Summary
Neisseria meningitidis er en human spesifikt patogen som infiserer blodkar. I denne protokollen menneskelige microvessels er innført i en mus ved å pode menneskelig hud på immunkompromitterte mus. Bakterier holder seg i stor grad til de menneskelige fartøy, som fører til vaskulære skader og utvikling av purpura utslett vanligvis observert i humane tilfeller.
Abstract
Neisseria meningitidis forårsaker en alvorlig, ofte dødelig sepsis når den kommer inn i menneskets blodstrømmen. Infeksjon fører til omfattende skader på blodårene som fører til vaskulær lekkasje, utvikling av purpura utslett og eventuell vevsnekrose. Studerer patogenesen av denne infeksjonen ble tidligere begrenset av human spesifisiteten av bakterier, noe som gjør in vivo-modeller vanskelig. I denne protokollen, beskriver vi en humanisert modell for denne infeksjonen der menneskelig hud, som inneholder dermal microvessels, er podet inn immunsupprimerte mus. Disse fartøyene anastomoserer med musen sirkulasjon og samtidig opprettholde sine menneskelige egenskaper. Når introdusert i denne modellen, N. meningitidis holder seg utelukkende til de humane fartøy, noe som resulterer i omfattende vaskulære skader, inflammasjon og i noen tilfeller utvikling av purpura utslett. Denne protokollen beskriver pode, infeksjon og evaluerings trinn av denne modellen i context av N. meningitidis infeksjon. Teknikken kan anvendes på tallrike humane spesifikke patogener som infiserer i blodstrømmen.
Introduction
Meningokokk sepsis er en ofte dødelig blod født infeksjon forårsaket av bakteriell patogen Neisseria meningitidis. Meningokokk sepsis pasienter ofte har en petekkial eller purpura utslett på huden deres som tidligere har vært assosiert med vaskulær ødeleggelser forårsaket av sirkulerende bakterier og bakterielle produkter en. Hud biopsier fra kliniske pasienter viser bakterier assosiert med microvessels, ofte fylle skipene to. Bortsett fra bakterier, omfattende trombose, koagulering, lunger og vaskulær lekkasje er sett i purpura regionene 3-5. Denne vaskulære skader kan føre til utstrakt nekrose på huden og omkringliggende vev, noe som resulterer i debridement og selv amputasjon i meningokokk overlevende. Forstå hvordan infeksjonen forårsaker denne vaskulære skader er viktig å optimalisere forebygging og behandling strategier. Flertallet av forskning på meningokokk sepsis har blitt utført in vitro påhumane cellelinjer på grunn av den menneskelige spesifisiteten av N. meningitidis. Mange sider ved infeksjon har blitt studert in vitro, inkludert bakteriell adhesjon, vertscellerespons, så vel som cytokin response 6-9. Type IV pili (Tfp) har vært innblandet som den store vedheft organeller for N. meningitidis både epitel-og endotelceller 10. Det har også blitt vist at adhesjonen av N. meningitidis til vertsceller er skjærspenning avhengig og er derfor antatt å være relatert til blodstrømningsrater i microvasculature 11. Dette tyder på de dynamiske påkjenninger bakteriene møter in vivo er avgjørende for patogenesen. Det er imidlertid svært vanskelig å modellere mikromiljøet av små fartøyer in vitro.
Adhesjonen reseptor for Neisseria Tfp er fortsatt ukjent og derfor slag strategier for å oppnå bakteriell adhesjon i en dyremodell, kan ikke tenkes på dette tidspunktet. CD46 ble foreslått å være Tfp reseptoren og transgene dyr ble produsert for å fungere som musemodeller. Imidlertid, infeksjon hos disse dyrene ikke føre til omfattende infeksjon eller utslett utvikling 12,13. Andre dyremodeller som har blitt beskrevet for bakteriemi aspekt av Neisseria infeksjon ta hensyn til den bakterie preferanse for human transferrin som en jernkilde 14,15. Enten supplere menneskelige transferrin eller uttrykke det fra et transgen medfører økt bakteriemengde i blodet over en lengre tidsperiode, men denne modellen viser ingen bakteriell adhesjon eller utslett utvikling 16,17.
