Summary
नेइसेरिया meningitidis रक्त वाहिकाओं को संक्रमित करता है कि एक मानव विशिष्ट रोगज़नक़ है. इस प्रोटोकॉल में मानव microvessels immunocompromised चूहों पर मानव त्वचा कलम बांधने का काम करके एक चूहे में पेश कर रहे हैं. जीवाणु आमतौर पर मानव मामलों में मनाया शीतादि संबंधी दाने के संवहनी नुकसान और विकास के लिए अग्रणी मानव वाहिकाओं के लिए बड़े पैमाने पर कायम रहें.
Abstract
यह मानव रक्त प्रवाह में प्रवेश करती है जब नेइसेरिया meningitidis एक गंभीर, अक्सर घातक पूति का कारण बनता है. संक्रमण संवहनी रिसाव, शीतादि संबंधी चकत्ते और अंतिम ऊतक परिगलन के विकास में जिसके परिणामस्वरूप रक्त वाहिकाओं की व्यापक क्षति की ओर जाता है. इस संक्रमण के रोगजनन के अध्ययन के पहले से vivo मॉडल में कठिन बना देता है जो बैक्टीरिया के मानव विशिष्टता, द्वारा सीमित था. इस प्रोटोकॉल में, हम मानव त्वचा, चमड़े का microvessels युक्त, immunocompromised चूहों पर grafted है जिसमें इस संक्रमण के लिए एक humanized मॉडल का वर्णन. उनके मानव विशेषताओं को बनाए रखते हुए इन जहाजों माउस संचलन के साथ दो भागों का आपस में मिलाना. एक बार जब यह मॉडल, एन में पेश meningitidis व्यापक संवहनी नुकसान, सूजन और शीतादि संबंधी दाने के कुछ मामलों में विकास है, जिसके परिणामस्वरूप मानव वाहिकाओं के लिए विशेष रूप से पालन करें. इस प्रोटोकॉल Conte में इस मॉडल की ग्राफ्टिंग, संक्रमण और मूल्यांकन चरणों का वर्णनएन के xt meningitidis संक्रमण. तकनीक में रक्त प्रवाह को संक्रमित कि कई मानव विशिष्ट रोगजनकों के लिए लागू किया जा सकता है.
Introduction
मेनिंगोकोक्सल पूति जीवाणु रोगज़नक़ नेइसेरिया meningitidis की वजह से एक अक्सर घातक रक्त का जन्म संक्रमण है. मेनिंगोकोक्सल पूति रोगियों को अक्सर पहले से परिसंचारी बैक्टीरिया और बैक्टीरियल उत्पादों 1 के कारण संवहनी विनाश के साथ संबद्ध किया गया है कि उनकी त्वचा पर एक petechial या शीतादि संबंधी दाने के साथ मौजूद. नैदानिक रोगियों से त्वचा बायोप्सी अक्सर वाहिकाओं 2 भरने, microvessels के साथ जुड़े बैक्टीरिया दिखा. इसके अलावा बैक्टीरिया, व्यापक घनास्त्रता, जमावट, भीड़ और संवहनी रिसाव से शीतादि संबंधी क्षेत्रों 3-5 में देखा जाता है. इस संवहनी नुकसान मेनिंगोकोक्सल बचे में क्षतशोधन और भी विच्छेदन में जिसके परिणामस्वरूप त्वचा और आसपास के ऊतकों की व्यापक गल जाना हो सकता है. संक्रमण के इस संवहनी नुकसान का कारण बनता समझ कैसे रोकथाम और उपचार रणनीतियों का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है. मेनिंगोकोक्सल पूति पर अनुसंधान के बहुमत पर इन विट्रो में प्रदर्शन किया गया हैएन के मानव विशिष्टता की वजह से मानव कोशिका लाइनों meningitidis. संक्रमण के कई पहलुओं बैक्टीरियल आसंजन, मेजबान सेल प्रतिक्रिया के साथ ही साइटोकाइन प्रतिक्रिया 6-9 सहित इन विट्रो में अध्ययन किया गया है. प्रकार चतुर्थ पिली (TFP) एन के प्रमुख आसंजन organelle के रूप में शामिल किया गया है meningitidis उपकला और endothelial कोशिकाओं 10 दोनों पर. यह भी एन की कि आसंजन दिखाया गया है मेजबान कोशिकाओं को meningitidis कतरनी तनाव निर्भर है और इसलिए microvasculature 11 में रक्त प्रवाह की दर से संबंधित माना जाता है. इस बैक्टीरिया विवो में सामना गतिशील तनावों रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण हैं पता चलता है. यह इन विट्रो में छोटे जहाजों का microenvironment मॉडल पर फिर भी बहुत मुश्किल है.
