Summary
النيسرية السحائية هو الممرض الذي يصيب الإنسان محددة الأوعية الدموية. في هذا البروتوكول يتم تقديمها microvessels الإنسان في الماوس عن طريق تطعيم الجلد البشري على الفئران المناعة. البكتيريا الالتزام على نطاق واسع في الأوعية الإنسان، مما يؤدي إلى تلف الأوعية الدموية وتطوير الطفح الفرفري احظ عادة في الحالات البشرية.
Abstract
النيسرية السحائية يسبب شديدة، وتعفن الدم قاتلة في كثير من الأحيان عندما يدخل مجرى دم الإنسان. العدوى يؤدي إلى أضرار واسعة النطاق في الأوعية الدموية مما يؤدي إلى تسرب الأوعية الدموية، وتطوير طفح فرفرية ونخر الأنسجة في نهاية المطاف. دراسة التسبب في هذا المرض كان محدودا من قبل خصوصية الإنسان من البكتيريا، الأمر الذي يجعل من الصعب في النماذج الحية. في هذا البروتوكول، ونحن تصف نموذجا أنسنة لهذا المرض الذي جلد الإنسان، التي تحتوي على microvessels الجلدي، وتطعم الفئران المناعة. هذه السفن يفاغر مع تداول الماوس مع الحفاظ على خصائص الإنسان. مرة واحدة أدخلت هذا النموذج، N. السحائية الالتزام حصرا لسفن الإنسان، مما أدى إلى تلف الأوعية الدموية واسعة، والتهاب في بعض الحالات تطور الطفح الفرفري. يصف هذا البروتوكول الخطوات التطعيم، والعدوى وتقييم هذا النموذج في كونتيXT من N. الإصابة السحائية. ويمكن تطبيق هذه التقنية في العديد من مسببات الأمراض التي تصيب الإنسان محددة مجرى الدم.
Introduction
الإنتان هو عدوى المكورات السحائية الدم ولد قاتلة في كثير من الأحيان الناجمة عن مسببات الأمراض البكتيرية التهاب السحايا النيسيري. مرضى الإنتان المكورات السحائية غالبا ما تكون موجودة مع طفح دموية صغيرة أو برفريا على الجلد الذي سبق المرتبطة تدمير الأوعية الدموية التي تسببها البكتيريا المنتشرة والمنتجات البكتيرية 1. خزعات الجلد من المرضى السريرية تظهر البكتيريا المرتبطة microvessels، وغالبا ما يملأ الأوعية 2. وبصرف النظر عن تسرب البكتيريا والجلطة واسعة النطاق، تجلط الدم، واحتقان الأوعية الدموية وينظر في المناطق الفرفري 3-5. هذا تلف الأوعية الدموية يمكن أن يؤدي إلى نخر واسعة من الجلد والأنسجة المحيطة بها، مما أدى إلى بتر التنضير وحتى في الناجين السحائية. فهم كيف يسبب عدوى هذا الضرر الأوعية الدموية مهم لتحسين استراتيجيات الوقاية والعلاج. وقد أجريت غالبية الأبحاث على الإنتان المكورات السحائية في المختبر علىخطوط الخلايا البشرية نظرا لخصوصية الإنسان من N. السحائية. وقد تم دراسة العديد من الجوانب العدوى في المختبر بما في ذلك التصاق البكتيريا، استجابة الخلية المضيفة، وكذلك استجابة خلوى 6-9. النوع الرابع الشعرة (TFP) قد تورطت كما عضية التصاق الرئيسية للN. السحائية على كل من الخلايا الظهارية والبطانية 10. وقد تبين أيضا أن التصاق N. السحائية إلى الخلايا المضيفة هو إجهاد القص تعتمد وبالتالي يعتقد أن لهما صلة معدلات تدفق الدم في الأوعية الدموية الدقيقة 11. هذا يشير إلى الضغوط الحيوية مواجهة البكتيريا في الجسم الحي تعتبر حاسمة بالنسبة لإمراض. غير أنه من الصعب جدا لنموذج المكروية من السفن الصغيرة في المختبر.
