Humaniseret Mouse Model til Study bakterieinfektioner Målretning mikrovaskulaturen

Summary

Neisseria meningitidis er en human specifikke patogen der inficerer blodkar. I denne protokol indføres menneskelige mikrokar i en mus ved podning menneskehud på immunkompromitterede mus. Bakterier overholde udstrakt grad til de menneskelige fartøjer, hvilket fører til vaskulær skade og udvikling af purpuric udslæt typisk observeret i humane tilfælde.

Abstract

Neisseria meningitidis forårsager en alvorlig, ofte dødelig sepsis, når det kommer ind i humant blod stream. Infektion fører til omfattende beskadigelse af blodkar, hvilket resulterer i vaskulær lækage, udvikling af purpuric udslæt og eventuel vævsnekrose. Studer patogenesen af denne infektion var tidligere begrænset af den menneskelige specificitet af bakterierne, hvilket gør in vivo modeller vanskelig. I denne protokol, beskriver vi en humaniseret model for denne infektion, hvor den menneskelige hud, der indeholder dermale mikrokar, podes på immunsvækkede mus. Disse skibe anastomoserer med musen cirkulation og samtidig bevare deres menneskelige egenskaber. Når indført i denne model, N. meningitidis overholde udelukkende de menneskelige fartøjer, hvilket resulterer i omfattende vaskulær skade, inflammation og i nogle tilfælde udvikling af purpuric udslæt. Denne protokol beskriver podning, infektion og evaluering trin i denne model i Context af N. meningitidis infektion. Teknikken kan anvendes til en lang række specifikke humane patogener, der inficerer blodet.

Introduction

Meningokok sepsis er en ofte dødelig blod født infektioner forårsaget af bakterielt patogen Neisseria meningitidis. Meningokok sepsis patienter ofte til stede med en petekkier eller purpuric udslæt på deres hud, som tidligere har været forbundet med vaskulære ødelæggelser forårsaget af cirkulerende bakterier og bakterielle produkter ^1. Hudbiopsier fra kliniske patienter viser bakterier forbundet med mikrokar ofte fylde beholderne ^2. Bortset fra bakterier, omfattende trombose, koagulation, overbelastning og vaskulær lækage ses i purpuric regioner ^3-5. Denne vaskulær skade kan føre til omfattende nekrose af huden og det omgivende væv, hvilket resulterer i débridement og endda amputation i meningokok overlevende. Forstå, hvordan infektion forårsager denne vaskulær skade er vigtigt at optimere forebyggelse og behandling strategier. Hovedparten af forskningen i meningokok sepsis er blevet udført in vitro påhumane cellelinier på grund af den menneskelige specificitet N. meningitidis. Mange aspekter af infektion er blevet undersøgt in vitro, herunder bakteriel adhæsion, værtscelle respons samt cytokin respons ^6-9. Type IV pili (TFP) har været impliceret som den store friktion organel til N. meningitidis på begge epitel og endotelceller ^10. Det er også blevet påvist, at adhæsion af N. meningitidis til værtsceller er forskydningsspænding afhængig og derfor menes at være relateret til blod flow i mikrovaskulaturen ^11. Dette tyder dynamiske belastninger bakterierne står in vivo er afgørende for patogenese. Det er imidlertid meget vanskeligt at modellere mikromiljø små fartøjer in vitro.

Vedhæftningen receptor for Neisseria TFP er stadig ukendt, og derfor ikke kan sendes knock-i strategier for at opnå bakteriel adhæsion i en dyremodel på dette tidspunkt. CD46 blev foreslået at være TFP-receptoren og transgene dyr blev fremstillet til at fungere som musemodeller. Men infektion i disse dyr ikke føre til omfattende infektion eller udslæt udvikling ^12,13. Andre dyremodeller, der er blevet beskrevet for bakteriæmi aspekt af Neisseria-infektion tage hensyn til den bakterielle præference for human transferrin som en jernkilde ^14,15. Enten supplere human transferrin eller udtrykker det fra et transgen resulterer i en øget bakteriel belastning i blodet over en længere periode, men denne model viser ingen bakteriel adhæsion eller udslæt udvikling ^16,17.