नेइसेरिया TFP के लिए आसंजन रिसेप्टर अभी भी अज्ञात है और इसलिए एक पशु मॉडल में बैक्टीरियल आसंजन प्राप्त करने के लिए दस्तक में रणनीति इस समय की परिकल्पना नहीं की जा सकती. CD46 TFP रिसेप्टर और ट्रांसजेनिक जानवर माउस मॉडल के रूप में कार्य करने के लिए तैयार किए गए होने का सुझाव दिया गया था. हालांकि, इन जानवरों में संक्रमण व्यापक संक्रमण के लिए नेतृत्व नहीं करता है या विकास 12,13 दाने को. नेइसेरिया संक्रमण की bacteremia पहलू के लिए वर्णित किया गया है कि अन्य पशु मॉडल के खाते में एक लोहे के स्रोत 14,15 के रूप में मानव transferrin के लिए जीवाणु वरीयता ले. मानव transferrin सप्लीमेंट या एक विस्तारित समय अवधि में रक्त प्रवाह में एक वृद्धि जीवाणु लोड में एक transgene परिणामों से यह व्यक्त, लेकिन इस मॉडल नहीं बैक्टीरियल आसंजन या दाने विकास 16,17 से पता चलता है या तो.
इस प्रोटोकॉल में, हम चमड़े का microvasculature सहित मानव त्वचा, immunocompromised चूहों 18,19 पर प्रत्यारोपित किया जाता है, जिसमें एक humanized माउस मॉडल का वर्णन. इस माउस संचलन के साथ perfused कार्यात्मक मानव वाहिकाओं, में यह परिणाम है. मानव transferrin पूरकता के साथ संयुक्त, यह मीटरODEL एन के मानव विशिष्ट पहलुओं के कम से कम दो के लिए खातों meningitidis, एक vivo वातावरण में, मानव endothelium और मानव transferrin अर्थात्. एन meningitidis संवहनी नुकसान और शीतादि संबंधी दाने विकास 18 सहित नैदानिक रोगियों में सूचना दी है क्या करने के लिए इसी तरह की है कि एक विकृति का निर्माण, मानव अन्तःचूचुक के लिए विशेष रूप से पालन करना इस मॉडल में नसों की शुरुआत की.
Protocol
1. जोखिम और अनुमतियाँ
- स्थानीय नैतिकता समितियों सभी पशु प्रोटोकॉल स्वीकार करना चाहिए. इस प्रोटोकॉल फ्रांसीसी और यूरोपीय प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए विनियम (Décrets 87-848, 2001-464, 2001-486 और 2001-131 और द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया यूरोपीय निर्देशक 2010/63/UE) और स्थानीय नैतिक समिति फ्रांस Comité डी 'Ethique एन matière डी' प्रयोग ANIMALE, Université पेरिस डेसकार्टेस, पेरिस, ने मंजूरी दे दी. नहीं: CEEA34.GD.002.11.
- मानव त्वचा के लिए, लिखित में सूचित रोगी सहमति प्राप्त हुई थी और सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया फ्रांस की राष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुसार और स्थानीय नैतिक समिति, Comité डी 'मूल्यांकन Ethique डी ल INSERM आईआरबी 00003888 FWA 00005881, पेरिस, फ्रांस राय द्वारा अनुमोदित: 11-048 .
- एन meningitidis एक संभावित हानिकारक मानव रोगज़नक़ है और संगठनों से निपटने जब सभी आवश्यक सावधानियां बरती जानी चाहिएnism. इन सावधानियों के टीकाकरण और जैव सुरक्षा स्तर 2 शर्तों के तहत काम कर शामिल हैं.
2. त्वचा भ्रष्टाचार
- संभव के रूप में समय ग्राफ्टिंग के करीब मानव त्वचा लीजिए. इस काम में त्वचा के बहुमत पेट क्षेत्र को शामिल प्लास्टिक सर्जरी आपरेशन से आता है. ऐसे स्तन, पैर और भी चेहरे के रूप में अन्य स्रोतों सफलता के साथ इस्तेमाल किया गया है.
- 70% EtOH के साथ त्वचा की सतह की सफाई और बेहतर एक प्रवाह हुड के तहत, एक अच्छी तरह से साफ सतह पर फ्लैट यह झूठ बोल रही द्वारा मानव त्वचा नमूना तैयार करें.
- पूर्व निर्धारित मोटाई के साथ एक चर्म का उपयोग कर त्वचा के ऊपर से 200-400 माइक्रोन स्लाइस स्लाइस.
- अल्पकालिक भंडारण के लिए 10% सीरम (3-12 मानव संसाधन के साथ तुरंत या DMEM में 4 डिग्री सेल्सियस पर कलम बांधने का काम अगर अखंडता के लिए त्वचा स्लाइस की जाँच करें और 2 सेमी x 2 सेमी वर्गों में कटौती, तो (द्विसंयोजक फैटायनों के बिना) पीबीएस में जगह ).
- Ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) inje साथ 6-8 सप्ताह पुराने SCID.bg चूहों (लगभग 20 ग्राम) बेहोश करनाcted आईपी
- चूहों anaesthetized हो जाने के बाद, एक पैर के अंगूठे चुटकी, दर्द पलटा स्थापित करने के लिए एक मानक पद्धति के प्रदर्शन से दर्द की प्रतिक्रिया के लिए जाँच करें. कार्निया सुखाने को रोकने और भ्रष्टाचार रखा जाएगा जहां कंधे, पीछे जानवर के बाईं ओर दाढ़ी बनाने के लिए आंखों को जेल लागू करें. प्रक्रिया के दौरान एक गर्मी पैड पर माउस को गर्म रखें.
