Summary
ゼブラフィッシュの胚の発達は、低濃度のアガロースで光学的に透明なポリマーチューブに埋め込まれている光シート顕微鏡で日間にわたって追跡することができる。
Abstract
シート光顕微鏡は、ゼブラフィッシュの胚発生を研究するための理想的なイメージング技術である。により、最小限の光毒性及び漂白するためには、数日までの数時間にわたる長期タイムラプスイメージングに特に適している。しかし、適切なサンプルの実装戦略は、閉じ込めとサンプルの正常な発達の両方を提供することが必要である。多層は、取り付け、光学的に透明なチューブに低濃度のアガロースを使用して新しい埋め込み技術は、今、この制限を克服し、リアルタイム発生生物学のためのシート光顕微鏡の可能性を最大限に解き放つ。
Introduction
胚形成の間の複雑なイベントや相互作用を理解するためには、発生生物学の研究は、全生物のin vivoイメージングへの単一細胞や臓器の顕微鏡から移動し、より多くのです。伝統的な顕微鏡技術は、典型的には、長期間にわたって急速イベントを追跡する空間および時間分解能を提供できず、しばしば漂白または試料1の光毒性効果を引き起こす。我々は、他のシート光顕微鏡（ 図1）は、ゼブラフィッシュ2-4 のin vivoイメージングのための理想的な技術であることがわかった。検出軸に直交するレーザ光 の薄いシート試料の照明は、高い空間分解能と同様に最小化された光毒性5による高速光学切片を提供しています。同時に、これにより、独自の光学配置に、ペトリ皿または培養チャンバを用いて従来のサンプル実装技術は適していない。典型的な光の中でモータつの並進および回転運動は、試料を保持するシート顕微鏡は、それが正確に位置決めすることができるように、なって、任意の方向から見た。光シート顕微鏡用に過去の試験片では、多くの場合、ガラスキャピラリー6,7内部の1〜2％アガロース中に埋め込 まれています。この場合、埋め込まれた検体と固化したアガロースシリンダは、イメージングのための水のような媒体で満たされた試料室にガラス毛細管の外に押し出される。アガロースは水に近い屈折率を有するため、水補正された照明および検出光学系を容易にし、生体内光シート顕微鏡に最適です。試料は、剛性アガロース中に閉じ込められ、短時間でよく撮像することができるが、数時間のために、7,8撮像する際の変更形態形成および胚の成長が強く損なわれている。他のアプリケーションのためのソリューションは、非侵襲的、長期タイムラプスゼブラフィッシュに、9を開発されているがシート光顕微鏡のイメージングの可能性は、従来の1.5％アガロース埋め込みを使用して悪用されることはありません。
したがって、我々は、ゼブラフィッシュ胚10 のin vivo光シート顕微鏡のための新しいマウントの戦略を開発しました。試料は、光学的に透明なポリマー、フッ素化エチレンプロピレン（FEP）からなる管の内部を200mg / Lのトリカインアガロースを0.1％に装着されている。埋め込まれた胚は、通常、媒体の低粘度のために開発しています。同時に、FEPチューブは実験期間中培地およびサンプルを閉じ込める。ここでは、従来のプロトコルを介して、その利点を反映した新たな実装技術と現在のデータの詳細なプロトコルを提供する。私たちは、法のゼブラフィッシュの開発を継続的に超える2日間にわたって高い空間分解能と時間分解能で画像化できることを実証している。
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図1光シート顕微鏡の原理。フッ素化エチレンプロピレン（FEP）製のチューブに装 着ゼブラフィッシュは、翻訳されたと検出対物レンズの焦点面を介して回転させることができる。レーザ光（光シート）の薄いシートは、検出対物レンズの焦点面内の照明対物レンズによって投影された試料の薄膜のみの光学部を照明する。放出された蛍光シグナルは、検出目的によって収集し、カメラチップに記録される。
Protocol
1。材料の準備
- FEP管の製造