I denne protokol, beskriver vi en humaniseret musemodel, hvor den menneskelige hud, herunder dermal microvasculature er transplanteret på immunsvækkede mus ^18,19. Dette resulterer i funktionelle menneskelige skibe perfused med musen cirkulation. Kombineret med den menneskelige transferrin tilskud, denne model tegner sig for mindst to af de menneskelige specifikke aspekter af N. meningitidis, dvs humant endotel og human transferrin i et in vivo miljø. N. meningitidis indført intravenøst ​​i denne model klæbe specifikt til humant endotel, der producerer en patologi, der svarer til hvad der er rapporteret i kliniske patienter, herunder vaskulær skade og purpuric udslæt udvikling ^18.

Protocol

1.. Risici og tilladelser

1. Lokale etiske udvalg skal godkende alle animalske protokoller. Denne protokol blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjer, der fastsættes af de franske og europæiske regler for pasning og anvendelse af forsøgsdyr (Décrets 87-848, 2001-464, 2001-486 og 2001-131 og europæiske direktiv 2010/63/UE) og godkendt af den lokale etiske komité Comité d'ETHIQUE en matière d'Eksperimenter Animale, Université Paris Descartes, Paris, Frankrig. Nr.: CEEA34.GD.002.11.
2. For den menneskelige hud, blev skriftligt informeret patient samtykke opnås, og alle procedurer blev udført i henhold til franske nationale retningslinjer, og godkendt af den lokale etiske komité, Comité d'Evaluation ETHIQUE de l'INSERM IRB 00003888 FWA 00005881, Paris, Frankrig Udtalelse: 11-048 .
3. N. meningitidis er en potentielt skadelig humant patogen og der skal træffes alle nødvendige sikkerhedsforanstaltninger ved håndtering af organisme. Disse forholdsregler omfatter vaccination og arbejder under biosikkerhed niveau 2 betingelser.

2. Hudtransplantat

1. Saml huden så tæt på podning tid som muligt. Størstedelen af ​​huden i dette arbejde kommer fra plastikkirurgi operationer, der omfatter det abdominale område. Andre kilder såsom bryst, ben og endda ansigt har været anvendt med succes.
2. Den menneskelige hudprøven Forbered ved at rense hudoverfladen med 70% EtOH og liggende fladt på et godt rengjorte overflade, fortrinsvis under en strøm hætte.
3. Skær 200-400 um skiver fra toppen af ​​huden ved hjælp af en dermatom med forudindstillet tykkelse.
4. Kontroller huden skiver for integritet og skær dem i 2 cm x 2 cm firkanter, og derefter placere i PBS (uden divalente kationer) hvis podning straks eller ved 4 ° C i DMEM med 10% serum til kortvarig opbevaring (3-12 hr ).
5. Bedøve 6-8 uger gamle SCID.bg mus (ca. 20 g) med ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injeCTED ip
6. Når musene bedøvet, så tjek for smerte reaktion ved at udføre en tå knibe, en standard metode til oprettelse af smerte refleks. Påfør gel til øjnene for at forhindre udtørring af hornhinden og barbere den venstre side af dyret bag skulderen, hvor implantatet skal placeres. Hold musen varmt på en varmepude under hele proceduren.
7. Efter prepping musen for kirurgi, rense barberede område med 70% EtOH.
8. Anvende lokalbedøvelse topisk til transplantatet stedet (Tronothane) og forberede graft stedet ved omhyggeligt at fjerne overfladiske lag af musehud med et par buede saks. Vær omhyggelig med ikke at forstyrre den underliggende kar.
9. Fjern huden i et område lidt mindre end arealet af den menneskelige hud skive.
10. Fjern hud skive fra PBS (eller DMEM) og placere løbet graft seng, hvilket sikrer den epidermale side vender opad. Trin 2,8-2,10 skal udføres så hurtigt som muligt, at sikre graft sengen ikke tørrer ud.
11. Juster det ene hjørneeller kant og fix med væv lim. Passer forsigtigt resten af ​​huden skive til transplantatet seng, placere små mængder af vævslim rundt om kanterne. Trim altid den menneskelige hud til størrelse snarere end at gøre graft sengen større.
12. Må ikke trække huden for stramt over graft seng som musen hud er meget fleksibel.
13. Sørg for, at protesen fast med væv lim i hvert hjørne.
14. Rengør området med en jodopløsning.
15. Påfør et plaster med puden området over transplantatet. Sørg for, at Band-Aid er fast, men ikke stramt, og at dyrets vejrtrækning påvirkes ikke.
16. Fastgør Band-Aid med dressing tape.
17. Lad så dyret kan komme på en varm overflade.
18. Når vågen, sende dyret tilbage til sit bur. Dyrene er opstaldet 2-3 per bur.
19. Tjek mus regelmæssigt under genopretning for tegn på smerte eller lidelse. 10-14 dage efter podning, fjerne Band-Aid, og pas på ikke at forstyrre graft. Det er vores erfaring postoperative smerter er minimal. Ikke desto mindre dyr bør overvåges hver dag, navnlig i de få dage efter operation. Kriterier for smerte eller lidelse er følgende.
    • Tab af vægt over 10%
    • Fysiske udseende, pels, pukkelrygget position, øjne
    • Øget respiration eller hjerte satser
    • Nedsat eller usædvanlige bevægelser.
    • Stigning i kropstemperaturen
    • I tilfælde registreres tegn på smerte paracetamole administreres oralt (300 mg / kg hver 4. time). Humane endpoints overholdes strengt, hvis smerten fortsætter.
20. Hvis transplantatet ser tør anvende babyolie hver 2-3 dage for at holde huden smidig.
21. Transplantatet er klar til forsøg 21 dage efter graft.