- सर्जरी के लिए माउस prepping के बाद, 70% EtOH के साथ मुंडा क्षेत्र को साफ.
- भ्रष्टाचार साइट (Tronothane) को topically स्थानीय संवेदनाहारी लागू करें और ध्यान से घुमावदार कैंची की एक जोड़ी के साथ माउस त्वचा की ऊपरी परत को हटाने के द्वारा भ्रष्टाचार साइट तैयार करते हैं. अंतर्निहित वाहिका संरचना को बाधित करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा.
- मानव त्वचा टुकड़ा के क्षेत्र से एक छोटा सा एक क्षेत्र में त्वचा निकालें.
- पीबीएस (या DMEM) से त्वचा टुकड़ा निकालें और भ्रष्टाचार बिस्तर पर जगह, एपिडर्मल पक्ष का सामना करना पड़ रहा है यह सुनिश्चित करना. कदम 2.8-2.10 भ्रष्टाचार बिस्तर बाहर सूखा नहीं है, यह सुनिश्चित करने के रूप में जल्दी संभव के रूप में किया जाना चाहिए.
- एक कोने संरेखितया ऊतक गोंद के साथ बढ़त और तय. ध्यान से किनारों के आसपास के ऊतक गोंद की छोटी मात्रा में रखने, भ्रष्टाचार बिस्तर पर त्वचा टुकड़ा के बाकी फिट. हमेशा आकार के लिए मानव त्वचा ट्रिम के बजाय भ्रष्टाचार बिस्तर बड़ा बनाते हैं.
- माउस त्वचा बहुत लचीला है के रूप में भ्रष्टाचार के बिस्तर पर भी तंग त्वचा खींच मत करो.
- भ्रष्टाचार के प्रत्येक कोने में ऊतक गोंद के साथ तय हो गई है सुनिश्चित करें.
- एक आयोडीन समाधान के साथ क्षेत्र को साफ.
- भ्रष्टाचार खत्म तकिया क्षेत्र के साथ एक बैंड सहायता लागू करें. बैंड सहायता फर्म लेकिन तंग नहीं है और पशु की सांस प्रभावित नहीं है कि सुनिश्चित करें.
- ड्रेसिंग टेप के साथ बैंड सहायता ठीक करें.
- जानवर एक गर्म सतह पर ठीक करने की अनुमति.
- एक बार जाग, अपने पिंजरे में पशु वापसी. पशु 2-3 प्रति पिंजरे रखे जाते हैं.
- दर्द या संकट के संकेत के लिए वसूली के दौरान नियमित रूप से चूहों की जाँच करें. 10-14 दिनों ग्राफ्टिंग के बाद, भ्रष्टाचार को बाधित करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, बैंड सहायता हटा दें. हमारे अनुभव में पश्चात दर्द छोटा हैमॉल. फिर भी जानवरों के आपरेशन के बाद कुछ दिनों में विशेष रूप से हर दिन निगरानी की जानी चाहिए. दर्द या संकट के लिए मानदंड निम्नलिखित हैं.
- 10% से अधिक वजन की हानि
- शारीरिक रूप, फर, कुबड़ा स्थिति, आंखों
- बढ़ी हुई श्वसन या दिल की दर
- कमी या असामान्य आंदोलनों.
- शरीर के तापमान में वृद्धि
- मामले में दर्द के लक्षण पता चला रहे हैं paracetamole (300 मिलीग्राम / किग्रा, हर 4 घंटा) मौखिक रूप से किया जाता है. इंसानियत endpoints सख्ती से दर्द बनी रहती है, तो पालन कर रहे हैं.
- भ्रष्टाचार कोमल त्वचा को रखने के लिए हर 2-3 दिनों बच्चे के तेल लागू सूखा लग रहा है.
- भ्रष्टाचार प्रयोग 21 दिनों के बाद भ्रष्टाचार के लिए तैयार है.
3. संक्रमण
- संक्रमण से पहले दिन, उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ GCB अगर प्लेटों पर streaking द्वारा बैक्टीरियल तनाव तैयार करते हैं. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात आगे बढ़ें.
- बैक्टीरिया तैयारी
- लगभग 600 आयुध डिपो 0.1 की एक जीवाणु घनत्व जब तक इनक्यूबेटर में 2 घंटे ढीला ढक्कन के साथ (5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस), के लिए मिलाते हुए सेते हैं.
- 3 मिनट के लिए 15,000 rpm के लिए बैक्टीरिया अपकेंद्रित्र.
- पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend निकालें, तो फिर अपकेंद्रित्र.
- दो बार धोने कदम (2.2.4-2.2.5) दोहराएँ.
- पीबीएस में बैक्टीरिया गोली Resuspend.
- आयुध डिपो 600 उपाय.