I denne protokollen, beskriver vi en humanisert musemodell hvor menneskelig hud, inkludert dermal microvasculature, er transplantert inn immunsupprimerte mus 18,19. Dette resulterer i funksjonelle menneskelige fartøy, perfusert med musen sirkulasjon. Kombinert med humant transferrin tilskudd, dette mOdel står for minst to av de menneskelige spesifikke aspekter av N. meningitidis, dvs. human endotel-og human transferrin, i et in vivo miljø. N. meningitidis innført intravenøst i denne modellen holder seg spesifikt til human endotel, som produserer en patologi som ligner det som er rapportert i kliniske pasienter, bl.a. vaskulære skader og purpura utslett utvikling 18..
Protocol
En. Risiko og tillatelser
- Lokale etikkomiteer må godkjenne alle dyre protokoller. Denne protokollen ble gjennomført i henhold til retningslinjer fastsatt av den franske og europeiske reglene for behandling og bruk av forsøksdyr (Décrets 87-848, 2001-464, 2001-486 og 2001-131 og EU-direktiv 2010/63/UE) og godkjent av den lokale etiske komité Comité d'Ethique en matière d'Eksperimentering Animale, Universite Paris Descartes, Paris, Frankrike. No: CEEA34.GD.002.11.
- For menneskelig hud, ble skriftlig informert pasienten samtykke innhentes og alle prosedyrer ble utført i henhold til franske nasjonale retningslinjer og godkjent av den lokale etiske komité, Comité d'Evaluation Ethique de l'INSERM IRB 00003888 FWA 00005881, Paris, Frankrike Opinion: 11-048 .
- N. meningitidis er en potensielt skadelig menneskelig patogen og alle nødvendige forholdsregler må tas ved håndtering av organisamekanismen. Disse forholdsreglene inkluderer vaksinasjon og arbeider under biosikkerhet nivå to forhold.
2. Skin Graft
- Samle menneskelig hud så nær pode tid som mulig. Flertallet av huden i dette arbeidet kommer fra plastisk kirurgi operasjoner som involverer mageområdet. Andre kilder som for eksempel bryst, ben og ansikt og med har vært brukt med hell.
- Klargjør det menneskelige hud prøven ved å rense hudoverflaten med 70% EtOH og ligge flatt på en godt rengjort overflate, fortrinnsvis under en strømningshette.
- Skjær 200-400 mikrometer skiver fra toppen av huden ved hjelp av en dermatom med bestemt tykkelse.
- Sjekk huden skiver for integritet og skjær dem i 2 cm x 2 cm kvadrater, deretter plassere i PBS (uten toverdige kationer) hvis pode umiddelbart eller ved 4 ° C i DMEM med 10% serum for korttidslagring (3-12 hr ).
- Anaesthetize 6-8 uker gamle SCID.bg-mus (ca. 20 g) med ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injected ip
- Når musene er bedøvet, sjekk for smerterespons ved å utføre en tå klype, en standard metode for å etablere smerte refleks. Påfør gel til øynene for å forhindre hornhinnen tørking og barbere venstre side av dyret bak skulderen, der pode skal plasseres. Hold muse varm på en varmepute gjennom hele prosedyren.
- Etter prepping musen for kirurgi, rense det barberte området med 70% EtOH.
- Påfør lokalbedøvelse topically å pode hotellet (Tronothane) og forberede pode området ved å forsiktig fjerne det overfladiske lag av mus hud med et par buede saks. Vær forsiktig så du ikke å forstyrre den underliggende blodkar.
- Fjerne folien i et område som er litt mindre enn arealet av den menneskelige hud skive.
- Fjern skinnet skive fra PBS (eller DMEM) og plassere over graft seng, sikre epidermal siden vender opp. Steps 02.08 til 02.10 bør utføres så raskt som mulig, slik pode seng ikke tørker ut.
- Juster ett hjørneeller kanten og fikse med vev lim. Passe nøye resten av huden skive til pode-seng, å plassere små mengder vevslim rundt kantene. Alltid trimme den menneskelige huden til størrelse i stedet for å gjøre det pode seng større.
- Ikke dra huden strammer over graft seng som mus huden er svært fleksibel.
- Kontroller at pode er fast med vev lim i hvert hjørne.