مستقبلات الالتصاق لالنيسيري البرلمان الاتحادي الانتقالي لا يزال مجهولا، وبالتالي الضربة القاضية في الاستراتيجيات الرامية إلى تحقيق التصاق البكتيريا في نموذج حيواني لا يمكن تصور في هذا الوقت. واقترح أن تكون CD46 تم إنتاج مستقبلات TFP والحيوانات المعدلة وراثيا لتكون بمثابة نماذج الماوس. ومع ذلك، لا تؤدي العدوى في هذه الحيوانات للإصابة واسعة أو طفح 12،13 التنمية. النماذج الحيوانية الأخرى التي تم وصفها من الناحية تجرثم الدم من العدوى النيسرية تأخذ في الاعتبار تفضيل البكتيرية لترانسفيرين الإنسان كمصدر للحديد 14،15. إما المكمل ترانسفيرين الإنسان أو التعبير عن ذلك من نتائج التحوير في زيادة الحمولة الجرثومية في مجرى الدم على مدى فترة زمنية طويلة، ولكن هذا النموذج لا يظهر التصاق البكتيريا أو تطوير طفح 16،17.
في هذا البروتوكول، ونحن تصف نموذج الفأر أنسنة التي يتم فيها زرع جلد الإنسان، بما في ذلك الأوعية الدموية الدقيقة الجلدي، على الفئران المناعة 18،19. هذه النتائج في الأوعية الإنسان وظيفية، مع perfused تداول الماوس. جنبا إلى جنب مع مكملات ترانسفيرين الإنسان، وهذا محسابات مركز Odel لاثنين على الأقل من جوانب محددة من الإنسان N. السحائية، أي البطانة الإنسان وترانسفيرين الإنسان، في بيئة الجسم الحي. N. قدم السحائية عن طريق الوريد في هذا النموذج الالتزام على وجه التحديد إلى البطانة الإنسان، مما ينتج عنه أمراض مشابهة لما ورد في المرضى السريرية، بما في ذلك الضرر الأوعية الدموية والتنمية طفح الفرفري 18.
Protocol
1. المخاطر وضوابط
- يجب جان الأخلاقيات المحلية توافق على جميع البروتوكولات الحيوان. أجري هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها الأنظمة الفرنسية والأوروبية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (Décrets 87-848، 2001-464، 2001-486 2001-131 وو التوجيه الأوروبي 2010/63/UE) والتي وافقت عليها اللجنة الأخلاقية المحلية Comité كوت ديفوار Ethique أون matière التجريب ANIMALE، جامعة باريس ديكارت، باريس، فرنسا. لا: CEEA34.GD.002.11.
- للحصول على بشرة الإنسان، تم الحصول على موافقة خطية المريض على علم وأجريت كافة الإجراءات وفقا لمبادئ توجيهية وطنية الفرنسية والتي وافقت عليها اللجنة المحلية الأخلاقية، لجنة التقييم كوت Ethique DE L'INSERM IRB 00003888 00005881 النفاذ اللاسلكي الثابت، باريس، فرنسا الرأي: 11-048 .
- N. السحائية هو الممرض الإنسان يمكن أن تكون ضارة ويجب أن تؤخذ جميع الاحتياطات اللازمة عند التعامل مع ورشnism. وتشمل هذه الاحتياطات التطعيم والتي تعمل تحت مستوى السلامة الأحيائية 2 الظروف.
2. الجلد الكسب غير المشروع
- جمع جلد الإنسان أقرب إلى تطعيم وقت ممكن. غالبية الجلد في هذا العمل يأتي من عمليات الجراحة التجميلية التي تنطوي على منطقة البطن. وقد استخدمت مصادر أخرى مثل سرطان الثدي والساق وحتى وجه مع النجاح.
- تحضير العينة جلد الإنسان عن طريق تنظيف سطح الجلد مع 70٪ ETOH والكذب انها مسطحة على سطح تنظيفها جيدا، ويفضل تحت غطاء تدفق.
- شريحة 200-400 ميكرون شرائح من الجزء العلوي من الجلد باستخدام جلدي بسماكة محددة مسبقا.
- تحقق شرائح الجلد لسلامة وقطع منها إلى 2 سم × 2 سم مربعات، ثم وضع في برنامج تلفزيوني (دون الكاتيونات ثنائي التكافؤ) إذا التطعيم فورا أو في 4 درجات مئوية في DMEM مع المصل 10٪ للتخزين على المدى القصير (3-12 ساعة ).
- تخدير الفئران SCID.bg 6-8 الاسبوع القديمة (حوالي 20 غراما) مع الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) injeالمديرية التنفيذية للملكية الفكرية
- مرة واحدة يتم مخدرة الفئران، تحقق من وجود استجابة الألم عن طريق إجراء قرصة أخمص القدمين، وهي طريقة قياسية لإنشاء الألم المنعكس. تطبيق هلام للعيون لمنع جفاف قرنية العين وحلق الجانب الأيسر للحيوان وراء الكتف، حيث سيتم وضع الكسب غير المشروع. إبقاء الحارة الماوس على وسادة الحرارة في جميع أنحاء الداخلي.