- आयुध डिपो 600 0.1 (10 8 CFU / एमएल), या आयुध डिपो 600 1.0 (10 9 CFU / एमएल) या तो की एक संस्कृति बनाओ. यह ज्ञात एकाग्रता से, 10 7 CFU / एमएल पतला. संभव के रूप में इंजेक्शन समय के करीब बैक्टीरिया तैयार करने की कोशिश.
- चूहों का वजन.
- Ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine साथ चूहों बेहोश करना (10 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्शन आईपी
- एक बार सो, गबिल्ली कि दर्द की प्रतिक्रिया एक गर्मी पैड के साथ गर्म चूहों रखने के लिए और सुखाने को रोकने के लिए पर आंख मरहम रख दिया, एक पैर के अंगूठे चुटकी से अनुपस्थित है.
- प्रत्येक माउस खारा या पीबीएस में resuspended मानव transferrin के 8 मिलीग्राम, दो, आईपी इंजेक्शन
- पूंछ से रक्त की एक छोटी सी बूंद लो और रक्त पूर्व संक्रमण को बाँझ है की जांच करने के लिए एक अगर प्लेट पर फैल गया.
- नसों रेट्रो कक्षीय या पूंछ नस के माध्यम से 100 μl 10 7 CFU / एमएल जीवाणु संस्कृति (10 6 CFU कुल) इंजेक्षन. 5 मिनट पद इंजेक्शन लिया CFU की माप की परवाह किए बिना इंजेक्शन साइट की संगत कर रहे हैं.
- कुछ ही मिनटों के बाद, पूंछ अंत कटाव और तुरंत संक्रमण के बाद रक्त CFU स्थापित करने के लिए एक 10 गुना कमजोर पड़ने के साथ उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ अगर प्लेट पर खून का नमूना फैल गया.
- ऊतक गोंद के साथ पूंछ सील.
- इंजेक्शन के बाद, बैक्टीरियल inoculum पतला और CFU स्थापित करने के लिए उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ अगर प्लेटों पर फैल गया.
- चूहों की अनुमति देंवे ऊपर और आगे बढ़ रहे हैं जब तक एक गर्मी पैड पर ठीक करने के लिए
- 6 घंटा बाद संक्रमण के 6 घंटा पर CFU स्थापित करने के लिए पतला और प्लेट, पूंछ से रक्त की एक छोटी राशि आकर्षित.
- सीओ 2 रातोंरात 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर सब अगर प्लेटें सेते हैं.
4. यज्ञ
- संक्रमण के चुने हुए समय, Ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine साथ चूहों बेहोश करना (10 मिलीग्राम / किग्रा) आईपी इंजेक्शन
- सो एक बार, एक गर्मी पैड के साथ माउस को गर्म रखने के.
- दर्द पलटा (पैर के अंगूठे चुटकी) चला गया है, पूंछ के अंत कटाव और रक्त आकर्षित.
- उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ अगर प्लेट पर खून बिखरा हुआ है, 5 μl प्रत्यक्ष और 10 μl 1:10 कमजोर पड़ने CFU स्थापित करने के लिए.
- ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस बलिदान.
- सभी प्रासंगिक संस्थागत और नैतिक दिशा निर्देशों के अनुसार माउस का त्याग करने के बाद, दिल की धड़कन की कमी से मौत की पुष्टि. रिब पिंजरे के माध्यम से कट एक midline चीरा, बनाओ, और सुनने में एक चीरा बनानेटी.
- एक बाँझ ट्यूब में दिल / छाती गुहा और जगह से जितना संभव हो उतना खून ले लीजिए.
- एक बाँझ थाली में अंगों (जैसे जिगर, तिल्ली, मस्तिष्क) निकालें.
- त्वचा भ्रष्टाचार और बाँझ थाली में माउस त्वचा के एक वर्ग निकालें.
- माउस शरीर के निपटान के.
- एकत्र रक्त 15 मिनट के लिए थक्का करने के लिए अनुमति दी गई है, 3,000 rpm पर 15 मिनट यह अपकेंद्रित्र.
- एलिसा या FACS आधारित विधियों द्वारा साइटोकाइन का पता लगाने के लिए उदाहरण के लिए, बाद में विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर खून और दुकान से प्लाज्मा निकालें.
5. अंग CFU गिनता
- प्रत्येक पूर्व बायोप्सी के नमूने लेने के लिए पीबीएस के 500 μl युक्त ट्यूब homogenizing वजन.
- एक बाँझ बायोप्सी पंच का उपयोग कर प्रत्येक ऊतक से 4 मिमी बायोप्सी के नमूने ले लो.
- 500 μl पीबीएस युक्त preweighed homogenizing ट्यूबों में जगह बायोप्सी. अन्य अंगों के लिए छोटे मोती का उपयोग करें, 2 मिमी मोती के साथ त्वचा के नमूने homogenize.
- शेष टी रखेंमाइक्रोस्कोपी के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% paraformaldehyde (पीएफए) और दुकान में मुद्दों (नीचे देखें).