- チューブを通って（段階的に以下に記載）の液体をフラッシュし、平滑末端カニューレ（ 図2B）を取り付けたシリンジを使用することにより（ 図2A）FEPチューブを清掃してください（注1）。使用手袋作業中は2点に注意してください 。お勧めCAの作品でチューブを切断。長さは1メートルと並行して、それらをクリーニング。
- 最初の繰り返し1M NaOHでチューブを洗浄します。次いで、0.5 M NaOHで充填された50ml遠心チューブに移し、チューブを10分間、それをultrasonicate。
- 蒸留H 2 Oでの小流域にポリマーチューブを転送最初のddH 2 Oで、次に70％エタノールでチューブをフラッシュします。
- その後、70％エタノールで新しい遠心管にFEPチューブを移す。再び10分間この遠心管をultrasonicate。
- 粉々にきれいにFEPチューブをカット必要に応じて、約3センチメートル（ゼブラフィッシュ取り付け及びイメージングにおける使用のための典型的な長さ）とは、それらをまっすぐ。のddH 2 O（ 図2C）で満たされた新鮮な50ミリリットルの遠心管に洗浄FEP管を保管してください。
- チューブを通って（段階的に以下に記載）の液体をフラッシュし、平滑末端カニューレ（ 図2B）を取り付けたシリンジを使用することにより（ 図2A）FEPチューブを清掃してください（注1）。使用手袋作業中は2点に注意してください 。お勧めCAの作品でチューブを切断。長さは1メートルと並行して、それらをクリーニング。
- トリカイン原液の調製
- 97.9ミリリットルののddH 2 O中に400mgのトリカイン（MS-222）を溶解して0.4％トリカイン原液を準備します粉末が完全に溶解した後、2.1ミリリットルの1Mトリス（pH 9.0）を用いてpHを7.0に調整。光からソリューションを保護します。 -20℃での店舗分量
- 3％のメチルセルロースの調製
- 後述するようにFEP管の内側コーティング3％メチルセルロース溶液を調製する。約60〜70℃までガラス瓶にE3 11を加熱およびメチルセルロース粉末を適量加える。攪拌棒を加え、4℃で撹拌するとすぐに、溶液を30℃未満に冷却されると、最終的な℃にトリカイン溶液を追加100ミリグラム/ Lのoncentration 4℃で一晩撹拌しておいてください。
- E3 1.5％および0.1％アガロースの調製
- ガラスフラスコ中で定義されたE3の容量で低融点アガロース粉末を適量溶解させる。電子レンジでの混合物を加熱すると、アガロース溶液が均一に表示されるまで、残りの結晶がなくても、たまにはそれを振る。
- 1.5ミリリットルの反応管中の0.1％アガロース溶液1mlアリコートを調製する。分量は4℃で保存することができます
- コートプラスチックシャーレに1.5％の溶液を使用してください。アガロース層の厚さは、 カリフォルニアでなければなりません。 2ミリメートル。アガロースが固化した後、乾燥を防止するため、層の上にE3培地を加える。コーティングされた料理は、4℃で保存することができます
- ゼブラフィッシュの作製
- 確立されたプロトコル11,12によると28.5℃でゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）大人と胚を維持し、それらを処理します。
- 午後にはオスとメスの魚を設定し、分周器を使用して区切ります。魚の交配をタイムアウトするには、次の朝、分周器を取り外します。
- E3で満たされた皿に胚を収集し、実体顕微鏡を使用してそれらを検討する。
- 24 HPF（またはあなたの興味の発達段階）で、蛍光発現のためのゼブラフィッシュ胚を選択して、新鮮な、E3で新しい皿に肯定的なものを転送します。
- 慎重に2鋭い鉗子（ 図2D及び2E）を使用して胚をdechorionate。オープンにして引き裂き、それをやってのける絨毛膜と第二の鉗子を取得し、保持するための最初の鉗子を使用して、1の点に注意してください 。実体顕微鏡の助けを借りて、この手順を実行します。
2。多層取り付け
- FEPチューブをコーティング
- 注射器に平滑末端カニューレを取り付けます。掃除の一端に約3ミリメートルを慎重にカニューレを挿入し、一枚をカットFEPチューブ（ 図2Fおよび2G）注1：使用手袋、チューブの任意の曲げや絞りを避ける。