- بعد الإستعداد الماوس لإجراء عملية جراحية، وتنظيف منطقة حلق مع 70٪ ETOH.
- تطبيق مخدر موضعي موضعيا على موقع الكسب غير المشروع (Tronothane) وإعداد موقع الكسب غير المشروع عن طريق إزالة بعناية الطبقة السطحية من الجلد الماوس مع زوج من مقص منحني. يجب الحرص على عدم تعطيل الأوعية الدموية الكامنة.
- إزالة الجلد في منطقة أصغر قليلا من مساحة شريحة جلد الإنسان.
- إزالة شريحة من الجلد PBS (أو DMEM) ووضع على السرير الكسب غير المشروع، وضمان تواجه الجانب البشرة المباراة. الخطوات 2،8-2،10 يجب أن يتم تنفيذ في أسرع وقت ممكن، وضمان السرير الكسب غير المشروع لا تجف.
- محاذاة زاوية واحدةأو حافة والإصلاح مع الغراء الأنسجة. تناسب بعناية بقية شريحة الجلد إلى السرير الكسب غير المشروع، ووضع كميات صغيرة من الغراء الأنسجة حول حواف. تقليم جلد الإنسان دائما إلى حجم بدلا من جعل السرير الكسب غير المشروع أكبر.
- لا سحب الجلد ضيقة جدا على السرير الكسب غير المشروع كما الجلد الماوس مرنة جدا.
- تأكد يتم إصلاح الكسب غير المشروع مع الغراء الأنسجة في كل زاوية.
- تنظيف المنطقة بمحلول اليود.
- تطبيق إسعافات أولية مع المنطقة وسادة على الكسب غير المشروع. تأكد من إسعافات أولية ثابتة ولكن ليس ضيق، وأنه لا يتأثر التنفس الحيوان.
- إصلاح إسعافات أولية مع الشريط خلع الملابس.
- السماح للحيوان لاسترداد على سطح دافئ.
- مرة واحدة مستيقظا، والعودة الحيوان إلى قفصه. ويعيش في قفص الحيوانات 2-3.
- تحقق الفئران بانتظام خلال الانتعاش لعلامات الألم أو الضيق. بعد 10-14 يوما التطعيم، وإزالة إسعافات أولية، والحرص على عدم تعطيل الكسب غير المشروع. في تجربتنا الألم بعد العمل الجراحي هو مصغرةسوء. ومع ذلك ينبغي رصد الحيوانات كل يوم وخاصة في الأيام القليلة بعد العملية. معايير الألم أو الضيق هي التالية.
- فقدان الوزن أكثر من 10٪
- المظهر المادي، والفراء، وموقف الحدباء والعينين
- زيادة التنفس أو القلب معدلات
- انخفضت الحركات أو غير عادية.
- الارتفاع في درجة حرارة الجسم
- يدار في حال تم الكشف عن علامات الألم paracetamole شفويا (300 ملغ / كغ، كل ساعة 4). يتم التقيد الصارم النهاية إنسانية إذا استمر الألم.
- إذا يبدو الكسب غير المشروع الجافة تطبيق زيت الأطفال كل 2-3 أيام للحفاظ على ليونة الجلد.
- الكسب غير المشروع جاهز للتجريب 21 أيام آخر الكسب غير المشروع.
3. عدوى
- قبل يوم من العدوى، وإعداد السلالة البكتيرية التي كتبها streaking على لوحات أجار GCB بالمضادات الحيوية المناسبة. تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
- إعداد البكتيريا
- احتضان حين تهتز لمدة 2 ساعة في حاضنة (37 درجة مئوية في 5٪ CO 2) مع غطاء فضفاض، وحتى كثافة البكتيرية حوالي 600 OD 0.1.
- أجهزة الطرد المركزي البكتيريا لمدة 3 دقائق 15،000 دورة في الدقيقة.
- إزالة طاف و resuspend في برنامج تلفزيوني، ثم الطرد المركزي مرة أخرى.
- كرر الخطوة غسل (2.2.4-2.2.5) مرتين.
- بيليه resuspend البكتيرية في برنامج تلفزيوني.
- قياس OD 600.
- جعل ثقافة إما OD 600 0.1 (10 8 كفو / مل)، أو OD 600 1.0 (10 9 كفو / مل). من هذا التركيز المعروف، وتمييع ل10 7 كفو / مل. محاولة إعداد البكتيريا أقرب إلى الوقت حقن ممكن.