- (CFU / मिलीग्राम ऊतक के बाद की गणना के लिए) बायोप्सी वजन स्थापित करने के लिए बायोप्सी युक्त ट्यूबों homogenizing वजन.
- नमूने homogenize.
- 30 सेकंड के लिए 6000 rpm पर, जिगर, तिल्ली और मस्तिष्क homogenize.
- 30 सेकंड के लिए 6000 rpm पर त्वचा के नमूने homogenize और यदि आवश्यक हो दोहराएँ.
- अगर प्लेटों पर प्रत्येक homogenizing ट्यूब से dilutions बिखरा हुआ है और अंग CFU मायने रखता है स्थापित करने के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात हो जाना.
6. प्रोटोकॉल / Immunohistochemistry
- नियतन
- 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 4% पीएफए में ऊतकों को ठीक करें नियतन कदम अब हो सकता है, लंबी अवधि के लिए भंडारण के 0.25% पीएफए में ऊतकों जगह.
- पीबीएस में ऊतकों कुल्ला और फिर 20% sucrose के समाधान में डाल दिया और रात भर या ऊतकों समाधान में डूब चुके हैं जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर लौटें.
- (एक ऊतक मोल्ड में या एक बेस बोर्ड का पालन किया या तो) आकार और अक्टूबर समाधान में जगह के लिए कटौती, पीबीएस में ऊतकों को धो लें.
- जल्दी से तरल नाइट्रोजन में तैर एक पेट्री डिश पर ऊतकों फ्रीज.
- ठंड के बाद, भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस तक स्थानांतरण से पहले सूखी बर्फ पर ऊतकों डाल दिया.
- टुकड़ा करने की क्रिया
- -80 डिग्री सेल्सियस से ऊतकों को हटाने और एक cryostat में -20 डिग्री सेल्सियस को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं.
- स्लाइस लगभग 10-15 माइक्रोन की मोटाई के साथ ऊतकों और लेपित माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर जगह है.
- जब तक जरूरत स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड.
- धुंधला हो जाना
- स्लाइड कमरे के तापमान को आने की अनुमति दें.
- एक हाइड्रोफोबिक कलम के साथ स्लाइड पर टुकड़ा चारों ओर आकर्षित. 5-10 मिनट रुको.
- 5 मिनट के लिए पीबीएस में / धोने टुकड़ा rehydrate, दो बार दोहराएँ.
- 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% ट्राइटन में Permeabilize टुकड़ा.
- 5 मिनट के लिए पीबीएस 2-3X में धो लें.
- पीबीएस में ब्लॉक10-60 मिनट के बीच में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एंटीबॉडी या दाग के आधार पर 0.1% ट्राइटन 1% BSA.
- अवरुद्ध बफर निकालें और ब्लॉक बफर में आवश्यक रूप पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें. निर्धारित समय के लिए सेते हैं. (अक्सर 1 कमरे के तापमान पर मानव संसाधन या 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर).
- 5 मिनट के लिए पीबीएस 2-3X में धो लें.
- Bock बफर में उचित रूप में पतला एंटीबॉडी लागू करें; DAPI आम तौर पर इस चरण में शामिल किया गया है. अंधेरे में, निर्धारित समय, अक्सर 1-2 घंटे कमरे के तापमान के लिए सेते हैं.
- 5 मिनट के लिए पीबीएस 2-3X में धो लें.
- एक कवर गिलास के साथ बढ़ते मीडिया की रक्षा फीका में पर्वत और नेल वार्निश के साथ सील.
- छवि पर दाग तुरंत स्लाइड या 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान
- इस्तेमाल किया fluorophores के लिए उपयुक्त फिल्टर लेजर / सेट अप के साथ एक confocal या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग प्रदर्शन.
- ऊतक विज्ञान
- ऊतक विज्ञान कमरे के तापमान पर आने के लिए स्लाइड इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति दें.
- के रूप में प्रयोग दाग स्लाइडtandard hematoxylin / eosin धुंधला प्रोटोकॉल.
- स्लाइड रैक में स्लाइड्स रखें.
- इस क्रम में समाधान के बीच स्लाइड के साथ रैक स्थानांतरण:
- नल का पानी दौड़ में 2 सेकंड.
- फ़िल्टर किया hematoxylin समाधान में 3 मिनट.
- पानी चलाने में 10 सेकंड.
- आसुत जल में 10 सेकंड.
- इथेनॉल 100% में 10 सेकंड.
- फ़िल्टर किया eosin में 2 सेकंड.
- पानी चलाने में 10 सेकंड.
- इथेनॉल 100% में 10 सेकंड
- 2 मिनट xylene एक्स 3 में (स्नान मैं, द्वितीय, तृतीय).
- तुरंत स्थानांतरण और, शीर्ष पर प्रत्येक स्लाइड, जगह कवर पर्ची पर नियतन गोंद की कुछ बूँदें जोड़ने हवाई बुलबुले को दूर, कुछ घंटों के लिए सूखी.
- छवि एक मानक सफेद रोशनी खुर्दबीन के नीचे स्लाइड.
