Summary
Neisseria Meningitidis является человеком специфических патогенов, который инфицирует кровеносные сосуды. В этом протоколе человека микрососудов вводят в мыши путем прививки человеческую кожу на ослабленным иммунитетом мышей. Бактерии придерживаться широко для человеческого сосудов, что приводит к повреждения сосудов и развития пурпура сыпи обычно наблюдается в случаях заболевания людей.
Abstract
Neisseria Meningitidis вызывает тяжелое, часто фатальное сепсис, когда он попадает в кровь человека. Инфекция приводит к обширным повреждением кровеносных сосудов приводит к сосудистой утечки, развитие пурпура сыпи и некроза возможного ткани. Изучение патогенеза этой инфекции ранее был ограничен человеческой специфики бактерий, что делает в моделях естественных условиях трудно. В этом протоколе, мы описываем гуманизированную модель для этой инфекции, в котором человеческая кожа, содержащая кожные микрососудов, прививается на ослабленным иммунитетом мышей. Эти суда анастомозируют с обращением мыши, сохраняя при этом свои человеческие качества. Как только вводится в этой модели, N. Meningitidis придерживаться исключительно человеческих сосудов, что приводит к обширным повреждения сосудов, воспаления и в некоторых случаях развитие пурпура сыпи. Этот протокол описывает прививки, инфекции и оценки этапы этой модели в КонтеXT от N. Meningitidis инфекции. Методика может быть применена к многочисленным человеческим конкретных патогенов, которые инфицируют в кровоток.
Introduction
Менингококковая сепсис часто смертельным крови родился инфекция, вызванная бактериальным патогеном Neisseria менингита. Менингококковые пациенты сепсис часто присутствует с петехиальной или пурпура сыпь на коже, которая ранее была связана с сосудистой разрушений, вызванных циркулирующих бактерий и бактериальных продуктов 1. Кожные биопсии из клинических пациентов показывают бактерии, связанные с микрососудов, часто заполнения через сосуды 2. Помимо утечки бактерий, обширные тромбоза, коагуляции, перегрузки и сосудов наблюдается в пурпура регионах 3-5. Это повреждение сосудов может привести к обширным некрозом кожи и окружающих тканей, что приводит к санации и даже ампутации в менингококковой выживших. Понимание того, как инфекция вызывает этот повреждения сосудов важно для оптимизации стратегии по профилактике и лечению. Большинство исследований по менингококковой сепсисе была выполнена в пробирке начеловеческие клеточные линии, связанные с человеческой специфики N. Meningitidis. Многие аспекты инфекции были изучены в пробирке в том числе бактериальной адгезии, ответ клетки-хозяина, а также цитокинов ответ 6-9. Тип IV пили (TFP) были вовлечены в качестве основного адгезии органеллы для N. Meningitidis на обеих эпителиальных и эндотелиальных клеток 10. Кроме того, было показано, что адгезия N. Meningitidis в клетках-хозяевах является напряжение сдвига зависит и поэтому полагают, связаны с темпами кровотока в микроциркуляторном 11. Это говорит о том динамические напряжения бактерии сталкиваются в естественных условиях имеют решающее значение для патогенеза. Это, однако, очень трудно моделировать микросреду мелких сосудов в пробирке.
Рецептор адгезии для Neisseria TFP до сих пор неизвестно, и поэтому нокаут-в стратегии достижения бактериальной адгезии в животной модели не могут быть предусмотрены в это время. CD46 было предложено, чтобы быть рецептор Tfp и трансгенные животные были получены в качестве мышиных моделях. Однако инфекция у этих животных не приводит к обширной инфекции или сыпь развития 12,13. Другие животные модели, которые были описаны в аспекте бактериемии Neisseria инфекции учитывать бактериальной предпочтение человеческого трансферрина в качестве источника железа 14,15. Либо дополняя человека трансферрин или выражая его из трансгенных приводит к увеличению бактериальной нагрузки в крови в течение длительного периода времени, но эта модель не показывает бактериальную адгезию или сыпь развитие 16,17.