- وزن الفئران.
- تخدير الفئران مع الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) حقن الملكية الفكرية
- مرة واحدة نائما، جهيك أن استجابة الألم غائب من قبل إصبع القدم قرصة، والحفاظ على الفئران الدافئ مع وسادة الحرارة، ووضع مرهم العين على لمنع جفاف.
- إعطاء كل الماوس 8 ملغ من ترانسفيرين الإنسان، معلق في المياه المالحة أو برنامج تلفزيوني، حقن الملكية الفكرية
- تأخذ قطرة صغيرة من الدم من الذيل وتنتشر على لوحة أجار للتحقق الدم معقمة قبل العدوى.
- ضخ 100 ميكرولتر 10 7 كفو / مل ثقافة البكتيرية (10 6 كفو الكل) في الوريد عن طريق الوريد الرجعية المدارية أو الذيل. قياسات كفو أخذ 5 دقائق حقن آخر متسقة بغض النظر عن موقع الحقن.
- بعد بضع دقائق، قص ذيل ونشر عينة من الدم على لوحات أجار مع المضادات الحيوية المناسبة مع واحد التخفيف 10 أضعاف لإنشاء كفو الدم بعد الإصابة فورا.
- ختم الذيل مع الغراء الأنسجة.
- بعد الحقن، ويخفف من اللقاح البكتيري وتنتشر على لوحات أجار مع المضادات الحيوية المناسبة لإقامة كفو.
- السماح للفئرانلاسترداد على وسادة الحرارة حتى أنها تصل وتتحرك
- في 6 ساعة العدوى آخر رسم كمية صغيرة من الدم من الذيل، وتمييع لوحة لإنشاء كفو في 6 ساعة.
- احتضان جميع لوحات أجار عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 بين عشية وضحاها.
4. تضحية
- في ذلك الوقت اختار من العدوى، وتخدير الفئران مع الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) حقن الملكية الفكرية
- مرة واحدة نائما، والحفاظ على الحارة الماوس مع لوحة الحرارة.
- عندما منعكس الألم قد ذهب (قرصة أخمص القدمين)، قص نهاية الذيل وسحب الدم.
- انتشر الدم على لوحات أجار مع المضادات الحيوية المناسبة؛ 5 ميكرولتر المباشر و 10 ميكرولتر تخفيف 1:10 لإنشاء كفو.
- التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
- بعد التضحية الماوس وفقا لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والأخلاقية ذات الصلة، تؤكد وفاة بسبب نقص ضربات القلب. جعل شق خط الوسط، وقطع من خلال القفص الصدري، وإجراء شق في سماعر.
- جمع أكبر قدر ممكن من الدم من القلب / تجويف الصدر ومكان في أنبوب العقيمة.
- إزالة الأجهزة (مثل الكبد والطحال والدماغ) في لوحة العقيمة.
- إزالة الجلد الكسب غير المشروع وقسم من الجلد الماوس في لوحة العقيمة.
- التخلص من جسم الفأر.
- بعد أن تم السماح للتجلط الدم التي تم جمعها لمدة 15 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي لذلك 15 دقيقة في 3،000 دورة في الدقيقة.
- إزالة البلازما من الدم وتخزينها في -80 درجة مئوية لتحليلها لاحقا، على سبيل المثال للكشف خلوى بالطرق ELISA أو نظام مراقبة الأصول الميدانية القائمة.
5. التهم الجهاز كفو
- تزن المجانسة أنابيب تحتوي على 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل كل أخذ عينات الخزعة.
- يستغرق 4 مم خزعة عينات من كل الأنسجة باستخدام خزعة لكمة العقيمة.
- المكان الخزعات في أنابيب المجانسة preweighed تحتوي على 500 ميكرولتر PBS. التجانس عينات الجلد مع 2 مم الخرز، واستخدام الخرز أصغر لأجهزة أخرى.
- وضع ر المتبقية(انظر أدناه) قضايا في 4٪ لامتصاص العرق (PFA) وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة المجهري.
- تزن المجانسة أنابيب تحتوي على الخزعات لإقامة الوزن خزعة (لحساب وقت لاحق من كفو / الأنسجة ملغ).
- التجانس العينات.
- التجانس الكبد والطحال والمخ، في 6،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
- التجانس عينات الجلد في 6،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية وكرر إذا لزم الأمر.
- نشر التخفيفات من كل أنبوب المجانسة على لوحات أجار وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لإنشاء هيئة التهم كفو.