- 3％メチルセルロースにFEPチューブの自由端を浸して水でチューブを埋める。
- ゆっくりと注射器を押すことによって、メチルセルロースをリリース。ソリューションを捨てる。
- 繰り返しは、E3を使用して2.1.2と2.1.3ステップ注1：コーティングされたチューブはすぐにマウントするために使用される必要がある。
- アガロースにゼブラフィッシュを転送
- ヒートブロックで70℃に0.1％アガロースの1アリコートを加熱。簡単にボルテックス反応管をして38℃（ 図2H）に設定されたヒートブロックに転送。
- ヒートブロックから反応管を取り出し、それが簡単にクールダウンしましょう。再び133から200 mg / Lの渦の最終濃度（ 図2I）にトリカインを追加します。
- 絨毛膜を除去ゼブラフィッシュ胚とtransfeのいずれかを選択します。Rそのガラスパスツールピペット（ 図2Jおよび2K）を使用して、予熱した0.1％アガロースで反応チューブに注1：できるだけ追加のE3を転送してみてください。
- ゼブラフィッシュの取り付け
- 注射器に接続されたFEPチューブ（ 図2L）で胚を取る。チューブは、チューブの両端に、管の開口部の方を向いて頭を近接して配置胚を、0.1％アガロースで完全に充填する必要があります（注1）。魚を取って前にいくつかのアガロースを取るようにしてください。 注2：泡を避けるために、注射器には非常に慎重に引き抜いてください注3：。その内容（ 図2M及び2N）の漏れを回避するために、水平方向にチューブを保管してください。
- チューブを差し込む
図2。マルチレイヤの準備の前に、ケーブルドラム上のゼブラフィッシュ胚。A）フッ化エチレンプロピレン（FEP）チューブ用マウント。B）付属の平滑末端カニューレを注射器を。清掃C）AとFEPチューブをカット。24 HPFのD、E）Dechorionation溶けたのゼブラフィッシュ胚。F）平滑末端カニューレにチューブを取り付ける。G）に取り付けられたカニューレとチューブとシリンジH）0.1％の一定量のアガロース反応管内部のヒートブロックにそれを転送している間、私）ボルテックスFEPチューブ。M、N）にアガロース周辺融解したアガロース胚の、L）摂取への胚のガラスピペットを用いて、絨毛膜を除去胚のアガロース、J）の取り込み。、K）転送FEPチューブ内部のゼブラフィッシュ胚。- カニューレ（ 図-20）からチューブをカットするカミソリの刃を使用してください。
- ゆっくりとチューブ（ 図2P）をプラグインするプラスチック皿の中の1.5％アガロースの層全体を通して、魚の入ったチューブの端を貼り注1：保持して気泡の形成を避け、ストレートプラグ表面を取得しようチューブ正確に垂直アガロース面への注意2：素敵なプラグインを取得するために、わずかにチューブを回転させます。
- 乾燥を防ぐために、E3で1.5ミリリットル反応管に取り付けられた標本を保管してください。サンプルはnです画像化される準備ができOW。イメージングの前に、魚は右のプラグ（ 図2Qおよび2R）の上に座っているかどうかを確認してください。また、封入剤と同じ濃度のイメージングチャンバー内の媒体にトリカインを追加してください。
Representative Results
ゼブラフィッシュ血管系の開発の複数日イメージング
長期光シート顕微鏡用多層取り付け戦略の利点を実証するために13ゼブラフィッシュ：我々は1 DPF TG（GFP kdrl）を使用します。目的は、画像に2日間にわたって全体のゼブラフィッシュにおける血管系の開発である。ゼブラフィッシュ胚は、ポリマーコーティングされたチューブの内側メチルセルロース0.1％アガロースに取り付けた。ここでは、ゼブラフィッシュは、取り付け媒体によって限定されるものではなく、普通に開発することができます。その頭がレイズ、尾が伸び、血管発芽（ 図3）妨害されずに表示されます。
図3。ゼブラフィッシュ血管系の発達の複数日イメージング。multilaの血管系13ゼブラフィッシュは2日間にわたって光シート顕微鏡で妨害されずに開発する：リアルは1 DPF TG（GFP kdrl）に取り付け。 488nmのレーザー光シートは、蛍光を励起信号が10X/0.3 W目的とEMCCDカメラを用いて検出した。 Zスタックは10分ごとに4隣接する位置に取得し、その後、フィジー15で縫製された。時間点のサブセットの最大強度投影が示されている。スケールバー：500μmで拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