3. Infektion

1. Dagen før infektion, forberede bakteriestamme ved udstrygning på GCB agarplader med passende antibiotika. Dyrk natten over ved 37 ° C i 5% _CO2.
2. Bakterier forberedelse Ompodes bakterier i 5 ml human endotel SFM medier med 10% serum til en _OD600 0,05.
3. Inkuber under omrystning i 2 timer i inkubator (37 ° C i 5% CO ₂₎ med løst låg, indtil bakterietætheden omtrent _OD600 0.1.
4. Centrifuger bakterierne i 3 minutter 15.000 rpm.
5. Fjern supernatanten og resuspender i PBS, centrifugeres igen.
6. Gentag vasketrinet (2.2.4-2.2.5) to gange.
7. Resuspender bakteriepellet i PBS.
8. Mål _OD600.
9. Lav en kultur af enten _OD600 0,1 (10 ⁸ CFU / ml), eller _OD600 1,0 (10 ⁹ CFU / ml). Fra dette kendt koncentration, fortyndes til 10 ⁷ CFU / ml. Forsøger at forberede bakterier så tæt på injektionsstedet som muligt.

Mus

1. Mus vejes.
2. Bedøve mus med ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injiceret ip
3. Når søvn, cdælen, at smerten reaktion er fraværende ved en tå-knibe, holde musene varm med en varmepude og lægge øje salve på at forhindre udtørring.
4. Giv hver mus 8 mg humant transferrin, resuspenderet i saltvand eller PBS injiceret ip
5. Tag en lille dråbe blod fra halen og spredes på en agarplade at kontrollere blod er steril forud for infektion.
6. Sprøjt 100 ul 10 ⁷ CFU / ml bakteriekultur (10 ⁶ CFU alt) intravenøst ​​via retro-orbital eller hale vene. Målinger af CFU taget 5 min efter injektion er i overensstemmelse uanset injektionssted.
7. Efter et par minutter, snip enden og blodprøve spredes på agarplader med passende antibiotika med en 10 ganges fortynding for at etablere blod CFU umiddelbart efter infektion.
8. Forsegl hale med væv lim.
9. Efter injektion fortyndes den bakterielle inokulum og spredes på agarplader med passende antibiotika til at etablere CFU.
10. Lad musat inddrive på en varmepude, indtil de er op og bevæger sig
11. Ved 6 timer efter infektion trække en lille mængde blod fra halen, fortyndes og pladen for at etablere CFU på 6 timer.
12. Inkubér alle agarplader ved 37 ° C i 5% CO ₂ natten over.