6. الأنسجة / المناعية
- تثبيت
- إصلاح الأنسجة في PFA 4٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. قد تكون الخطوة تثبيت أطول، وإذا تخزين لفترات أطول وضع الأنسجة في 0.25٪ PFA.
- شطف الأنسجة في برنامج تلفزيوني ثم وضع في 20٪ محلول السكروز والعودة إلى 4 درجات مئوية خلال الليل أو حتى غرقت الأنسجة في الحل.
- غسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني، الى تقليص الحجم والمكان في حل أكتوبر (إما في قالب الأنسجة أو انضمت إلى لوحة القاعدة).
- تجميد الأنسجة بسرعة على طبق بيتري العائمة في النيتروجين السائل.
- بعد تجميد، ووضع الأنسجة على الثلج الجاف قبل نقلها إلى -80 درجة مئوية لمدة التخزين.
- تشريح
- إزالة الأنسجة من -80 ° C، والسماح لتتوازن إلى -20 درجة مئوية في ناظم البرد.
- الأنسجة شريحة بسمك حوالي 10-15 ميكرومتر، ومكان على الشرائح المجهر المغلفة.
- مخزن الشرائح في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
- تلطيخ
- تسمح الشرائح أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة.
- رسم حول شريحة على الشريحة بالقلم مسعور. الانتظار 5-10 دقيقة.
- ترطيب / شريحة يغسل في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، كرر مرتين.
- Permeabilize شريحة في 0.1٪ تريتون في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- يغسل في برنامج تلفزيوني 2-3X لمدة 5 دقائق.
- كتلة في برنامج تلفزيوني0.1٪ تريتون 1٪ BSA لمدة تتراوح بين 10-60 دقيقة اعتمادا على الأجسام المضادة أو وصمة عار لاستخدامها.
- إزالة عازلة تمنع وإضافة الأجسام المضادة الأولية مخففة كما هو مطلوب في كتلة عازلة. احتضان لمدة زمنية محددة. (في كثير من الأحيان 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية).
- يغسل في برنامج تلفزيوني 2-3X لمدة 5 دقائق.
- تطبيق الضد الثانوية مخففة حسب الاقتضاء في المخزن بوك؛ عادة يتم تضمين دابي في هذه الخطوة. احتضان لمدة زمنية محددة، وغالبا 1-2 درجة حرارة الغرفة ساعة، في الظلام.
- يغسل في برنامج تلفزيوني 2-3X لمدة 5 دقائق.
- جبل في وسائل الإعلام تتلاشى حماية تصاعد مع غطاء زجاجي وختم مع طلاء الأظافر.
- الصورة الشرائح ملطخة فورا أو تخزينها في 4 درجة مئوية.
- أداء التصوير مع المجهري متحد البؤر أو الفلورسنت تقام مع المرشحات / الليزر المناسبة لfluorophores المستخدمة.
- الأنسجة
- تسمح الشرائح لاستخدامها في الأنسجة أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة.
- وصمة عار الشرائح باستخدام كماtandard الهيماتوكسيلين / يوزين بروتوكول تلطيخ.
- وضع الشرائح في رف الشريحة.
- نقل رف مع الشرائح بين الحلول بالترتيب التالي:
- 2 ثانية الى تشغيل ماء الصنبور.
- 3 دقيقة في حل الهيماتوكسيلين تصفيتها.
- 10 ثانية في المياه الجارية.
- 10 ثانية في الماء المقطر.
- 10 ثانية في الإيثانول بنسبة 100٪.
- 2 ثانية إلى يوزين تصفيتها.
- 10 ثانية في المياه الجارية.
- 10 ثانية في الإيثانول بنسبة 100٪
- 2 دقيقة في الزيلين × 3 (حمام I، II، III).
- ونقل على الفور وإضافة بضع قطرات من تثبيت الغراء على كل الشرائح، ومكان زلة تغطية على القمة، وإزالة فقاعات الهواء، والسماح الجافة لبضع ساعات.
- الصورة الشرائح تحت المجهر الضوء الأبيض القياسية.
