Multilayer Beslag for Langsigtet Light ark mikroskopi af zebrafisk

Summary

Udviklingen af ​​zebrafisk kan følges over dage med lys ark mikroskopi når embryoner er indlejret i optisk klare polymer rør med lav koncentration agarose.

Abstract

Light plade mikroskopi er den ideelle imaging teknik til at studere zebrafisk embryonale udvikling. På grund af minimal foto-toksicitet og blegning, er det særligt velegnet til langsigtede time-lapse billeddannelse over mange timer op til flere dage. Imidlertid er der behov en passende prøve montering strategi, der tilbyder både indespærring og normal udvikling af prøven. Flerlags montage, en ny indlejring teknik ved hjælp af lav koncentration agarose i optisk klare rør, overvinder nu denne begrænsning, og slipper det fulde potentiale af lys plade mikroskopi for real-time udviklingsmæssige biologi.

Introduction

For at forstå de komplekse begivenheder og interaktioner under embryogenese, forskning i udviklingspsykologi biologi er mere og mere bevæger sig fra mikroskopi af enkelte celler og organer til in vivo billeddannelse af hele organismer. Traditionelle mikroskopi teknikker typisk undlader at tilbyde den rumlige og tidsmæssige opløsning til at følge hurtige begivenheder over en længere periode og ofte forårsager blegning eller fototoksisk effekt i prøve ^1. Vi og andre fandt lys ark mikroskopi (figur 1) for at være det ideelle teknik til in vivo billeddannelse af zebrafisk ^2-4. Belysningen af prøven med en tynd plade af laserlys, vinkelret på opdagelse akse, tilbyder hurtig optisk sektionering med høj rumlig opløsning samt minimeret foto-toksicitet ^5.. På samme tid, på grund af denne unikke optiske arrangement traditionelle prøve montering teknikker anvender petriskåle eller kultur kamre ikke er egnede. I en typisk lysark mikroskop tre translationelle motorer og en roterende motor holde prøven, således at den kan placeres præcist, vendte og ses fra alle retninger. I de seneste prøver for lys ark mikroskopi er ofte blevet indlejret i 1-2% agarose inde i et glas kapillar ^6,7. I dette tilfælde den størknede agarose cylinder med de indlejrede prøve ekstruderes ud af kapillarrøret i prøven kammer fyldt med vand som medium for billeddannelse. Agarose har et brydningsindeks tæt på vand og er derfor perfekt egnet til in vivo let plade mikroskopi, der letter vand-korrigeret belysning-og detekteringsoptikken. Prøven er begrænset i den stive agarose og kan filmede godt for en kort periode, men morfogenetiske ændringer og vækst af fosteret er stærkt svækket, når billeddannelse i flere timer ^7,8. Selvom løsninger til andre programmer er blevet udviklet ^9, den noninvasive langsigtede time-lapse zebrafisk billeddannelse potentiale plade lys mikroskopi ikke kan udnyttes ved hjælp af den konventionelle 1,5% agarose indlejring.

Vi udviklede derfor en ny montage-strategi for in vivo let plade mikroskopi af zebrafisk embryoner ^10. Prøven monteres i 0,1% agarose med 200 mg / L tricaine inde i et rør fremstillet af optisk klar polymer fluorholdige ethylenpropylen (FEP). Den integrerede embryo udvikler sig normalt på grund af lav viskositet af mediet. Samtidig, FEP rør begrænser mediet og prøven for varigheden af ​​forsøget. Her giver vi en detaljeret protokol for den nye montering teknik og præsentere data, der afspejler sine fordele i forhold til den konventionelle protokol. Vi viser, at med vores metode zebrafisk udvikling løbende kan filmede med høj rumlig og tidsmæssig opløsning over en periode på mere end to dage.

5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg "/>
Figur 1.. Princippet om lys ark mikroskopi. En zebrafisk monteret i et rør lavet af Fluorineret ethylenpropylen (FEP) kan omsættes og roteres gennem brændplan af målet afsløring. En tynd plade af laserlys (lys ark) ventes af belysningen målsætning i brændplanet af målet afsløring og lyser kun en tynd optisk del af prøven. Det udsendte fluorescens signal indsamles af målet afsløring og optaget på et kamera chip.