4.. Sacrifice

1. På det valgte tidspunkt for infektion, bedøve mus med ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injiceret ip
2. Når søvn, holde musen varm med en varmepude.
3. Når smerterne refleks er gået (toe-knivspids), snip halespidsen og trække blod.
4. Spred blod på agarplader med passende antibiotika, 5 mikroliter direkte og 10 pi 1:10 fortynding for at etablere CFU.
5. Sacrifice musen ved cervikal dislokation.
6. Efter at ofre musen i henhold til alle relevante institutionelle og etiske retningslinjer, bekræft død ved manglende hjerteslag. Lav en midtlinjeincision, skære igennem brystkassen, og gøre et snit i høret.
7. Indsamle så meget blod som muligt fra hjertet / brysthulen og anbringes i et sterilt rør.
8. Fjern organer (fx lever, milt, hjerne) i en steril plade.
9. Fjern hudtransplantation og en sektion af musehud ind i den sterile plade.
10. Bortskaf musen kroppen.
11. Efter tappet blod har fået lov til at størkne i 15 min, centrifugeres den 15 min ved 3.000 rpm.
12. Fjern plasma fra blod og opbevares ved -80 ° C til senere analyse, for eksempel til cytokin påvisning ved ELISA eller FACS baserede metoder.

5.. Organ CFU Tæller

1. Afvej homogenisering rør indeholdende 500 pi PBS hver, før der træffes biopsiprøver.
2. Tag 4 mm biopsi prøver fra hver væv ved hjælp af en steril biopsi punch.
3. Place biopsier i forvejet homogenisering rør indeholdende 500 pi PBS. Homogenisere hud prøver med 2 mm perler, bruge mindre perler til andre organer.
4. Placer de resterende tspørgsmål i 4% paraformaldehyd (PFA) og opbevares ved 4 ° C til mikroskopi (se nedenfor).
5. Afvej homogenisering rør indeholdende biopsier at etablere biopsi vægt (til senere beregning af CFU / mg væv).
6. Homogeniseres prøver.
   1. Homogenisere lever, milt og hjerne, ved 6.000 rpm i 30 sek.
   2. Homogenisere hudprøver ved 6.000 rpm i 30 sek og gentag om nødvendigt.
7. Spred fortyndinger fra hver homogenisering rør på agarplader og vokse natten over ved 37 ° C i 5% CO ₂ for at etablere orgel kimtal.