- Rengjør området med en jod-løsning.
- Påfør et plaster med puten området over graft. Kontroller at Band-Aid er fast, men ikke stramt og at pusten dyrets påvirkes ikke.
- Fest Band-Aid med dressing tape.
- Tillater dyret å komme seg på en varm overflate.
- Når de er våkne, gå tilbake dyret til buret sitt. Dyr er plassert 2-3 per bur.
- Sjekk mus jevnlig under gjenoppretting etter tegn på smerte eller ubehag. 10-14 dager etter pode, fjerne Band-Aid, være forsiktig for ikke å forstyrre pode. I vår erfaring postoperativ smerte er minimal. Likevel dyr skal overvåkes hver dag spesielt i de få dagene etter operasjonen. Kriterier for smerte eller ubehag er følgende.
- Tap av vekt over 10%
- Fysiske utseende, pels, pukkelryggen posisjon, øyne
- Økt åndedrett eller hjerte priser
- Redusert eller uvanlige bevegelser.
- Økning i kroppstemperatur
- I tilfelle tegn på smerte detekteres paracetamole administreres oralt (300 mg / kg, hver 4. time). Humane endepunkter er strengt overholdt hvis smertene vedvarer.
- Hvis pode ser tørr gjelder babyolje hver 2-3 dager for å holde huden myk.
- Transplantasjonen er klar for eksperimentering 21 dager etter transplantat.
Tre. Infeksjon
- Dagen før infeksjonen, forberede bakteriestammen ved å stryke på GCB agar plater med passende antibiotika. Vokse over natten ved 37 ° C i 5% CO 2.
- Bakterier forberedelse
- Inkuber under risting i 2 timer i inkubator (37 ° C i 5% CO 2) med løst lokk, til en bakterietetthet på ca OD 600 0,1.
- Sentrifuger bakterier for 3 min 15 000 rpm.
- Fjern supernatanten og resuspender i PBS, deretter sentrifuger igjen.
- Gjenta vasketrinn (2.2.4-2.2.5) to ganger.
- Resuspender bakteriell pellet i PBS.
- Mål OD 600.
- Foreta en kultur av enten OD 600 0,1 (10 8 CFU / ml), eller i OD 600 1.0 (10 9. CFU / ml). Fra denne kjente konsentrasjon, fortynnet til 10 7 cfu / ml. Prøv å forberede bakterier så nær injeksjons tid som mulig.
- Vei mus.
- Anaesthetize mus med ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injisert ip
- Når sover, cpokker at smerten respons er fraværende av en tå-klemme, holde musene varm med en varmepute og sette øyesalve på å hindre uttørking.
- Gi hver mus 8 mg av human transferrin, resuspendert i saltvann eller PBS, injisert ip
- Ta en liten dråpe blod fra halen, og å spre seg opp på en agar-plate for å kontrollere blod er steril før infeksjon.
- Injisere 100 mL 10 7 CFU / ml bakteriekultur (10 6 CFU totalt) intravenøst via retro-orbital eller hale vene. Målinger av CFU tatt 5 min etter injeksjonen er konsistente uavhengig av injeksjonssted.
- Etter noen få minutter, snip haleenden og spre blodprøve på agarplater med egnede antibiotika med en 10-ganger fortynning for å etablere blod CFU umiddelbart etter infeksjon.
- Tett halen med vev lim.
- Etter injeksjon, fortynne bakteriell pode og spredt på agar plater med passende antibiotika for å etablere CFU.
- Tillat museneå gjenopprette på en varmepute til de er opp og flytte
- Ved 6 timers post-infeksjon trekke en liten mengde blod fra halen, fortynnede og platen for å etablere CFU ved 6 timer.
- Inkuber alle agarplater ved 37 ° C i 5% CO2 over natten.
4. Sacrifice
- På det valgte tid for infeksjon, anaesthetize mus med Ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injisert ip
- Når sover, holde muse varm med en varmepute.
- Når smerten refleks har gått (tå-pinch), klipp enden av halen og trekke blod.
- Spre blod på agar plater med passende antibiotika, 5 mL direkte og 10 mL 1:10 fortynning å etablere CFU.
- Sacrifice musen ved halshugging.