Representative Results
التهم كفو
وN. سلالة السحائية المستخدمة في هذه النتائج هو ممثل N. السحائية 8013 استنساخ 12، وعزل السريرية المصلية C، معربا عن فئة I SB بايلين، أوبا -، بمسانده -، PilC1 + / + 20 PilC2. وقد تم تصميم سلالة للتعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) من الإدراج الكروموسومات 18. يتم تأسيس مستعمرة بكتيرية تشكيل التهم حدة عن طريق حساب عدد من المستعمرات على لوحات أجار وحساب إما كفو / مل من الدم أو كفو / ملغ من الأنسجة من وحدات التخزين المعروفة مطلي. وأظهرت التهم الدم الذي 5 دقائق بعد الحقن الرابع من 10 6 البكتيريا كفو كان هناك في المتوسط 1.5 × 10 5 كفو / مل في الدم (الشكل 1A). بعد 6 ساعة متوسط التهم 4.8 × 10 4 كفو / مل. قبل 24 ساعة كان متوسط تعداد 2.4 × 10 4 كفو / مل ولكن في هذه المجموعة من الفئران 10، 5 زيارتهالا يمكن كشفها تعميم البكتيريا بينما كان غيرها من التهم 5 مرتفعة نسبيا (الشكل 1A). التهم كفو المأخوذة من عينات الجلد تظهر غالبية من الفئران وجود تهمة كبيرة في الجلد البشري، حيث بلغ متوسطها 2.1 × 10 4 كفو / ملغ من الأنسجة في 6 ساعة و 4.4 × 10 2 كفو / ملغ من الأنسجة في 24 ساعة (الشكل 1B) . أظهرت عينات الجلد الماوس المقابل لم بكتيريا في 24 ساعة فقط وعدد قليل جدا في 6 ساعة، مما يدل على تفضيل قوي لN. السحائية في الأوعية الإنسان في الجلد المطعمة (الشكل 1B). بشكل عام كانت منخفضة جدا بكتيريا لnondetectable في الأجهزة الأخرى على الرغم من عينات الحيوانات 2 لم تظهر التهم التي يمكن أن تعزى إلى تلوث من الدم، كما أنها ترتبط مع ارتفاع تعميم أرقام البكتيرية (الشكل 1C). يمكن أن تستخدم أيضا نموذج لتحديد دور العوامل الفوعة في الجسم الحي، على سبيل المثال نوع IV بيلى. أدخلت سلالات بكتيرية مع طفرات في الجينات المحددة pilD 21، مما أدى إلى سلالة تفتقر إلى البرلمان الاتحادي الانتقالي، وكذلك الجين pilC1 8، تفتقر إلى البرلمان الاتحادي الانتقالي 'adhesin' المقترحة في النموذج. أدت هذه الطفرات في أي التصاق البكتيريا في الكسب غير المشروع جلد الإنسان، مؤكدا على الدور الحاسم TFP يلعب في التصاق في الجسم الحي (الشكل 1D).
المناعية / علم الأنسجة
في هذه التجارب كنا N. سلالات السحائية التي تعبر عن البروتين مضان الخضراء (GFP) لتمكين الكشف الفلورسنت دون الحاجة لتلطيخ الثانوية. كانت ملطخة الأوعية الإنسان باستخدام علامة للحصول على البطانة الإنسان، إما CD31 (PECAM-1) أو كتين الجولق الأوروبي راصة (UEA) 18،22. كان مترافق في جامعة إيست أنجليا لرودامين السماح خطوة واحدة تلطيخ (أرقام 2A-C). نواة الخلية يمكن وصمة عارإد مع دابي للمساعدة في تحديد هياكل الأنسجة (أرقام 2A-B). تم إجراء الأنسجة باستخدام معيار الهيماتوكسيلين / يوزين تلطيخ. كانت الحدود البشرة / الجلد من الجلد يمكن التعرف عليها بوضوح. وتركزت التهاب، تخثر الأوعية الدموية وتسرب للسفن على مقربة من هذا الحدود 24 ساعة بعد الإصابة (الشكل 2D). كان تجلط الدم واضحة في العديد من الأوعية الجلدية الصغيرة، وغالبا ما يرافقه احتقان والالتهابات. يمكن أن ينظر تسرب خلايا الدم الحمراء إلى الأنسجة خارج، مما يدل على أن مستوى الضرر واسعة من السفينة. التشريح المرضي من الجلد في الفئران المطعمة غير مصاب ظهرت طبيعية مع عدم وجود التهاب مميزة 18. في حوالي 30٪ من الإصابات التصاق البكتيريا في الجلد يؤدي إلى تطوير فرفرية كشف ظاهريا (أرقام 2E و2F).
