔点琼脂糖粉适量。在微波炉加热的混合物，并在一段时间曾经动摇它，直到琼脂糖溶液呈均匀，无任何遗留晶体。
- 制备1ml等份的0.1％琼脂糖溶液在1.5ml反应管中。的等分试样可被储存在4℃。
- 使用1.5％的溶液涂覆在塑料培养皿中。琼脂糖层的厚度应为约为2mm。后的琼脂糖固化，在该层的顶部加E3介质，以防止其干燥。该涂层菜可以储存在4°C
- 斑马鱼的制备
- 保持斑马鱼（ 斑马鱼 ）的成人和胚胎在28.5℃和处理它们按照既定的协议11,12。
- 成立雌雄鱼在下午和使用分频器将它们分开。取出分隔第二天早晨时间鱼的交配。
- 收集胚胎在充满E3盘中，用立体显微镜检查它们。
- 在24 HPF（或者你感兴趣的发育阶段），选择斑马鱼胚胎的荧光表达和积极的因素转移到新菜，新鲜的E3。
- 使用两个锋利的钳（ 图2D和2E）仔细dechorionate胚胎。使用第一个钳子抓住不放绒毛膜和第二镊子撕它打开，并把它关闭。 注1：用立体显微镜的帮助下执行此步骤。
2。多层安装
- 涂FEP管
- 附上一个钝端套管的注射器。小心地插入套管的约3毫米成的清洁一端切一块，FEP管（ 图2F和2G）注1：使用手套，避免管的任意弯曲或挤压。
- 浸FEP管的自由端插入到3％的甲基纤维素和填充管与所述溶液。
- 慢慢地通过推动注射器松开甲基纤维素。弃去溶液。
- 。使用E3 注1重复步骤2.1.2和2.1.3：将涂覆管需要被用于立即安装。
- 转移到斑马鱼的琼脂糖
- 升温0.1％琼脂糖之一等分至70℃的加热块。涡流反应管短暂，并将其转移到一个加热块设定为38℃（ 图2H）。
- 就拿反应管从散热块，让它冷却下来简要介绍。加三卡因对133-200毫克/升和涡流的最终浓度再（ 图2I）。
- 选择一个dechorionated斑马鱼胚胎和transfe·R它在反应管与预热的0.1％琼脂糖用玻璃巴氏吸管（ 图2J和2K）注1：尝试传输尽可能少的额外E3越好。
- 安装斑马鱼
- 占用胚胎与注射器连接FEP管（ 图2L）。该管应完全用0.1％琼脂糖充满，与位于靠近管的两端的胚胎，并与头朝筒的开口注1：请一定要采取一些琼脂糖占用鱼之前。 注2：上拉非常平缓的注射器，以避免气泡注3：保持所述管在水平方向上，以避免其内容（ 图2M及2N）的泄漏。
- 堵管
图2。多层安装的斑马鱼胚胎A）氟化乙烯丙烯的准备。前B电缆卷筒（FEP）管）附加钝端套管的注射器。C）洗净，切FEP管D，24个高倍视野E）Dechorionation的融化的0.1％琼脂糖一个反应管内，同时将其传递到散热块斑马鱼胚胎F）装上管钝端套管G）与套管和管连接的注射器。 高）等分。 一）涡旋式用玻璃吸管dechorionated胚胎的琼脂糖J）吸收K）转移的胚胎进入熔融琼脂糖胚胎。 升）进邻近琼脂糖入FEP管M，N）的FEP管内的斑马鱼胚胎。- 用剃刀刀片切割的管销套管（ 图2O）。
- 慢慢坚持通过在塑料培养皿堵塞管（ 图2P）1.5％琼脂糖的整个一层含鱼管的末端注1：避免泡沫的形成，并尝试通过举办获得直塞表面。管完全垂直于琼脂糖表面注2：旋转筒稍微得到一个不错的插件。
- 保持在1.5ml反应管中装入的样品与E3，以避免干燥。样品为n的OW准备进行成像。成像前，检查插头（ 图2Q及2R）顶部的鱼是否是坐在右边。确保同时添加三卡因以相同的浓度在安装介质成像室内部的介质。
Representative Results
斑马鱼血管系统开发的多天成像
我们用1 DPF 的Tg（kdrl：GFP）13斑马鱼表现出与多层安装策略，长期光片显微镜的优点。其目的是对图像中的血管系统中的整个斑马鱼的发育超过2天的疗程。在斑马鱼胚胎中，安装在0.1％琼脂糖一个甲基纤维素包衣的聚合物管内。这里，斑马鱼未被安装介质的限制，并且可以正常地发育。它的头提出，尾部延伸和血管发芽不受阻碍地出现（ 图3）。
图3。斑马鱼血管发育的多日的成像。一个multila的血管揭掉安装1 DPF 的Tg（kdrl：GFP）13斑马鱼的发展不受阻碍地在光薄片显微镜在两天的课程。 488 nm激光片光源激发的荧光，并使用10X/0.3 W的目标和EMCCD相机检测到信号。被收购的四个相邻的位置，每10分钟的Z-堆栈，随后缝合与斐济15。示的时间点的子集的最大强度投影。比例尺：500微米点击这里查看大图。
斑马鱼早期胚胎发育的成像