Representative Results
CFU मायने रखता है
एन इन प्रतिनिधि परिणामों में इस्तेमाल किया meningitidis तनाव एन है , OPC - - PilC1 + / PilC2 + 20 meningitidis 8013 क्लोन 12, एक सेरोग्रुप सी नैदानिक अलग, मैं एस.बी. pilin, ओपा एक वर्ग व्यक्त. तनाव एक गुणसूत्र प्रविष्टि 18 से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करने के लिए अंजाम दिया गया था. बैक्टीरियल कॉलोनी बनाने इकाई मायने रखता है अगर प्लेटों पर कालोनियों की संख्या की गणना और रक्त की CFU / एमएल या चढ़ाया जाना जाता संस्करणों से ऊतक के CFU / मिलीग्राम या तो गणना के द्वारा स्थापित कर रहे हैं. खून की गिनती 5 मिनट 10 6 CFU बैक्टीरिया के चतुर्थ इंजेक्शन के बाद रक्त में घूम 1.5 x 10 5 CFU / एमएल के एक औसत (चित्रा 1 ए) वहाँ था कि पता चला है. 6 घंटे के बाद मायने रखता 4.8 x 10 4 CFU / एमएल औसत. 24 घंटा तक औसत मायने रखता 4 CFU / एमएल x 10 2.4 थे लेकिन 10 चूहों के इस समूह में, 5 पड़ाकोई detectable अन्य 5 अपेक्षाकृत अधिक मायने रखता है (चित्रा 1 ए) था, जबकि बैक्टीरिया परिसंचारी. त्वचा के नमूनों से लिया CFU मायने रखता चूहों 2.1 x 10 4 CFU 6 घंटा में ऊतक के / मिलीग्राम और 24 घंटे में ऊतक के 4.4 x 10 2 CFU / मिलीग्राम (चित्रा 1 बी) के औसत, मानव त्वचा में काफी मायने रखता होने के बहुमत दिखाने . contralateral माउस त्वचा के नमूने एन के लिए मजबूत वरीयता का प्रदर्शन, 24 घंटा और 6 घंटा में ही एक बहुत ही कम संख्या में कोई जीवाणु गिनती से पता चला grafted त्वचा (चित्रा 1 बी) में मानव वाहिकाओं को meningitidis. सामान्य में जीवाणु गिनती 2 जानवरों वे उच्च बैक्टीरियल संख्या (चित्रा 1C) परिसंचारी के साथ सहसंबद्ध के रूप में, खून के संक्रमण के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जो शो में गिना जाता था हालांकि जांचा अन्य अंगों में nondetectable के लिए बहुत कम थे. मॉडल भी प्रकार चतुर्थ पीआई उदाहरण के लिए, विवो में विषैलापन कारकों की भूमिका निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैली. परिभाषित TFP कमी तनाव में जिसके परिणामस्वरूप pilD जीन 21 में म्यूटेशन, साथ ही प्रस्तावित TFP 'adhesin' की कमी pilC1 जीन 8, साथ जीवाणु उपभेदों मॉडल में पेश किया गया. ये परिवर्तन TFP विवो (चित्रा -1) में आसंजन में खेल रहा है महत्वपूर्ण भूमिका की पुष्टि, मानव त्वचा भ्रष्टाचार में कोई बैक्टीरियल आसंजन में हुई.
Immunohistochemistry / प्रोटोकॉल
इन प्रयोगों में हम एन इस्तेमाल किया माध्यमिक धुंधला के लिए आवश्यकता के बिना फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए सक्षम करने के लिए हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) व्यक्त कि meningitidis उपभेदों. मानव वाहिकाओं, मानव endothelium के लिए एक मार्कर का उपयोग कर या तो CD31 (PECAM -1) या लेक्टिन Ulex europaeus agglutinin (UEA) 18,22 दाग रहे थे. UEA एक कदम धुंधला (आंकड़े 2A सी) की अनुमति rhodamine संयुग्मित किया गया था. सेल नाभिक दाग जा सकता हैDAPI के साथ एड ऊतक संरचनाओं (आंकड़े 2A बी) की पहचान में मदद करने के लिए. प्रोटोकॉल एक मानक hematoxylin / eosin धुंधला उपयोग किया गया था. त्वचा की एपिडर्मल / त्वचीय सीमा स्पष्ट रूप से पहचान योग्य था. सूजन, घनास्त्रता और संवहनी रिसाव संक्रमण (चित्रा 2 डी) के बाद यह सीमा 24 घंटा के करीब जहाजों के लिए ध्यान केंद्रित किया गया. घनास्त्रता अक्सर भीड़ और सूजन के साथ कई छोटे त्वचीय वाहिकाओं में दिखाई दे रहा था. ऊतकों में बाहर लाल रक्त कोशिकाओं के रिसाव वाहिनियों को नुकसान का एक व्यापक स्तर का संकेत है, देखा जा सकता है. noninfected चूहों में grafted त्वचा की ऊतकविकृतिविज्ञानी कोई अलग पहचाना सूजन 18 के साथ सामान्य दिखाई दिया. संक्रमण के बारे में 30% में त्वचा में बैक्टीरियल आसंजन macroscopically detectable चित्तिता (आंकड़े 2 ई और 2 एफ) का विकास होता है.