"5IN" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg" سرك = "/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg" />
الشكل 1. كفو التهم. (A) التهم البكتيرية كفو لكل مليلتر من الدم في 5 دقائق، 6 ساعة، و 24 إصابة آخر ساعة. (B) البكتيرية كفو يهم من عينات الجلد مقارنة الجلد البشري (HS) والجلد الماوس (MS) في كلا 6 ساعة و 24 إصابة آخر ساعة. (C) البكتيرية كفو التهم من الأجهزة الأخرى المتخذة 24 إصابة آخر ساعة. (D) وبمقارنة تعداد كفو البكتيرية من عينات الجلد البشري والفأر التي اتخذت في إصابة 24 آخر ساعة من الفئران المصابة مع نوع N. البرية السحائية 2C43 صمة عار (WT)، سلالة مع طفرة في الجين pilD (pilD) أو سلالة مع طفرة في الجين pilC1 (pilC1). وتظهر جميع الرسوم البيانية كبيانات أولية مع الوسيط. تم تعديل الرقم من Melican وآخرون 18"_blank"> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. المجهر. (A) الإسقاط من كومة متحد البؤر يظهر microvessel الإنسان ملطخة UEA كتين (الحمراء) على مقربة من الجلد (د) البشرة (ه) الحدود. إصابة السفينة مع N. السحائية (الأخضر) 2 عدوى آخر ساعة. (ب) شريحة البصرية وإسقاط شريحة (C) تظهر N. microcolonies السحائية (الأخضر) إصابة سفينة الإنسان (جامعة إيست أنجليا - أحمر) ضمن عدوى الجلد الكسب غير المشروع 2 ساعة آخر. (D) Haematoxylin / يوزين تلطيخ من الكسب غير المشروع الجلد البشري المصابة لمدة 24 ساعة مع N. السحائية. على البشرة (ه)، عن طريق الجلد (د) الحدود بشكل واضح تجلط الدم مرئية واسعة واحتقان microvessإلس (الأسهم) وينظر في الأدمة. ويمكن أيضا تحديد التهاب الأوعية الدموية وبعض تسرب (رأس السهم). (E) الكسب غير المشروع جلد الإنسان قبل العدوى. (F) نفس الكسب غير المشروع الجلد مثل (E) 24 إصابة آخر ساعة مع N. السحائية تظهر المناطق الفرفري (السهام). أرقام 2B، يتم تعديل 2D، 2E، و2F من Melican وآخرون 18 اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Discussion
النماذج الحيوانية هي ذات أهمية حاسمة لبحث المرضية البكتيرية. فمن المستحيل أن تحاكي تماما البيئة في الجسم الحي في خلية ثقافة وبات من الواضح أن التفاعل المضيف الممرض يتأثر العديد من العوامل الديناميكية. خصوصية الإنسان من بعض مسببات الأمراض الهامة سريريا، مثل N. السحائية، فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد C، المتصورة المنجلية، المستوحدة الليستيريا، والسالمونيلا التيفية ويقتصر استخدام في الجسم الحي نماذج لهذه الالتهابات. لكن، وكما أن نبدأ في فهم الخطوات التي تشارك المعدية في خصوصية، ويجري حاليا وضع نماذج أنسنة. بروتوكول الموصوفة هنا هو دليل على هذا مع الأخذ microvessels الإنسان في الفئران، مما يسمح للعدوى واسعة في الجسم الحي مع N. السحائية، مما أدى إلى تلف الأوعية الدموية وأحيانا تطور الطفح الجلدي الفرفري.
باستخدام هذا النموذج،كنا قادرين على تحديد أن خصائص لاصقة من البرلمان الاتحادي الانتقالي يشاركون في الاستعمار الأوعية الدموية في الجسم الحي باستخدام المسوخ البكتيرية والتي يتم تقليل تلف الأوعية الدموية في غياب التصاق 18. سابقا، قد تورطت تعميم المنتجات البكتيرية في هذا الضرر ولكن تشير نتائجنا دورا حاسما للالتصاق المحلية والاستعمار الأوعية الدموية. هذا يفتح آفاقا جديدة لتطوير أهداف العلاج الرواية. إذا يمكن أن يكون قد تم حظره من التصاق البكتيريا المسببة للأمراض صيدلي يمكن أن ربما منع تطور آفات الجلد وتؤدي إلى نتائج أفضل للناجين من المكورات السحائية من حيث نخر الأنسجة، التنضير وبتر الأطراف. وقد أظهرت أعمال أيضا تعقيد العدوى وإشراك الاستجابة المناعية والتخثر تتالي. حددنا إشارات خلوى الإنسان في مصل الفئران المصابة على الرغم من كمية صغيرة نسبيا من البطانة الإنسان الحاضر 18.وأشارت هذه استجابة كبيرة خلوى، جنبا إلى جنب مع تسلل الفأر السكان الخلايا المناعية في المنطقة.