初期のゼブラフィッシュ胚のイメージング
ここでは、受精後の最初の日中の初期のゼブラフィッシュ胚発生の光シート顕微鏡用の取り付けのサポートとして、FEP管の能力を示しています。 8 HPF TG（H2A：GFP）14ゼブラフィッシュ胚はIで、E3で満たされたチューブ内の完全な絨毛膜を装着した1ミリメートルのnner径。つまり、絨毛膜のわずかなクランプになり。胚形成中にすべての発生過程を装着することにより、影響を受けず、最適にシート光顕微鏡を用いて可視化することができる。この例では、12時間（ 図4）の過程で、試料を画像化した。 1.5％アガロース中の絨毛膜なしで、伝統的なマウントを使用する場合は、このような卵黄と正中に沿った組織の肥厚の増加、伸びなどの初期胚発生時の典型的な形状の変化は、抑圧されることになる。
図4初期のゼブラフィッシュ胚発生のイメージングTG（H2A：GFP）。14ゼブラフィッシュの初期胚発生を通過する。 488nmのレーザー光シート励起GFP蛍光シグナルを検出した10X/0.3 W目的とEMCCDカメラで。 2角度からZスタック12時間にわたって3分毎に取得した。タイムラプスのサブセットの正規化された最大強度投影が示されている。全く麻酔が使用されなかったとして、取得中の胚のけいれんから19 HPF結果、可視モーションブラー。スケールバー：150μmで拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
Discussion
このような光シート顕微鏡などの高度な顕微鏡技術は、数日間にわたって高い時間·空間分解能で画像データを記録するために私達を可能にするだけでなく、改善するためのサンプル実装技術を必要とする。私たちは、ゼブラフィッシュの開発の光シート顕微鏡用多層実装の詳細なプロトコルを提示する。この方法は、実装が簡単であり、我々は日常的に私たちの研究室で使用します。
FEPチューブ
私たちの実装戦略の重要な構成要素は、ポリマーフッ化エチレンプロピレン（FEP）製のチューブである。私たちは、主に水と同様、したがって理想的に水浸漬の目的と水性媒体を必要とする試料の光シート顕微鏡に適して1.338の屈折率のFEPを使用することにしました。 0.8ミリメートル、内径0.4mmの肉厚を有するチューブは1.6mmであっに適した典型的な試料ホルダーと共に使用することができる、非常によくフィット現像ゼブラフィッシュ毛細血管提示実装方法のための私たちの最初の選択肢です。私たちは、自作のセットアップにだけでなく、商用システムカールツァイス顕微鏡による「Lightsheet Z.1」でそれらを徹底的にテストし、FEP管は、長期的な安定性を提供し、光学性能への最小限の影響を与え、非蛍光10であることがわかった。しかしながら、それらは、例えば、検体をクリアし、異なる屈折率を必要とする試料とするアプリケーションには適していない。
チューブなどのFEP製箔は直径と厚さの様々な利用可能です。また、FEPは260℃で溶融し、このように特注のサンプルの取り付けをサポートするため、事実上無限の可能性を提供していますことができます。ポリマーチューブは、洗浄プロトコルは、最良の光学的品質を確保するためのいくつかのステップを組み込んだ理由である、非滅菌供給される傾向にある。メチルセルロースによるコーティングは、成長しているゼブラフィッシュ胚のどの部分がポリマーに付着しないようにします。