6.. Histologi / Immunohistokemi

1. Fiksering
   1. Fix væv i 4% PFA natten over ved 4 ° C. Fikseringen trin kan være længere, hvis opbevaring i længere perioder placere væv i 0,25% PFA.
   2. Skyl væv i PBS og derefter placere i 20% sucroseopløsning og vende tilbage til 4 ° C natten over, eller indtil vævet er sunket i opløsningen.
   3. Vask væv i PBS, tilskåret og sted i OCT-løsning (enten i et væv støbeform eller levet op til en base bord).
   4. Hurtigt fryse væv på en petriskål flydende i flydende nitrogen.
   5. Efter frysning, sætte væv på tøris før overførsel til -80 ° C til opbevaring.
2. Slicing
   1. Fjern væv fra -80 ° C og gør det muligt at ækvilibrere til -20 ° C i en kryostat.
   2. Skær væv med en tykkelse på ca 10-15 m og placere på coatede mikroskopi dias.
   3. Store glider ved -20 ° C indtil brug.
3. Farvning
   1. Tillad dias til at komme til stuetemperatur.
   2. Tegn omkring skive på diaset med en hydrofob pen. Vent 5-10 min.
   3. Rehydrere / vask skive i PBS i 5 minutter, gentages to gange.
   4. Permeabilisere skive i 0,1% Triton i PBS i 10 min.
   5. Vask i PBS 2-3x i 5 min.
   6. Block i PBS0,1% Triton 1% BSA i mellem 10-60 min efter antistoffet eller plet, der skal anvendes.
   7. Fjern blokerende buffer, og der tilsættes primært antistof fortyndet som krævet i blok buffer. Inkuber i bestemt tidsrum. (Ofte 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C).
   8. Vask i PBS 2-3x i 5 min.
   9. Anvend sekundært antistof fortyndet passende i bock buffer, DAPI er typisk indgår i dette trin. Inkuber i bestemt tid, ofte 1-2 hr stuetemperatur i mørke.
   10. Vask i PBS 2-3x i 5 min.
   11. Mount i fade beskytter montering medier med et dækglas og forsegle med neglelak.
   12. Billede farvede objektglas straks eller opbevares ved 4 ° C.
   13. Udfør billeddannelse med en konfokal eller fluorescerende mikroskopi oprettet med filtre / lasere egnede til fluorophores brugt.
4. Histologi
   1. Tillad objektglas skal anvendes til histologi til at komme til stuetemperatur.
   2. Stain dias ved hjælp somtandard hæmatoxylin / eosin-farvning protokol.
      1. Placer dias i slide rack.
      2. Overfør rack med dias mellem løsninger i følgende rækkefølge:
      3. 2 sek i rindende vand.
      4. 3 min i filtreret Hematoxylinopløsning.
      5. 10 sek i rindende vand.
      6. 10 sek i destilleret vand.
      7. 10 sek til ethanol 100%.
      8. 2 sek i filtreret eosin.
      9. 10 sek i rindende vand.
      10. 10 sek til ethanol 100%
      11. 2 min i xylen x 3 (bad I, II, III).
      12. Overfør straks og tilsæt nogle dråber af fiksering lim på hver dias, sted dækglasset på toppen, fjerne luftbobler, lad tørre i et par timer.
      13. Billede glider under en standard hvidt lys mikroskop.

Representative Results

CFU tællinger

N. meningitidis stamme anvendes i disse repræsentative resultater er N. meningitidis 8013 klon 12, en serogruppe C klinisk isolat, der udtrykker en klasse I SB pilin, Opa ^- OPC ^-, PilC1 ⁺ / PilC2 ^{+ 20.} Stammen var blevet manipuleret til at udtrykke grønt fluorescerende protein (GFP) fra en kromosomal insertion ^18. Bakterielle kolonidannende unit tæller er etableret ved at tælle antallet af kolonier på agarplader og beregne enten CFU / ml blod eller CFU / mg af væv fra de kendte mængder udpladet. Blodtællinger viste, at 5 minutter efter intravenøs injektion af 10 ⁶ CFU bakterier var der et gennemsnit på 1,5 x 10 ⁵ CFU / ml i blodet (figur 1A). Efter 6 timer tællingerne i gennemsnit 4,8 x 10 ⁴ CFU / ml. Ved 24 timer de gennemsnitlige tællinger var 2,4 x 10 ⁴ CFU / ml, men i denne gruppe af 10 mus, 5 havdeingen påviselig cirkulerende bakterier, mens de andre 5 havde relativt høje tællinger (figur 1a). Kimtal taget fra hudprøverne viser hovedparten af mus, der har betydelige tællinger i den menneskelige hud, med et gennemsnit 2,1 x 10 ⁴ CFU / mg væv ved 6 timer og 4,4 x 10 ² CFU / mg væv ved 24 timer (figur 1 B) . Den kontralaterale musehud prøver viste ingen kimtal ved 24 timer og kun et meget lavt antal på 6 timer, hvilket viser stærk præference for N. meningitidis til de menneskelige skibe i podede huden (figur 1B). Generelt kimtal var meget lav til nondetectable i andre organer i stikprøven selv 2 dyr gjorde show tæller, der kan henføres til forurening fra blodet, da de korreleret med høj cirkulerende antal bakterier (figur 1C). Modellen kan også anvendes til at bestemme den rolle virulensfaktorer in vivo, for eksempel type IV pili. Bakteriestammer med definerede mutationer i pilD gen ^21, hvilket resulterer i en stamme, der mangler TFP, samt pilC1 gen ^8, mangler den foreslåede TFP 'adhesin' blev indført i modellen. Disse mutationer resulterede ikke i nogen bakteriel adhæsion i den menneskelige hud graft, bekræfter den afgørende rolle TFP spiller adhæsion in vivo (figur 1D).