Protocol

1.. Klargøring

1. Fremstilling af FEP-rør
   1. Rengør FEP røret (figur 2A) ved at skylle væsker (i trin bemærket nedenfor) gennem røret og bruge en sprøjte fastgjort med en stump ende kanyle (figur 2B) Note 1:.. Brug handsker under hele proceduren Note 2: Vi anbefaler, afskæring af røret i stykker på ca. 1 m lang og rengøring dem parallelt.
      1. Skylle først røret med 1 M NaOH gentagne gange. Overfør derefter røret til et 50 ml centrifugerør fyldt med 0,5 M NaOH og ultralydsbehandles det i 10 min.
      2. Overfør polymer rør til et lille bassin med Hedeselskabet ₂ O. Skyl glasset først med _ddH2O og derefter med 70% EtOH.
      3. Derefter overføre FEP rør til et frisk centrifugerør med 70% EtOH. Igen ultralydsbehandles denne centrifugerør i 10 min.
   2. Skær den rensede FEP slange i stykkerpå omkring 3 cm (en typisk længde til brug i zebrafisk montering og billedbehandling) og rette dem, hvis det er nødvendigt. Opbevar de rensede FEP rør i en frisk 50 ml-centrifugerør fyldt med _ddH2O (figur 2C).
2. Fremstilling af tricaine stamopløsning
   1. Forbered 0,4% tricaine stamopløsning ved at opløse 400 mg tricaine (MS-222) i 97.9 ml Hedeselskabet ₂ O. Når pulveret er helt opløst, justere pH til 7,0 ved hjælp af 2,1 ml 1M Tris (pH 9,0). Beskyt opløsningen mod lys. Store portioner ved -20 ° C.
3. Fremstilling af 3% methylcellulose
   1. Forbered 3% methylcellulose løsning til indvendig belægning af FEP-rør som beskrevet nedenfor. Opvarm E3 ¹¹ i en glasflaske til ca 60-70 ° C og tilsættes en passende mængde af methylcellulose pulver. Tilføj en omrører og omrøres ved 4 ° C. Så snart opløsningen afkøles til under 30 ° C, tilsættes tricaine opløsning til en endelig concentration på 100 mg / L. Hold under omrøring ved 4 ° C natten over.
4. Fremstilling af 1,5% og 0,1% agarose i E3
   1. Opløses den passende mængde af agarose med lavt smeltepunkt pulver i et defineret rumfang E3 i en glaskolbe. Opvarm blandingen i en mikrobølgeovn og ryst den en gang imellem, indtil agaroseopløsningen forekommer homogen, uden nogen tilbageværende krystaller.
   2. Forbered 1 ml alikvoter af 0,1% agarose-opløsning i 1,5 ml reaktionsglas. Portionerne kan opbevares ved 4 ° C.
   3. Anvend 1,5% opløsning til at overtrække en plastik petriskål. Tykkelsen af agarose lag skal være ca. 2 mm. Når agarosen er størknet, tilsættes E3 medium oven på lag for at forhindre det fra udtørring. Den overtrukne skålen kan opbevares ved 4 ° C.
5. Udarbejdelse af zebrafisk
   1. Hold zebrafisk (Danio rerio) voksne og embryoner ved 28,5 ° C og håndtere dem i overensstemmelse med de fastlagte protokoller ^11,12.
   2. Opsæt mandlige og kvindelige fisk i eftermiddag, og adskille dem ved hjælp af en skillevæg. Fjern divider den følgende morgen til anden parring af fisken.
   3. Saml embryoner i et fad fyldt med E3 og undersøge dem ved hjælp af et stereomikroskop.
   4. På 24 HPF (eller udviklingsstadium din interesse), vælg zebrafisk foster til fluorescens udtryk og overføre de positive til et nyt fad med frisk E3.
   5. Dechorionate forsigtigt embryoner ved hjælp af to skarpe pincet (fig. 2D og 2E). Brug de første pincet til at gribe og holde chorion og den anden pincet til at rive det åbne og trække det væk Note 1:. Udfør dette trin ved hjælp af et stereomikroskop.