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चित्रा 1. CFU मायने रखता है. (ए) के 5 मिनट, 6 घंटा, और 24 घंटे के बाद संक्रमण पर रक्त की मिलीलीटर प्रति बैक्टीरियल CFU मायने रखता है. (बी) बैक्टीरियल CFU 6 घंटा और 24 घंटे के बाद संक्रमण दोनों में मानव त्वचा (एचएस) और माउस त्वचा (एमएस) की तुलना त्वचा के नमूनों से गिना जाता है. (सी) बैक्टीरियल CFU अन्य अंगों 24 घंटा बाद संक्रमण लिया से गिना जाता है. जंगली प्रकार एन से संक्रमित चूहों से 24 घंटे के बाद संक्रमण पर लिया मानव और माउस त्वचा के नमूनों से जीवाणु CFU मायने रखता मुकाबले (डी) meningitidis 2C43 दाग (WT), pilD जीन (pilD) या pilC1 जीन (pilC1) में एक परिवर्तन के साथ एक तनाव में एक परिवर्तन के साथ एक तनाव. सभी रेखांकन औसत के साथ कच्चे डेटा के रूप में दिखाया गया है. चित्रा Melican एट अल. 18 से संशोधित किया गया है"_blank"> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. त्वचीय (डी) एपिडर्मल (ई) की सीमा के करीब UEA लेक्टिन (लाल) के साथ दाग एक मानव microvessel दिखा एक confocal ढेर के माइक्रोस्कोपी. (ए) प्रोजेक्शन. पोत एन से संक्रमित है meningitidis (हरा) 2 घंटा बाद संक्रमण. (बी) एक ऑप्टिकल टुकड़ा और एन दिखा एक टुकड़ा प्रक्षेपण (सी) meningitidis microcolonies (हरा) संक्रमण एक मानव पोत (UEA - लाल) एक त्वचा भ्रष्टाचार 2 घंटा के बाद संक्रमण के भीतर. मानव त्वचा भ्रष्टाचार की (डी) Haematoxylin / eosin धुंधला एन के साथ 24 घंटे के लिए संक्रमित meningitidis. एपिडर्मल (ई), त्वचीय (डी) की सीमा स्पष्ट रूप से दिखाई और व्यापक घनास्त्रता और microvess की भीड़ हैएल्स (तीर) dermis में देखा जाता है. सूजन और कुछ संवहनी रिसाव (Arrowhead) भी पहचाना जा सकता है. (ई) पूर्व संक्रमण के लिए मानव त्वचा भ्रष्टाचार. (एफ) एन के साथ (ई) 24 घंटे के बाद संक्रमण के रूप में ही त्वचा भ्रष्टाचार शीतादि संबंधी क्षेत्रों (तीर) दिखा meningitidis. 2 बी, 2 डी, 2 ई, और 2 एफ Melican एट अल. 18 से संशोधित कर रहे आंकड़े बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Discussion
पशु मॉडल बैक्टीरियल रोगजनन अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं. यह पूरी तरह से सेल संस्कृति में vivo वातावरण में नकल करने के लिए असंभव है और यह मेजबान रोगज़नक़ बातचीत कई गतिशील कारकों से प्रभावित होता है कि स्पष्ट होता जा रहा है. ऐसी एन के रूप में कुछ नैदानिक महत्वपूर्ण रोगजनकों के मानव विशिष्टता meningitidis, एचआईवी, एचसीवी, प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम, लिस्टेरिया monocytogenes, और साल्मोनेला typhi इन संक्रमणों के लिए vivo मॉडल का उपयोग सीमित है. हम संक्रामक कदम विशिष्टता में शामिल किया जाता है जो समझने के लिए शुरू के रूप में हालांकि, humanized मॉडल विकसित किया जा रहा है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एन के साथ विवो संक्रमण में व्यापक लिए अनुमति देता है, चूहों में मानव microvessels की शुरूआत के साथ इस का एक प्रदर्शन है meningitidis, संवहनी नुकसान और कभी कभी शीतादि संबंधी चकत्ते के विकास में जिसके परिणामस्वरूप.