- Etter å ofre musen i henhold til alle relevante institusjonelle og etiske retningslinjer, bekrefter død av mangel på hjerteslag. Gjør et midtlinjesnitt skjære gjennom brystkassen, og lage et snitt i hjt.
- Samle så mye blod som mulig fra hjertet / brysthulen og sted i et sterilt rør.
- Fjern organer (f.eks lever, milt, hjerne) i en steril plate.
- Fjern skin graft og en del av muse-skin til det sterile plate.
- Kvitt deg med musekroppen.
- Når det oppsamlede blod er blitt tillatt å koagulere i 15 minutter, sentrifuger det 15 minutter ved 3000 rpm.
- Fjern plasma fra blod og oppbevar ved -80 ° C for senere analyser, for eksempel for cytokin deteksjon av ELISA eller FACS baserte metoder.
5. Organ CFU Counts
- Vei homogen rør som inneholder 500 mL PBS hver før du tar biopsiprøver.
- Ta 4 mm biopsiprøver fra hver vev ved hjelp av en steril biopsi punch.
- Plasser biopsier i veid på forhånd homogenisering rør som inneholder 500 mL PBS. Homogenisere huden prøver med 2 mm perler, bruker mindre perler for andre organer.
- Plasser de resterende tproblemstillinger i 4% Paraformaldehyde (PFA) og oppbevar ved 4 ° C for mikroskopi (se nedenfor).
- Vei homogenisering rør innehold biopsier for å etablere biopsi vekt (for senere beregning av CFU / mg vev).
- Homogenisere prøvene.
- Homogen lever, milt og hjernen, ved 6000 opm i 30 sek.
- Homogen hudprøver ved 6000 rpm i 30 sekunder og gjentar om nødvendig.
- Spre fortynninger fra hver homogenisere rør på agar plater og vokse over natten ved 37 ° C i 5% CO 2 for å etablere organ CFU teller.
6. Histologi / Immunhistokjemi
- Fiksering
- Fest vev i 4% PFA natten ved 4 ° C. Fikseringstrinnet kan være lengre, hvis lagring i lengre perioder sette vevene i 0,25% PFA.
- Skyll vev i PBS, og deretter i 20% sukrose-løsning og går tilbake til 4 ° C over natten eller inntil de vev har senket i oppløsningen.
- Vask vev i PBS, klippes til størrelse og plass i oktober-løsning (enten i en vev mugg eller levd opp til en basiskort).
- Raskt fryse vevet på en petriskål som flyter i flytende nitrogen.
- Etter frysing, sett i vev på tørris før overføring til -80 ° C for lagring.
- Slicing
- Fjerne vev fra -80 ° C og tillates å stabilisere seg til -20 ° C i en kryostat.
- Slice vev med en tykkelse på ca 10-15 mikrometer og plasser den på belagte mikros lysbilder.
- Butikken glir ved -20 ° C inntil nødvendig.
- Farging
- Tillat lysbilder å komme til romtemperatur.
- Tegn rundt stykket på lysbildet med en hydrofob penn. Vent 5-10 min.
- Rehydrere / vask skive i PBS i 5 minutter, gjenta to ganger.
- Permeabilize skive i 0,1% Triton i PBS i 10 min.
- Vask i PBS 2-3x i 5 min.
- Blokker i PBS0,1% Triton 1% BSA til mellom 10 til 60 min avhengig av antistoffet eller flekken som skal brukes.
- Fjern blokkering buffer og legge primære antistoffet fortynnes slik det kreves i blokk buffer. Inkuber for bestemt tid. (Ofte 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C).
- Vask i PBS 2-3x i 5 min.
- Påfør sekundært antistoff fortynnes som hensiktsmessig i Bock buffer; DAPI er vanligvis inkludert i dette trinnet. Inkuber i bestemt tid, ofte 1-2 hr romtemperatur, i mørke.
- Vask i PBS 2-3x i 5 min.
- Mount i fade beskytte montering media med et dekkglass og forsegle med neglelakk.
- Bilde farget lysbilder straks eller oppbevar ved 4 ° C.
- Utfør bildebehandling med en confocal eller fluoriserende mikroskopi satt opp med filtre / lasere som passer til fluorophores brukes.