在这里，我们展示FEP管的能力，作为对斑马鱼早期胚胎发育过程中受精后的第一天灯片镜的安装支持。 8 HPF 的Tg（H2A：GFP）14斑马鱼胚胎被安装其完整绒毛膜一个E3填充管内与我新新人类创新直径为1毫米。而导致绒毛膜轻微夹紧。胚胎发育过程中所有的发育过程是不受安装并可以使用光片显微镜得到最佳可视化。在这个例子中，我们成像的样品在12小时的过程中（ 图4）。在早期胚胎发育的典型形状的变化，如蛋黄，并沿中线组织增厚的增大伸长率，将使用不绒毛膜在1.5％琼脂糖传统安装时受到压迫。
图4的成像斑马鱼早期胚胎发育 的Tg（H2A：GFP）。通过早期胚胎发育14斑马鱼通过。 488 nm激光片光源激发GFP和荧光信号检测与10X/0.3 W的目标和EMCCD相机。 Z-堆栈从两个角度分别获得每3分钟超过12小时的课程。示的时间推移的一个子集的归一化最大强度投影。可见运动模糊在收购过程中胚胎抽搐19 HPF结果，因为没有麻醉剂被使用。比例尺：150微米点击这里查看大图。
Discussion
如光片显微先进的显微技术，使我们在数天的过程中具有高时空分辨率来记录图像数据，还需要样品安装技术来提高。我们提出多层安装的斑马鱼发育的轻质板材镜的详细协议。该方法实现起来非常简单，我们用它在我们的实验室每天。
该FEP管
我们的安装策略的主要组成部分是由聚合物氟化乙烯丙烯（FEP）的管子。我们决定使用，主要是因为它的折射率1.338的指数，这是类似的水，因此非常适合用于光片用显微镜浸水的目标和要求含水介质样品FEP。用0.8毫米内径和0.4壁厚合适的显影斑马鱼非常良好的管，可以用适合于1.6毫米典型样品架被用来毛细血管，是我们对所提出的安装方法的第一选择。我们完全在我们的家庭建造的设置，也可以在商业系统“Lightsheet Z.1”卡尔蔡司显微镜测试了它们，结果发现全氟乙丙烯管提供长期稳定，对光学性能只有很小的影响，并有非荧光10。它们，然而，不适合于应用程序，需要一个不同的折射率， 例如 ，清除标本样品。
可在各种直径和厚度的管，以及全氟乙丙烯制成的箔。此外，FEP可在260℃熔化，从而提供了定制的样品安装支持几乎无限的可能性。聚合物管趋向于提供非无菌，这就是为什么在清洁协议包含几个步骤，以确保最佳的光学质量。用甲基纤维素的涂层确保了日益增长的斑马鱼胚胎的任何部分枝到聚合物中。
0.1％琼脂糖的决定是基于增长速度，不动在不同浓度的琼脂糖和甲基纤维素10的广泛的测试。琼脂糖浓度0.1％以上，已经表现出对24 HPF斑马鱼的生长速度造成严重影响。此外，我们使用低剂量的麻醉药物三卡因的。三卡因块的动作电位，从而抑制大脑和肌肉之间的信号传输，并抑制肌肉收缩16。为133-200毫克/升的浓度，确保24-72 HPF斑马鱼之间有足够的固定化。然而，三卡因和其他麻醉药物，我们测试显示剂量依赖的副作用如心脏水肿。另外三卡因的所需剂量随胚胎的发育阶段。因此，我们建议降低三卡因浓度需要被成像的发展阶段的量。为了确保最佳performanCE和防止形成有毒的副产物，新鲜的或解冻三卡因原液使用，应避光和高于30°C加热不
在FEP管的嵌入还允许安装到中占据特定需求的容易变形。对心脏的时间推移成像，我们建议用3％甲基纤维素和100 mg / L的三卡因，而不是0.1％琼脂糖和200 mg / L的安装。甲基纤维素是高于0.1％的琼脂糖因而其本身提供了更高的固定性和少三卡因需要被使用，以确保胚胎的禁闭更粘稠。
三卡因是在温度高于30℃敏感，也可通过介质中的成像腔稀释，导致性能和胚胎可能抽搐下降。因此，请务必使用三卡因亦在其中安装的试样浸入成像介质。如果您的实验需要使用更高的温度下，我们要么经常通过使用灌注系统或手动用两个时间点之间的管和注射器建议在成像室交换的媒介。
关键步骤
样品的安装过程中的关键步骤是该试样的摄入量入管和琼脂糖插头的插入。吸气定义了胚胎的初始位置，这是麻烦的事后改变。多个标本应提供给安装和安装质量应用立体显微镜进行监测。如果样品取向不理想，改变拟定的标本，避免活塞的后续动作的速度可能会帮助，因为这往往扭曲的胚胎。在1.5％琼脂糖插头是必要的，以避免在0.1％琼脂糖的泄漏。管内的插塞的表面应是平坦的，以开发过程中不影响样品取向。为了达到良好的冲浪能手，不同厚度的琼脂糖层的需要进行测试和管需要被放入琼脂糖垂直于表面。旋转管一点点，拔出管子从盘仔细释放插头。的安装质量应与前成像立体显微镜进行检查。
多视点成像