2. Multilayer Montering

1. Coating FEP rør
   1. Vedhæft en stump ende kanyle til en sprøjte. Indsæt kanylen omhyggeligt for omkring 3 mm i den ene ende af en renset og skåret stykke. FEP rør (figur 2F og 2G) Note 1: Brug handsker og undgå enhver bøjning eller klemning af røret.
   2. Dyp den frie ende af FEP røret i 3% methylcellulose og fyld glasset med løsningen.
   3. Slip langsomt methylcellulose ved at trykke på sprøjten. Kassér opløsningen.
   4. Gentag trin 2.1.2 og 2.1.3 ved hjælp af E3 Note 1:. De coatede rør skal bruges til at montere samme.
2. Overførsel af zebrafisk til agarose
   1. Opvarm en alikvot af 0,1% agarose til 70 ° C i en varmeblok. Vortex reaktionsrøret kort og overføre det til en varmeblok indstillet til 38 ° C (figur 2H).
   2. Tag reaktionsrøret fra varmeblokken og lad den køle ned kortvarigt. Tilføj tricaine til en endelig koncentration på 133 til 200 mg / L og vortex igen (fig. 2i).
   3. Vælg en af ​​de dechorionated zebrafisk embryoner og transfe. r den til reaktionsrøret med forvarmet 0,1% agarose ved hjælp af en glas Pasteur-pipette (figur 2J og 2K) Note 1: prøv at overføre så lidt ekstra E3 som muligt.
3. Montering af zebrafisk
   1. Tag op embryonet med sprøjten-attached FEP rør (figur 2L). . Røret skal fyldes helt med 0,1% agarose, med foster placeret tæt på hver ende af røret og med hovedet pegende mod åbningen af røret Note 1: Sørg for at tage nogle agarose, før du tager op fisk. Note 2: Træk meget forsigtigt på sprøjten for at undgå bobler Note 3:. Hold røret i en horisontal orientering for at undgå lækage af dens indhold (figur 2M og 2N).
4. Tilslutning røret
   
   Figur 2. Multilayer montage for zebrafisk embryoner. A) Fluoreret ethylenpropylen (FEP) rør på en kabeltromle før tilberedning. B) en sprøjte med en stump ende kanyle påsat. C) A rengøres og skæres FEP rør. D, E) Dechorionation på 24 HPF zebrafisk embryoner. F) Montering af røret til den stumpe ende kanyle. G) Sprøjten med kanyle og rør fastgjort. H) En portion på 0,1% agarose inde i en reaktion rør mens overføre det til en varmeblok. I) vortexblanding af smeltet agarose. J) Optagelse af et dechorionated foster ved hjælp af et glas pipette. K) Overførsel af embryoet i den smeltede agarose. L) Indtagelse af foster med omgivende agarose i FEP rør. M, N) Zebrafisken foster inde i FEP rør . P) Tilslutning af røret ved anvendelse af en agarose-coatet skålen. Q) Den foster inde i tilsluttet rør. R) Slutpræparatet prøve i en metalholder. Klik her se større billede.
   
   1. Bruge et barberblad til at skære røret fra kanylen (figur 2O).
   2. Langsomt stikke enden af røret med fisk gennem hele laget på 1,5% agarose i plastik skål til at sætte røret (figur 2P) Note 1:. Undgå dannelse af bobler og forsøge at opnå en lige stik overflade ved at holde rør nøjagtig vinkelret på agarose overflade Note 2:. Drej røret lidt for at få en dejlig prop.
   3. Hold de monterede modellen i et 1,5 ml reaktion rør med E3 for at undgå udtørring. Prøven er now klar til at blive afbildet. Før billedbehandling, kontrollere, om fisken sidder lige på toppen af proppen (figur 2Q og 2R). Sørg også tilføje tricaine til mediet inden i billedbehandling kammer i samme koncentration som i montage medium.