- Histologi
- Tillat lysbilder som skal brukes for histologi til å komme til romtemperatur.
- Stain lysbilder ved hjelp somtandard hematoxylin / eosin farging protokollen.
- Plasser lysbildene i lysbilde rack.
- Overfør rack med lysbilder mellom løsninger i følgende rekkefølge:
- 2 sek i rennende vann fra springen.
- 3 min i filtrert hematoxylin løsning.
- 10 sek i rennende vann.
- 10 sekunder i destillert vann.
- 10 sek til etanol 100%.
- 2 sek inn filtrert eosin.
- 10 sek i rennende vann.
- 10 sek i etanol 100%
- 2 min i xylen x 3 (bad I, II, III).
- Overfør umiddelbart og legge noen dråper av fiksering lim på hver lysbilder, sted dekkglass på toppen, fjerne luftbobler, la tørke i noen timer.
- Bildet glir under en standard hvitt lys mikroskop.
Representative Results
CFU teller
Den N. meningitidis stamme brukt i disse representative resultater er N. meningitidis 8013 klone 12, en serogruppe C klinisk isolat, uttrykker en klasse jeg SB Pilin, Opa -, OPC -, PilC1 + / PilC2 + 20. Den belastningen hadde blitt utviklet for å uttrykke grønt fluorescerende protein (GFP) fra en kromosom innsetting 18. Bakterielle kolonidannende enhetstellinger er etablert ved å telle antallet av kolonier på agarplater, og beregning av enten CFU / ml blod eller CFU / mg vev fra de kjente volumer belagt. Blodtellinger viste at 5 min etter intravenøs injeksjon av 10 6 CFU bakterier var det et gjennomsnitt på 1,5 x 10 5 CFU / ml som sirkulerer i blodet (fig. 1A). Etter seks timers teller i gjennomsnitt 4,8 x 10 4 CFU / ml. Etter 24 timers gjennomsnittlig tellinger var 2,4 x 10 4. CFU / ml, men i denne gruppe på 10 mus, 5 haddeingen påvisbar sirkulerende bakterier, mens den andre 5 hadde relativt høye tellinger (Figur 1a). CFU tellinger tatt fra hud-prøver viser at mesteparten av musene som har betydelige tellinger i den menneskelige hud, gjennomsnittlig 2,1 x 10 4. CFU / mg vev ved 6 timer og 4,4 x 10 2 CFU / mg vev i 24 timer (figur 1B) . Kontralateral muse hud prøvene viste ingen bakterietall på 24 timer og bare et svært lavt antall på 6 timers, demonstrere sterk preferanse for N. meningitidis til de menneskelige fartøy i podet huden (Figur 1B). Generelt bakterietall var meget lav til ikke detekterbar i de andre organer samplet selv om to dyr gjorde viser tellinger som kan tilskrives forurensning fra blod, slik de er korrelert med høye sirkulerende bakterietall (figur 1C). Modellen kan også brukes til å bestemme betydningen av virulens faktorer in vivo, for eksempel av type IV pili. Bakterielle stammer med definerte mutasjoner i pilD gen 21, som resulterer i en stamme som mangler Tfp, samt pilC1 gen 8, som mangler den foreslåtte Tfp "adhesin" ble introdusert inn i modellen. Disse mutasjonene medførte ingen bakteriell heft i den menneskelige huden pode, bekrefter den avgjørende rollen Tfp spiller i heft in vivo (figur 1D).
Immunhistokjemi / Histologi
I disse forsøkene brukte vi N. meningitidis-stammer som uttrykker grønt fluorescens-protein (GFP) for å muliggjøre fluorescerende påvisning uten behov for sekundære flekker. Menneske fartøy ble farget med en markør for menneskelig endotelet, enten CD31 (PECAM-1) eller lektin Ulex europaeus agglutinin (UEA) 18,22. UEA ble konjugert til rhodamin slik at ett-trinns flekker (Tall 2A-C). Cellekjerner kan flekkeed med DAPI å bidra til å identifisere vev strukturer (Tall 2A-B). Histologi ble utført ved hjelp av en standard hematoxylin / eosin farging. Epidermal / dermal grensen av huden var klart identifiserbar. Betennelser, tromboser og vaskulær lekkasje ble konsentrert til fartøyer i nærheten av denne kant 24 timer etter infeksjon (figur 2D). Trombose var synlig i flere små dermal fartøy, ofte ledsaget av lunger og betennelser. Lekkasje av røde blodlegemer ut i vevet kunne ses, noe som indikerer en omfattende grad av skade på fartøyet. Den histopatologi av podet hud i noninfected mus dukket normal uten identifiserbar betennelse 18. I omkring 30% av infeksjonene bakteriell adhesjon i huden fører til utvikling av makroskopisk påvisbar purpura (figurene 2E og 2F).