Immunohistokemi / Histologi

I disse forsøg anvendte vi N. meningitidis-stammer, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) for at muliggøre fluorescenspåvisning uden behov for sekundær farvning. Humane fartøjer blev farvet ved hjælp af en markør for den menneskelige endotel enten CD31 (PECAM-1) eller lectin Ulex europaeus agglutinin (UEA) ^18,22. UEA blev konjugeret til rhodamin giver et-trins-farvning (figur 2A-C). Cellekerner kan pletteed med DAPI at hjælpe med at identificere vævsstrukturer (figur 2A-B). Histologi blev udført under anvendelse af en standard hematoxylin / eosin-farvning. Den epidermale / dermale grænse af hud var klart identificerbare. Inflammation, trombose og vaskulær lækage var koncentreret til fartøjer, tæt på denne grænse 24 timer efter infektion (figur 2D). Trombose var synlig i flere små dermal fartøjer, ofte ledsaget af overbelastning og inflammation. Lækage af røde blodlegemer ud i væv kunne ses, hvilket indikerer en stor grad af fartøj skader. Histopatologien podet hud-inficeret mus, syntes normale uden skelnes inflammation ^18. I omkring 30% af infektionerne bakteriel adhæsion i huden fører til udvikling af makroskopisk påviselige purpura (figur 2E og 2F).

"5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg" />
Figur 1. CFU tæller. (A) Bakteriel CFU tællinger pr ml blod på 5 min, 6 timer og 24 timer efter infektion. (B) Bakteriel CFU tæller fra hudprøver sammenligner menneskehud (HS) og musehud (MS) ved både 6 timer og 24 timer efter infektion. (C) Bakteriel CFU tæller fra andre organer taget 24 timer efter infektion. (D) Sammenligning bakterielle kimtal fra mennesker og mus hud prøver udtaget på 24 timer efter infektion fra mus inficeret med vildtype N. meningitidis 2C43 plet (WT), en stamme med en mutation i pilD genet (pilD) eller en stamme med en mutation i pilC1 genet (pilC1). Alle grafer er vist som rå data med median. Figur er modificeret fra Melican et al. ^18."_blank"> Klik her for at se større billede.

Figur 2. Mikroskopi. (A) projektion af et konfokalt stak viser et menneske mikrokar farvet med UEA lectin (rød) tæt på dermal (d), epidermal (e) grænse. Skibet er inficeret med N. meningitidis (grøn) 2 timer efter infektion. (B) En optisk skive og en skive fremspring (C) viser N. meningitidis mikrokolonier (grøn) infektion et menneske fartøj (UEA - rød) inden for en hudtransplantation 2 hr efter infektion. (D) Hæmatoxylin / eosin-farvning af humant hudtransplantat inficeret i 24 timer med N. meningitidis. Den epidermale (e), dermal (d) grænse er klart synlig og omfattende trombose og overbelastning af microvessels (pile) ses i dermis. Kan også identificeres inflammation og nogle vaskulær lækage (pilespids). (E) Menneskelig hudtransplantat før infektion. (F) Den samme hudtransplantation som (E) 24 timer efter infektion med N. meningitidis viser purpuric regioner (pile). Figurerne 2B, 2D, 2E og 2F er ændret fra Melican et al. ¹⁸ Klik her for at se større billede .

Discussion

Dyremodeller er kritisk vigtigt at bakteriel patogenese forskning. Det er umuligt fuldstændigt at efterligne in vivo-miljøet i cellekultur, og det bliver tydeligt, at værtspatogene interaktionen påvirkes af mange dynamiske faktorer. Den menneskelige specificitet nogle klinisk vigtige patogener, såsom N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes og Salmonella typhi har begrænset anvendelsen af in vivo-modeller for disse infektioner. Men når vi begynder at forstå, hvilke smitsomme skridt er involveret i specificitet humaniserede modeller er under udvikling. Protokollen beskrevet her er en demonstration af dette med indførelsen af humane mikrokar i mus, der giver mulighed for omfattende in vivo-infektion med N. meningitidis, hvilket resulterer i vaskulær skade og lejlighedsvis udvikle purpuric udslæt.