Representative Results

Multiday Imaging af zebrafisk vasculature Development

Vi bruger 1 dpf Tg (kdrl: GFP) ¹³ zebrafisk at demonstrere fordelene ved den flerlagede montering strategi for langsigtet plade lys mikroskopi. Målet er at billedet udvikling af vaskulaturen i hele zebrafisk en løbet af 2 dage. Zebrafisk embryo var monteret i 0,1% agarose i en methylcellulose coatet polymer rør. Her er zebrafisk begrænses ikke af monterings medium og kan udvikle sig normalt. Dens hoved rejser, halen udvider og vaskulær spiring vises uhindret (Figur 3).

Figur 3. Multiday billeddannelse af zebrafisk vaskulatur udvikling. Vaskulaturen af multilateraleyer monteret 1 dpf Tg (kdrl: GFP) ¹³ zebrafisk udvikler uhindret i en plade lys mikroskop i løbet af to dage. En 488 nm laserlys ark exciteres fluorescens og signalet blev detekteret ved anvendelse 10X/0.3 W objektiv og en EMCCD kamera. Z-stacks er erhvervet på fire tilstødende positioner hver 10 min og efterfølgende syet med Fiji ^15. Maksimal intensitet fremskrivninger af en delmængde af tidspunkter bliver vist. Skala bar:. 500 um Klik her for at se større billede.

Billeddannelse af Early zebrafisk embryogenesen

Her vil vi demonstrere evnen til FEP rør som et monterings støtte til lys plade mikroskopi af tidlig zebrafisk embryogenese løbet af den første dag efter befrugtningen. De 8 HPF Tg (H2A: GFP) ¹⁴ zebrafisk foster var monteret med dens intakte chorion inde i en E3-fyldte rør med en inner diameter på 1 mm. Dette resulterer i en let fastspænding af chorion. Alle udviklingsprocesser under embryogenese er upåvirket af montering og kan være optimalt visualiseres ved hjælp af lys ark mikroskopi. I dette eksempel har vi afbildet prøven en løbet af 12 timer (figur 4). Typiske formændringer under tidlig embryogenese, såsom stigende forlængelse af blommen og fortykkelse af væv langs midterlinien, vil blive undertrykt ved anvendelse af den traditionelle montering uden chorion i 1,5% agarose.

. Figur 4 Imaging af tidlig zebrafisk embryogenese A Tg (H2A: GFP). ^14. zebrafisk passerer gennem tidlig embryogenese. En 488 nm laserlys ark ophidset GFP og fluorescenssignalet blev detekteretmed en 10X/0.3 W objektiv og en EMCCD kamera. Z-stakke fra to vinkler blev erhvervet hver 3 min over et kursus på 12 timer. Normaliseret maksimale intensitet fremskrivninger af en delmængde af time-lapse vises. Synlig motion blur ved 19 HPF resultater fra embryo trækninger under erhvervelse, da ingen bedøvelsesmiddel blev anvendt. Skala bar:. 150 um Klik her for at se større billede.

Discussion

Avancerede mikroskopi teknikker såsom lys ark mikroskopi giver os mulighed for at optage billeddata med høj tidslig og rumlig opløsning i løbet af flere dage, men også kræve prøve montering teknikker til at forbedre. Vi præsenterer en detaljeret protokol af flerlagede montering til let plade mikroskopi af zebrafisk udvikling. Metoden er ligetil at gennemføre, og vi bruger det i vores laboratorium på en daglig basis.

FEP-rør

Centrale elementer i vores montage strategi er rør lavet af polymer Fluorineret ethylenpropylen (FEP). Vi besluttede at bruge FEP primært på grund af dets brydningsindeks på 1,338, hvilket svarer til vand, og derfor velegnet til plade lys mikroskopi med vand-dypning mål og prøven kræver vandige medier. Rørene med 0,8 mm indre diameter og 0,4 mm vægtykkelse passe udviklingslandene zebrafisk meget godt, kan anvendes sammen med typiske prøveholdere egnet til 1,6 mmkapillærer og er vores første valg til den præsenterede montage metode. Vi har testet dem grundigt i vores hjemmebyggede setups samt i det kommercielle system "Lightsheet Z.1" af Carl Zeiss mikroskopi og fandt, at FEP rør tilbyde langsigtet stabilitet, kun har minimal indflydelse på optisk ydeevne og er fluorescerende ^10. De er dog ikke velegnet til applikationer med prøver, der kræver en anderledes brydningsindeks, fx ryddet eksemplar.