इस मॉडल का उपयोग करना,हम TFP के चिपकने वाला गुण बैक्टीरियल म्यूटेंट का उपयोग और संवहनी नुकसान आसंजन 18 के अभाव में कम हो जाता है कि द्वारा vivo में संवहनी उपनिवेशन में शामिल कर रहे हैं परिभाषित करने में सक्षम है. इससे पहले, परिसंचारी बैक्टीरियल उत्पादों इस नुकसान में शामिल किया गया है लेकिन हमारे परिणाम बताते हैं कि स्थानीय आसंजन और संवहनी उपनिवेशन के लिए एक निर्णायक भूमिका सुझाव देते हैं. इस उपन्यास उपचार लक्ष्य के विकास के लिए नई संभावनाएं खुलती हैं. रोगजनक बैक्टीरिया के आसंजन pharmaceutically अवरुद्ध किया जा सकता है, तो यह संभवतः त्वचीय घावों के विकास को रोकने और ऊतक परिगलन, क्षतशोधन और amputations के मामले में मेनिंगोकोक्सल बचे के लिए बेहतर परिणाम के लिए ले जा सकता है. काम भी संक्रमण की जटिलता और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और जमावट झरना की भागीदारी का प्रदर्शन किया है. हम वर्तमान मानव अन्तःचूचुक 18 की अपेक्षाकृत छोटी राशि के बावजूद संक्रमित चूहों के सीरम में मानव साइटोकाइन संकेतन पहचान की.इस क्षेत्र में माउस प्रतिरक्षा सेल आबादी की घुसपैठ के साथ साथ, एक महत्वपूर्ण साइटोकाइन प्रतिक्रिया संकेत दिया.
पशु मॉडल का पाठ्यक्रम पूरी तरह से मानव रोग दोहराने कभी नहीं कर सकते हैं और सभी के परिणाम को ध्यान में रखते विचार किया जाना चाहिए उन लोगों से हुई. उदाहरण के लिए, इस मॉडल में रक्त और परिसंचारी कोशिकाओं माउस मूल के हैं और हम वे मानव कोशिकाओं को अलग तरीके से व्यवहार कर सकते हैं कि नहीं छूट सकता है. इस का एक लाभ यह है कि हालांकि, हमारे हाल के प्रकाशन के 18 में प्रदर्शन के रूप में, परिसंचारी माउस कोशिकाओं की है कि मानव अन्तःचूचुक से संकेत उद्भव अंतर करने की क्षमता है. इस मॉडल में इस्तेमाल चूहों के प्रतिरक्षा में पृष्ठभूमि भी एक और 'मानवीकरण' पहलू जोड़ने, मानव प्रतिरक्षा सेल आबादी के allogenic हस्तांतरण के लिए अनुमति होगी. चूहों के प्रतिरक्षा में पृष्ठभूमि हालांकि सभी की कमी या इस मॉडल में खराब कर रहे हैं जो एन.के., टी या बी कोशिकाओं, के लिए एक भूमिका मुखौटा हो सकता है. अपेक्षाकृत शोरइस मॉडल में इस्तेमाल टी समय सीमा (24 घंटे) मुख्य रूप से सहज प्रतिक्रिया का सवाल है, लेकिन लंबी अवधि के संक्रमण और प्रतिरक्षा अन्य विकल्प के विकास के लिए पता लगाया जाना पड़ सकता है.
त्वचा एन के लिए एक महत्वपूर्ण संक्रमण साइट है meningitidis लेकिन मानव जहाजों की एक अपेक्षाकृत छोटी राशि वाले भी कई अंगों से जुड़े एक प्रणालीगत संक्रमण के लिए डेटा extrapolating मुश्किल है कि इसका मतलब है. इस मॉडल त्वचीय घाव विकास के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, इस तरह के उपकला और रक्त मस्तिष्क को पार करने के रूप में मेनिंगोकोक्सल संक्रमण का महत्वपूर्ण कदम शामिल नहीं हैं. इन humanized मॉडल के आगे विकास के संक्रमण के इन अन्य पहलुओं का पता करने की जरूरत है. फिर भी इस मॉडल में कई मानव विशिष्ट रोगजनकों, रक्त वाहिकाओं को लक्षित विशेष रूप से उन लोगों के लिए महान क्षमता प्रदान करता है.
Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.
Acknowledgments
लेखकों पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Dumenil प्रयोगशाला के सभी सदस्यों, विशेष रूप से सिल्क सिल्वा को धन्यवाद देना चाहूंगा. Hôpital Europeen जार्ज-Pompidou (HEGP), डॉ. डेविड Maladry में सर्जरी विभाग. माइकल Hivelin और डॉ. पैट्रिक Bruneval, HEGP में पैथोलॉजी विभाग. एलिजाबेथ Huc की अध्यक्षता PARCC में जानवरों की सुविधा,. इस काम के बाद अनुदान एजेंसियों द्वारा समर्थित किया गया था: मैरी क्यूरी आईईएफ फेलोशिप नहीं. 273223 (किमी), INSERM से ATIP-Avenir अनुदान, CODDIM उपकरण अनुदान (Ile डी फ्रांस क्षेत्र), एफ आर एम उपकरण अनुदान, उत्कृष्टता संघ के IBEID प्रयोगशाला (Fondation ला सभ्य médicale डालना), ANR अनुदान "(एजेंस नेशनल ला Recherche डालना) कीड़े में प्रवाह ". funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
| Ketamine 500 | Virbac France | lot no. VAL4243 | |
| Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | lot no. KPO809S |
| Optigel | Europhta | ||
| Lacrigel | Medicament Autorisé | ||
| Tronothane | Lisa Pharma | ||
| GC agar base | Conda | 1106 | |
| Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
| Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| UEA lectin - rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
| Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
| Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
| Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
| Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
| MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
| MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
| VECTASHIELD mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
| OCT tissue tek | Sakura | 4583 |
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