"5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg" />
Figur 1. CFU teller. (A) Bacterial CFU tellinger per ml blod på 5 min, i 6 timer, og 24 timer etter infeksjon. (B) Bacterial CFU teller fra hudprøver sammenlikner menneskehud (HS) og mus skin (MS) ved både 6 timer og 24 timer etter infeksjon. (C) Bacterial CFU teller fra andre organer tatt 24 timer etter infeksjon. (D) Sammenligning av bakterielle CFU teller fra mennesker og mus huden prøver tatt ved 24 timers innlegg smitte fra mus infisert med villtype N. meningitidis 2C43 flekk (WT), en stamme med en mutasjon i genet pilD (pilD) eller en stamme med en mutasjon i genet pilC1 (pilC1). Alle grafer vises som rådata med median. Figuren er modifisert fra Melican et al. 18"_blank"> Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Mikroskopi. (A) projeksjon av en konfokal stabel som viser et humant microvessel farget med UEA lektin (rød) nær den dermale (d) epidermal (e) kant. Fartøyet er infisert med N. meningitidis (grønn) 2 timer etter infeksjon. (B) En optisk skive og en skive projeksjon (C) viser N. meningitidis-mikro (grønn)-infeksjon en menneskelig fartøy (UEA - rød) innenfor en hud pode 2 hr etter infeksjon. (D) haematoxylin / eosin farging av menneskelig hud pode smittet for 24 timer med N. meningitidis. Epidermal (e), er dermal (d) grensen godt synlig og omfattende trombose og opphopning av microvessels (piler) er sett i dermis. Inflammasjon og noen vaskulær lekkasje (pilspiss) kan også identifiseres. (E) Humant skin graft før infeksjon. (F) Den samme skin graft som (E) 24 timer etter infeksjon med N. meningitidis viser purpura regioner (piler). Figurene 2B, 2D, 2E, og 2F er endret fra Melican et al. 18 Klikk her for å se større bilde .
Discussion
Dyremodeller er kritisk viktig å bakteriell patogenesen forskning. Det er umulig å fullt ut etterligne in vivo miljøet i cellekultur, og det blir tydelig at host-patogen interaksjon er påvirket av mange dynamiske faktorer. Den menneskelige spesifisiteten av noen klinisk viktige patogener, som for eksempel N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes, og Salmonella typhi har begrenset bruken av in vivo-modeller for slike infeksjoner. Men, som vi begynner å forstå hvilke smittsomme trinn er involvert i spesifisitet, humanisert modeller er under utvikling. Protokollen er beskrevet her er en demonstrasjon av dette med innføringen av menneskelige microvessels i mus, noe som åpner for omfattende in vivo infeksjon med N. meningitidis, noe som resulterer i vaskulær skade og noen ganger utviklingen av purpura utslett.
Ved hjelp av denne modellen,Vi har vært i stand til å definere det klebende egenskaper Tfp er involvert i vaskulære kolonisering in vivo ved hjelp av bakterie-mutanter, og at den vaskulære skade er redusert i fravær av adhesjon 18. Tidligere har sirkulert bakterielle produkter vært innblandet i denne skaden, men våre resultater tyder på en avgjørende rolle for lokale vedheft og vaskulær kolonisering. Dette åpner nye muligheter for utvikling av nye behandlingsmålene. Hvis vedheft av sykdomsfremkallende bakterier kan bli blokkert farmasøytisk det kunne hindre utvikling av dermal lesjoner og føre til bedre resultater for meningokokk overlevende i form av vevsnekrose, debridement og amputasjoner. Arbeidet har også demonstrert kompleksiteten av infeksjonen og involvering av immunrespons og koagulasjonskaskaden. Vi identifiserte humant cytokin signalering i serum hos infiserte mus til tross for den relativt lille mengde av human endotel tilstede 18..Dette indikerte en signifikant cytokin reaksjon, sammen med infiltrasjon av museimmuncellepopulasjoner inn i området.