0.1％アガロースのための決定は、アガロースおよびメチルセルロース10の異なる濃度での成長率と不動の広範なテストに基づいています。 0.1％以上のアガロース濃度は、すでに24のHPFゼブラフィッシュの成長率に深刻な影響を示した。さらに私たちは、麻酔薬のトリカインの低用量を使用しています。トリカインブロック活動電位、従って脳と筋肉との間の信号伝達を阻害し、筋肉の収縮を抑制する16。 133から200 mg / Lの濃度は24〜72 HPF間ゼブラフィッシュの十分な固定化を保証します。しかし、トリカイン、その他の麻酔薬は、我々は、心臓性浮腫などのショーの用量依存性の副作用をテストした。さらにトリカインの必要な投与量は、胚の発達段階に応じて変化する。したがって、我々は、画像化される発達段階に必要な量にトリカイン濃度を低下させるお勧めします。最高のperformanを確保するために、CEおよび副産物毒性の形成を防止するため、新たに調製されたか、解凍トリカイン原液は、使用される光から保護し、30℃以上に加熱されないべきである
FEPチューブ内の埋め込みにも、特定のニーズを考慮して封入剤を簡単に修正することができます。心のタイムラプスイメージングのために、我々は3％のメチルセルロースおよび100 mg / Lのトリカインの代わりに、0.1％アガロースと取付用200 mg / Lの使用をお勧めします。メチルセルロース、アガロース、従ってそれ自体で高い不動を提供し、より少ないトリカイン胚の閉じ込めを確保するために使用する必要がある0.1％よりも粘性である。
トリカインは30℃以上の温度に敏感であり、また、パフォーマンスや胚の可能性けいれんの減少につながる、イメージングチャンバー内に媒体によって希釈することができる。そのため、搭載された試料が浸漬された画像媒体でもトリカインを使用してください。あなたの実験は、それ以上の使用を必要とする場合温度は、我々は常に灌流システムを使用して、または手動つの時間点の間のチューブ及びシリンジのいずれかで撮像チャンバ内の培地を交換することをお勧めします。
重要なステップ
サンプル実装プロセス中の重要なステップは、チューブに、検体の摂取量とアガロースプラグの挿入である。摂取量は、その後に変更することが面倒である胚の初期位置を定義します。複数の標本をマウントできなければならないと取付品質は実体顕微鏡を使用して監視する必要があります。サンプルの向きが十分でない場合、これは多くの場合、胚をねじるように、検体を策定し、プランジャーのその後の動きを回避する速度を変化させることは役立つことがあります。 1.5％アガロースプラグを、0.1％アガロースの漏れを回避する必要がある。管内のプラグの表面には、開発中のサンプルの方向に影響を与えないように平らにしてください。良いサーフィンを達成するためにエース、アガロース層の異なる厚さを試験する必要があり、チューブは、表面に垂直アガロースに入れることが必要である。チューブを少し回転させて、チューブを抜くことは慎重に皿からプラグを解放します。取り付けの質は、イメージングの前に実体顕微鏡でチェックする必要があります。
マルチビュー画像
シート光顕微鏡の1つの主な利点は、多眼画像処理、試料を回転させ、複数の角度からZスタックを取得し、登録し、その後、それらを融合する機能です。 3D空間でZスタックを登録する確立された方法は、受託者のマーカー17などの試料の周囲の蛍光ビーズを使用したビーズベースの登録である。しかしながら、この方法は、このような1.5％アガロース等の固体封入剤に依存しているので、ここで紹介する多層実装と互換性がないように思われる。しかし、いくつかの代替ソリューションは、アプリケーションに応じて動作する。まず、蛍光ビーズは、缶取得中に視野内にある必要があり、アガロースプラグに組み込むこと。第二に、ステージ位置は、蛍光ビーズで1.5％アガロースカラムを用いて、実際の実験の前に較正することができる。第三に、このような蛍光核のような代替のマーカーは、互いに対してのzスタックの位置を同定することができる。
蒸発
典型的な光シート顕微鏡のセットアップは避けられないが、媒体の蒸発につながるオープンな試料室を使用しています。媒体は、封入剤の蒸発を制限するために、試料の生存、および光学系と試料との間の正確な屈折率のために必須であるので、蒸発を防ぐために、以下の対策の一つまたは複数をとることをお勧めします。まず、チャンバー内の媒体は、常に灌流システムによって交換することができる。第二に、媒体を手動で再充填することができる。第三に、チャンバ蓋又は可撓性ホイルで覆うことができる。