Rør samt folier fremstillet af FEP er tilgængelige i en bred vifte af diametre og tykkelser. Desuden kan FEP smeltes ved 260 ° C og dermed giver næsten uendelige muligheder for skræddersyede prøve montering understøtter. De polymere rør tendens til at blive leveret usterilt, hvilket er grunden til rengøring protokollen indeholder flere skridt for at sikre bedst optisk kvalitet. Belægningen med methylcellulose sikrer, at ingen del af det voksende zebrafisk foster klæber til polymer.

Beslutningen om 0,1% agarose er baseret på omfattende test af vækstrate og immobilitet i forskellige koncentrationer af agarose og methylcellulose ^10. Agarose koncentrationer over 0,1% allerede viste en alvorlig indvirkning på væksten på 24 HPF zebrafisk. Derudover bruger vi lave doser af den bedøve narkotika tricaine. Tricaine blokerer handling potentialer, hæmmer således signaltransmission mellem hjerne og muskler og undertrykker muskelsammentrækninger ^16. En koncentration på 133-200 mg / L sikrer tilstrækkelig immobilisering af zebrafisk mellem 24-72 HPF. Men tricaine og andre bedøvelsesmidler narkotika testede vi viser dosisafhængig bivirkninger såsom hjerte-ødem. Derudover den nødvendige dosis af tricaine varierer med udviklingsstadiet af embryoet. Vi anbefaler derfor at reducere tricaine koncentrationen til det beløb, der er nødvendig for udviklingsstadier, der er afbildet. For at sikre bedst performance og forhindre dannelsen af ​​giftige biprodukter bør frisklavet eller optøet tricaine stamopløsning skal bruges, beskyttet mod lys og ikke opvarmet over 30 ° C.

Indlejring i FEP-rør giver også mulighed for nem ændring af den stigende medie at tage højde for specifikke behov. For time-lapse billeddannelse af hjertet, anbefaler vi at bruge 3% methylcellulose og 100 mg / L tricaine i stedet for 0,1% agarose og 200 mg / L til montering. Methylcellulose er mere tyktflydende end 0,1% agarose dermed give højere immobilitet på sin egen og mindre tricaine skal bruges til at sikre, indespærring af embryoet.

Tricaine er følsom over for temperaturer over 30 ° C og kan også fortyndes med mediet i imaging kammer, hvilket fører til nedsat ydelse og eventuel trækninger af embryoet. Sørg derfor for at bruge tricaine også i det billeddannende medium, hvori monterede prøven er nedsænket. Hvis dine eksperimenter kræver brug af højeretemperaturer, anbefaler vi at udskifte mediet i imaging kammer enten konstant ved hjælp af en perfusion system eller manuelt med et rør og en sprøjte mellem to tidspunkter.

Kritiske trin

De kritiske trin under processen med at prøve montering er indtagelsen af ​​prøven ind i røret, og indsættelse af agaroseprop. Indtaget definerer den indledende position af embryonet, hvilket er besværligt at ændre bagefter. Flere prøver skal være tilgængelige at montere og den stigende kvalitet bør overvåges med et stereomikroskop. Hvis prøven orientering ikke er tilfredsstillende, kan ændre hastigheden på udarbejdelsen af ​​prøven og derved undgås senere bevægelser af stemplet hjælpe, da dette ofte vrider embryoet. De 1,5% agaroseprop er nødvendig for at undgå udsivning af 0,1% agarose. Overfladen af ​​proppen inde i røret skal være fladt for ikke at påvirke prøven orientering under udvikling. For at opnå en god surfes, har brug for forskellige tykkelser af agarose lag, der skal testes, og røret skal sættes i agarose vinkelret på overfladen. Dreje røret en lille smule og trække slangen frigiver forsigtigt stikket fra fadet. Kvaliteten af ​​monteringen skal kontrolleres med et stereomikroskop før billeddannelse.