Dyremodeller kan selvsagt aldri fullt gjenskape menneskelig sykdom og alle resultatene fått fra dem må vurderes med dette i tankene. For eksempel, i denne modellen blodet og sirkulerende celler er av mus opprinnelse, og vi kan ikke bort fra at de kan oppføre seg annerledes enn menneskeceller. En fordel med dette er imidlertid, som vist i våre nylig publikasjon 18, er evnen til å skille signalnettverk som stammer fra human endotel fra det av de sirkulerende museceller. Den immunkompromittert bakgrunn av musene som brukes i denne modellen vil også gi rom for allogenic overføring av menneskelige immuncellepopulasjoner, og legger et ytterligere "menneskeliggjøring" aspektet. Den immunkompromittert bakgrunn av musene kan imidlertid maskere en rolle for NK, T eller B-celler, som alle mangler eller defekte i denne modellen. Den relativt Short tidsramme (24 timer) som brukes i denne modellen gjelder i hovedsak medfødt respons, men for langsiktige infeksjoner og utvikling av immunitet andre alternativer må kanskje bli utforsket.
Huden er et viktig område for infeksjon N. meningitidis, men med en relativt liten mengde av humane fartøy innebærer også at ekstrapolere data til en systemisk infeksjon som involverer en rekke organer er vanskelig. Selv om denne modellen gjør det mulig for studiet av dermal lesjon utvikling, er viktige skritt av meningokokkinfeksjon som epithelial og blod-hjerne-krysset ikke inkludert. En videre utvikling av disse humaniserte modellene er nødvendig for å løse disse andre aspekter av infeksjonen. Likevel er dette modellen tilbyr et stort potensial for mange menneskelige spesifikke patogener, særlig rettet mot blodkar.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke alle medlemmer av Dumenil lab, spesielt Silke Silva for kritisk lesing av manuskriptet. I operasjonsavdelingen ved Hôpital Européen Georges-Pompidou (HEGP), Dr. David Maladry. Michael Hivelin og Dr. Patrick Bruneval, Patologiavdelingenn på HEGP. Dyret anlegget på PARCC, ledet av Elizabeth Huc. Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskuddsordninger etater: Marie Curie IEF fellesskap nei. 273223 (KM), ATIP-Avenir Grant fra INSERM, CODDIM utstyrsstipend (Ile de France-regionen), FRM (Fondation pour la recherche Medicale) utstyrsstipend, den IBEID Laboratory of excellence konsortium, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) stipend " Bugs-i-flow ". Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
| Ketamine 500 | Virbac France | lot no. VAL4243 | |
| Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | lot no. KPO809S |
| Optigel | Europhta | ||
| Lacrigel | Medicament Autorisé | ||
| Tronothane | Lisa Pharma | ||
| GC agar base | Conda | 1106 | |
| Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
| Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| UEA lectin - rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
| Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
| Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
| Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
| Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
| MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
| MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
| VECTASHIELD mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
| OCT tissue tek | Sakura | 4583 |
References
- Davis, C. E., Arnold, K. Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura. J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).
- Mairey, E., et al. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J. Exp. Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Brandtzaeg, P., van Deuren, M. Classification and pathogenesis of meningococcal infections. Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).
- Guarner, J., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays. Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Hill, W. R., Kinney, T. D. The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study. J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).
- Capecchi, B., et al. Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells. Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).
- Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells. Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).
- Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule. Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).
- Taha, M. K. Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells. Cytokine. 12, 21-25 (2000).
- Kirchner, M., Meyer, T. F. The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor. Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).
- Mikaty, G., et al. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, (2009).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells. Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host's protein. Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Murray, A. G., et al. Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).
- Nassif, X., et al. Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells. Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).
- Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis. Genome Res. 13, 391-398 (2003).
- Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment. J. Exp. Med. 192, 1205-1211 (2000).