Anvendelse af denne modelvi har været i stand til at definere, at klæbeevne TFP er involveret i vaskulær kolonisering in vivo ved hjælp af bakterielle mutanter, og at den vaskulære skade reduceres i fraværet af friktion ^18. Tidligere har cirkulerende bakterielle produkter været impliceret i denne skade, men vores resultater tyder på en afgørende rolle for den lokale vedhæftning og vaskulær kolonisering. Det åbner nye muligheder for udvikling af nye behandlingsmål. Hvis vedhæftning af sygdomsfremkaldende bakterier kan blive blokeret farmaceutisk det kunne muligvis forebygge udviklingen af ​​hudlæsioner og føre til bedre resultater for meningokok overlevende i form af vævsnekrose, débridement og amputationer. Arbejdet har også vist kompleksiteten af ​​infektionen og inddragelse af immunresponset og koagulationskaskaden den. Vi identificerede menneskelige cytokin signalering i serum fra inficerede mus på trods af den relativt lille mængde humant endotel nuværende ^{18 år.}Dette indikerede en signifikant cytokin respons sammen med infiltration af muse immun cellepopulationer ind i området.

Dyremodeller kan selvfølgelig aldrig helt replikere sygdom hos mennesker og alle resultater fået fra dem, skal betragtes med dette i tankerne. For eksempel, i denne model blodet og cirkulerende celler er af museoprindelse, og vi kan ikke rabat, at de kan opføre sig anderledes til humane celler. En fordel ved dette er imidlertid, som vist i vores nylige publikation ^18, er evnen til at skelne signaler stammer fra den humane endotel fra de cirkulerende museceller. Den immunkompromitterede baggrund af de anvendte mus i denne model vil også give mulighed for allogen overførsel af humane immun cellepopulationer, tilføjer endnu en "humanisering" aspekt. Immunkompromitterede baggrund af musene kan dog maskere en rolle for NK, T-eller B-celler, som alle mangler eller defekte i denne model. Den relativt Short tidsramme (24 timer), der anvendes i denne model først og fremmest drejer sig om den medfødte respons, men for langsigtede infektioner og udvikling af immunitets andre muligheder kan være nødvendigt at blive udforsket.

Huden er en vigtig infektion site for N. meningitidis men har en relativt lille mængde af menneskelige skibe betyder også, at ekstrapolere data til en systemisk infektion involverer mange organer er vanskelig. Mens denne model giver mulighed for studiet af dermal læsion udvikling, vigtige skridt for meningokok infektion såsom epitelial og blod-hjerne-passage ikke inkluderet. Videreudvikling af disse humaniserede modeller er nødvendig for at løse disse andre aspekter af infektionen. Ikke desto mindre er denne model tilbyder et stort potentiale for mange specifikke humane patogener, især rettet mod blodkarrene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco Invitrogen	31885-023
Phosphate buffered saline	Gibco Invitrogen	10010-056
Ketamine 500	Virbac France		lot no. VAL4243
Xylazine	Bayer Healthcare	AMM N° FR/8146715 2/1980	lot no. KPO809S
Optigel	Europhta
Lacrigel	Medicament Autorisé
Tronothane	Lisa Pharma
GC agar base	Conda	1106
Human endothelium SFM media	Gibco Invitrogen	11111
Fetal bovine serum	P A A	A15-101
Human transferrin	Sigma-Aldrich	T3309
UEA lectin - rhodamine	Vector Labs	RL-1062
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H9627
Eosin	Sigma-Aldrich	E4009
Xylene	Sigma-Aldrich	534056
Sober Hand Dermatome	Humeca BV, Holland	4.SB01
Animal housing	Innovive	M-BTM-C8
Biopsy punch (4 mm)	Dominic Dutscher	30737
Fast-Prep lysing matrix M tubes	MP Bio	116923050
MagNA Lyzer Green Beads	Roche	3358941001
MagNA Lyzer	Roche	3358976001
VECTASHIELD mounting media	Vector Labs	H-1000
Vetbond	3M	1469SB	Tissue Glue
OCT tissue tek	Sakura	4583