光表镜的一个主要优点是多视点成像，旋转试样，从多个角度采集的z栈，并随后注册并融合他们的能力。已建立的方法来注册的Z堆叠在3D空间中是使用了样品周围作为受信标记17荧光珠基于珠子的登记。然而这种方法依赖一个牢固的安装介质，如1.5％琼脂糖，因而似乎是与此处多层安装呈现不兼容。但几种可供选择的解决方案根据不同的应用工作。首先，将荧光珠可以掺入琼脂糖插头，其具有将在视场的采集过程。第二，舞台的位置可以用与荧光珠1.5％琼脂糖柱的实际实验之前进行校准。第三，替代标记物，如荧光细胞核，可用于识别的Z堆叠的相对于彼此的位置。
蒸发
典型光片镜设置使用一个开放的样品室，这必然导致介质的蒸发。由于介质是必不可少的试样的生存，以限制所述安装介质的蒸发和对光学元件和样品之间的正确的折射率时，建议采取以下一种措施，以防止蒸发或更多。首先，在腔室中的介质，可以不断地通过灌注系统进行交换。第二，该介质可以被手动重新填充。第三，该腔室可盖上盖子或柔性箔。
该聚合物的FEP的开发是为了承受大的各种化学品，因此是健壮的，化学惰性和不渗透到气体。在多层安装氧气的情况下只能通过琼脂糖塞和琼脂糖 - 空气界面渗透，但它仍有待证明如果比较时安装在1.5％琼脂糖无支撑聚合物管中的氧供给多层安装是严重降低。然而，由于安装在1.5％琼脂糖只能用约两小时之前斑马鱼的形态受到影响多层安装似乎是长期成像的整体优越的解决方案。
成像早期发展阶段
现在多层安装已经成为我们对斑马鱼的年龄超过24 HPF时间推移光片镜检标准的嵌入技术。除此之外，我们还可以使用聚合物管早期胚胎成像。电子mbryos留在他们的绒毛膜和被安装在一个FEP管1毫米的内径和充满E3。斑马鱼可以自由发展绒毛膜内，利用光片镜以及仍然可以成像。
展望
所提出的多层样品安装释放出的光薄片显微镜与斑马鱼实时发育生物学的全部潜力。它可以很容易地用于诸如光学投影层析成像（OPT）和其他微生物等显微技术所采用。我们认为，标准尺寸的全氟乙丙烯管只是对根据特定需求的样品安装技术的第一步。
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢马普学会，人类前沿科学计划（HFSP）和勃林格殷格翰全宗的资助和支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes | Bola | S 1815-04 | 0.8/1.6 mm inner/outer diameter, other sizes available |
| Omnifix-F Solo 1 ml Syringe | B. Braun Melsungen AG | 9161406 V | |
| Sterican Single-Use Cannula, blunt | B. Braun Melsungen AG | 9180109 | 0.8 mm x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube |
| 50 ml Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 1 M NaOH | |||
| 0.5 M NaOH | |||
| 70% EtOH | |||
| Methylcellulose | Sigma | M0387 | supplied as powder |
| E3 medium (for zebrafish embryos) | |||
| 1.5 ml Reaction Tube | Eppendorf | 3810X | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414 | supplied as powder |
| Petri Dish | Greiner | 633180 | plastic, 94 mm x 16 mm |
| Tricaine | Sigma | E10521 | synonyms: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate |
| 10X/0.3 W Microscope Objective Lens | Leica | HCX APO L | |
| EMCCD Camera | Andor Technology | iXon 885 EMCCD |
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