يمكن أن النماذج الحيوانية بالطبع أبدا تكرار بالكامل الأمراض التي تصيب البشر وحصل كل النتائج منها يجب النظر مع هذا في الاعتبار. على سبيل المثال، في هذا النموذج الدم والخلايا المنتشرة هي من أصل الماوس ونحن لا نستبعد أنها قد تتصرف بشكل مختلف للخلايا البشرية. ميزة هذا ومع ذلك، كما هو موضح في منشور صدر مؤخرا لدينا 18، هو القدرة على التفريق إشارة تنشأ من البطانة الإنسان من أن من خلايا فأر المنتشرة. ان الخلفية المناعة من الفئران المستخدمة في هذا النموذج يسمح أيضا لنقل خيفي من السكان الخلايا المناعية البشرية، إضافة 'أنسنة' جانب آخر. لكن الخلفية المناعة من الفئران قد تخفي دور للNK، T أو B الخلايا، التي تفتقر إلى كل أو خلل في هذا النموذج. والشور نسبيار زمني (24 ساعة) المستخدمة في هذا النموذج تتعلق أساسا استجابة فطرية، ولكن لالتهابات على المدى الطويل، ووضع حصانة الخيارات الأخرى قد تحتاج إلى من يكتشفها.
الجلد هو موقع الإصابة المهم بالنسبة N. السحائية ولكن وجود كمية صغيرة نسبيا من السفن الإنسان يعني أيضا أن استقراء البيانات إلى العدوى النظامية التي تنطوي على العديد من الأجهزة أمر صعب. في حين أن هذا النموذج يسمح لدراسة التنمية الآفة الجلدية، ليست مدرجة الخطوات الهامة للعدوى المكورات السحائية مثل الظهارية والدم في الدماغ المعبر. هناك حاجة إلى مواصلة تطوير هذه النماذج أنسنة لمعالجة هذه الجوانب الأخرى من العدوى. ومع ذلك يقدم هذا النموذج إمكانات كبيرة للعديد من مسببات الأمراض المحددة الإنسان، لا سيما تلك التي تستهدف الأوعية الدموية.
Disclosures
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء المختبر Dumenil، ولا سيما سيلك سيلفا لقراءة نقدية للمخطوطة. قسم الجراحة في مستشفى Hôpital EUROPEEN جورج بومبيدو-(HEGP)، والدكتور ديفيد Maladry. مايكل Hivelin والدكتور باتريك Bruneval، قسم علم الأمراض في HEGP. مرفق الحيوانية في PARCC، برئاسة إليزابيث HUC. وأيد هذا العمل من قبل وكالات منحة التالي: ماري كوري الزمالة منتدى الطاقة الدولي لا. 273223 (KM)، ATIP-أفينير منحة من INSERM، المعدات CODDIM منحة (إيل دو فرانس المنطقة)، FRM (مؤسسة بحوث صب لا MEDICALE) منحة المعدات، مختبر IBEID التميز الكونسورتيوم ANR (الوكالة الوطنية صب لا بحوث) منحة " الخلل في والتدفق ". كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
| Ketamine 500 | Virbac France | lot no. VAL4243 | |
| Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | lot no. KPO809S |
| Optigel | Europhta | ||
| Lacrigel | Medicament Autorisé | ||
| Tronothane | Lisa Pharma | ||
| GC agar base | Conda | 1106 | |
| Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
| Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| UEA lectin - rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
| Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
| Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
| Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
| Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
| MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
| MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
| VECTASHIELD mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
| OCT tissue tek | Sakura | 4583 |
References
- Davis, C. E., Arnold, K. Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura. J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).
- Mairey, E., et al. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J. Exp. Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Brandtzaeg, P., van Deuren, M. Classification and pathogenesis of meningococcal infections. Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).
- Guarner, J., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays. Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Hill, W. R., Kinney, T. D. The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study. J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).
- Capecchi, B., et al. Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells. Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).
- Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells. Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).
- Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule. Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).
- Taha, M. K. Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells. Cytokine. 12, 21-25 (2000).
- Kirchner, M., Meyer, T. F. The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor. Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).
- Mikaty, G., et al. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, (2009).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells. Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host's protein. Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Murray, A. G., et al. Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).
- Nassif, X., et al. Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells. Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).
- Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis. Genome Res. 13, 391-398 (2003).
- Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment. J. Exp. Med. 192, 1205-1211 (2000).