Multiskærm imaging

En væsentlig fordel ved lys plade mikroskopi er multiview billeddannelse, evnen til at rotere prøven erhverve z-stakke fra flere vinkler og efterfølgende registrere og fusionere dem. En etableret metode til at registrere de z-stakke i 3D-rum er perle-baserede registrering hjælp fluorescerende perler omkring prøven som tillidsforpligtelser markører ^17. Denne metode dog afhængig af en solid montering medium, såsom 1,5% agarose, og dermed synes at være uforenelig med flerlags montering præsenteres her. Men flere alternative løsninger fungerer afhængigt af programmet. Først, kan den fluorescerende perlerinkorporeres i agarose-stik, som skal være i synsfeltet i købet. For det andet kan stage positioner kalibreres før de faktiske eksperimenter under anvendelse af en agarosesøjle 1,5% med fluorescerende perler. For det tredje kan alternative markører, såsom fluorescerende kerner anvendes til at identificere positionen af ​​z-stakke i forhold til hinanden.

Fordampning

Typiske lys ark mikroskopi opsætninger anvende en åben prøve kammer, som uundgåelige fører til fordampning af mediet. Da mediet er afgørende for overlevelsen af ​​prøven, for at begrænse fordampningen af ​​montage medium og for den korrekte brydningsindeks mellem optik og prøve, anbefaler vi at tage et eller flere af følgende foranstaltninger for at forhindre fordampning. Først kan mediet i kammeret konstant udveksles med en perfusion system. For det andet kan mediet manuelt genopfyldes. For det tredje kan kammeret være dækket med et låg eller en folie.

Polymeren FEP blev udviklet til at modstå en lang række af kemikalier, og er derfor robust, kemisk inerte og ikke-permeabel for gas. I tilfælde af flerlagede montering ilt kan kun trænge gennem agaroseprop og agarose-air interface, men det er stadig at blive vist, hvis iltforsyning i flerlags montering er stærkt lavere i forhold til montering i 1,5% agarose uden støttemateriale polymer rør. Men som montering i 1,5% agarose kan kun anvendes i omkring to timer før zebrafisk morfologi påvirkes multilayer montering synes at være den overordnede overlegen løsning til langsigtet billeddannelse.

Imaging tidligere udviklingstrin

Multilayer montage er nu blevet vores standard indlejring teknik til time-lapse lys plade mikroskopi af zebrafisk ældre end 24 HPF. Ud over, at vi også bruge polymere rør til billeddannelse af tidligere stadier embryoner. Embryos forblive i deres chorions og er monteret i en FEP rør med en indre diameter på 1 mm og fyldt med E3. Zebrafisken kan frit udvikle inde chorion og kan stadig filmede godt ved hjælp af lys ark mikroskopi.

Outlook

Den præsenterede flerlagede prøve montering slipper det fulde potentiale af lys plade mikroskopi for real-time udviklingsmæssige biologi med zebrafisk. Det kan nemt blive vedtaget for andre mikroskopi teknikker såsom optisk projektion tomografi (OPT) og andre organismer. Vi mener, at standard-størrelse FEP rør er blot de første skridt i retning prøve monteringsteknikker skræddersyet til specifikke behov.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes	Bola	S 1815-04	0.8/1.6 mm inner/outer diameter, other sizes available
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe	B. Braun Melsungen AG	9161406 V
Sterican Single-Use Cannula, blunt	B. Braun Melsungen AG	9180109	0.8 mm x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube	Corning	430829
1 M NaOH
0.5 M NaOH
70% EtOH
Methylcellulose	Sigma	M0387	supplied as powder
E3 medium (for zebrafish embryos)
1.5 ml Reaction Tube	Eppendorf	3810X
Agarose, low gelling temperature	Sigma	A9414	supplied as powder
Petri Dish	Greiner	633180	plastic, 94 mm x 16 mm
Tricaine	Sigma	E10521	synonyms:  Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate
10X/0.3 W Microscope Objective Lens	Leica	HCX APO L
EMCCD Camera	Andor Technology	iXon 885 EMCCD