ポリマーFEPは、化学的に不活性ガスへの非透過な化学物質の多種多様に耐えるように開発されたため、堅牢でました。多層実装酸素のみの場合アガロースプラグおよびアガロース - 空気界面を貫通するが、ポリマー管を支持することなく、1.5％アガロースで実装と比較した場合の多層実装の酸素供給が激しく低い場合には、図示されないままでできる。ゼブラフィッシュ形態は、多層実装が影響を受ける前に、しかし、1.5％アガロースに取り付けのみ約2時間使用することができ、長期的なイメージングのための優れた全体的な解決策になると思われる。
開発の初期段階を画像化
多層実装は現在、ゼブラフィッシュより古い24 HPFのタイムラプス光シート顕微鏡のための私達の標準的な埋め込み技術となっている。それに加えて、我々はまた、初期の段階の胚のイメージングのために、ポリマーのチューブを使用しています。 Embryosは、それらの絨毛膜中に残存し、1mmの内径FEPチューブに取り付けられ、E3が充填されている。ゼブラフィッシュは、自由に絨毛膜の内部で開発することができますし、まだよくシート光顕微鏡を用いて画像化することができる。
見通し
提示された多層サンプル実装は、ゼブラフィッシュとのリアルタイム発生生物学のためのシート光顕微鏡の可能性を最大限に解き放つ。これは、簡単にこのような光投影トモグラフィ（OPT）および他の生物のような他の顕微鏡技術を採用することができる。私たちは、標準サイズのFEPチューブは、特定のニーズに合わせたサンプル実装技術に向けた単なる最初のステップであると考えています。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
当社は、資金調達とサポートのためのマックスプランク協会、ヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム（HFSP）とベーリンガーインゲルハイムフォンに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes | Bola | S 1815-04 | 0.8/1.6 mm inner/outer diameter, other sizes available |
| Omnifix-F Solo 1 ml Syringe | B. Braun Melsungen AG | 9161406 V | |
| Sterican Single-Use Cannula, blunt | B. Braun Melsungen AG | 9180109 | 0.8 mm x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube |
| 50 ml Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 1 M NaOH | |||
| 0.5 M NaOH | |||
| 70% EtOH | |||
| Methylcellulose | Sigma | M0387 | supplied as powder |
| E3 medium (for zebrafish embryos) | |||
| 1.5 ml Reaction Tube | Eppendorf | 3810X | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414 | supplied as powder |
| Petri Dish | Greiner | 633180 | plastic, 94 mm x 16 mm |
| Tricaine | Sigma | E10521 | synonyms: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate |
| 10X/0.3 W Microscope Objective Lens | Leica | HCX APO L | |
| EMCCD Camera | Andor Technology | iXon 885 EMCCD |
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