В этом протоколе, мы описываем гуманизированную модель мыши, в котором человеческая кожа, в том числе кожного микрососудов, пересаживается на ослабленным иммунитетом мышей 18,19. Это приводит к функциональным человека судов, перфузированных циркуляции мыши. В сочетании с человеческим трансферрина добавок, это мОдел составляет по меньшей мере двух человеческих конкретным аспектам N. Meningitidis, т.е. человеческий эндотелий и человеческий трансферрин, в среде в естественных условиях. Н. Meningitidis введены внутривенно в этой модели придерживаться конкретно к эндотелия человека, производя патологии, которая похожа на то, что в клинических больных, в том числе сосудистого повреждения и пурпура развития сыпи 18.
Protocol
1. Риски и разрешения
- Местные комитеты по этике должен одобрить все протоколы животных. Этот протокол был проведен в соответствии с правилами, установленными французскими и европейскими нормами по уходу и использованию лабораторных животных (Décrets 87-848, 2001-464, 2001-486 и 2001-131 и Европейская директива 2010/63/UE) и одобрено местным этическим комитетом Comite d'Ethique ан matière d'экспериментов Animale, Universite Paris Декарта, Париж, Франция. Нет: CEEA34.GD.002.11.
- Для кожи человека, письменное информированное согласие пациента было получено и проводились все процедуры в соответствии с французскими национальных руководящих принципов и одобрено местным этическим комитетом, Comite d'оценки Ethique де l'INSERM IRB 00003888 FWA 00005881, Париж, Франция Мнение: 11-048 .
- N.meningitidis, является потенциально вредным человеческим патогеном и все необходимые меры предосторожности должны быть приняты при обращении с организм. Эти меры включают вакцинацию и работает под уровнем биобезопасности 2 условия.
2. Кожного лоскута
- Соберите кожу человека как можно ближе к прививке времени, сколько возможно. Большинство кожи в этой работе происходит от пластических операций, связанных с области живота. Другие источники, такие как грудь, ноги и даже лицо были использованы с успехом.
- Подготовьте человека образец кожи, очищая поверхность кожи с 70% этанола и лежал его плашмя на хорошо очищенную поверхность, предпочтительно под капотом потока.
- Нарезать 200-400 мкм срезы от верхней части кожи с помощью дерматома с заданной толщины.
- Проверьте ломтики кожи для целостности и порежьте их на 2 см х 2 см квадраты, затем поместите в PBS (без двухвалентных катионов), если прививки сразу или при 4 ° С в DMEM с 10% сыворотки для кратковременного хранения (3-12 ч ).
- Анестезировать 6-8 недельных мышей SCID.bg (примерно 20 г) с кетамина (100 мг / кг) и Ксилазина (10 мг / кг) InjeИДКТК ф
- После того, как мышей наркоз, проверьте болевой реакции, выполняя ног щепотку, стандартный метод для создания боль рефлекс. Нанесите гель для глаз, чтобы предотвратить роговицы сушки и бриться левую сторону животного из-за плеча, где будут размещены трансплантат. Держите в тепле мыши на площадку тепла на протяжении всей процедуры.
- После готовит мышь для хирургии, очистить бритая зона с 70% этанола.
- Применить местный анестетик местно на сайте трансплантата (Tronothane) и подготовить трансплантата сайт осторожно удалить поверхностный слой кожи мыши с парой изогнутых ножниц. Будьте осторожны, чтобы не нарушить основной сосудистую.
- Удалить кожу в области немного меньше, чем области человеческого ломтик кожи.
- Удалить кусочек кожи с PBS (или DMEM) и поместите над трансплантата кровати, обеспечивая эпидермального стороной вверх. Шаги 2.8-2.10 следует проводить как можно быстрее, обеспечивая трансплантат кровать не высыхает.
- Совместите один уголили край и исправление с ткани клеем. Осторожно соответствовать остальной части среза кожи, чтобы привитой кровати, поместив небольшие количества ткани клеем вокруг краев. Всегда обрезать кожу человека к размеру, а не делать трансплантат кровать больше.
- Не тяните кожу слишком сильно над привитого постели, как кожа мышь является очень гибкой.
- Убедитесь, что трансплантат фиксируется ткани клеем в каждом углу.
- Очистите область с раствором йода.
- Нанесите пластырь с подушки, над трансплантата. Убедитесь, что пластырь является твердым, но не очень сильно и, что дыхание животного не влияет.
- Закрепите пластырь с гардеробной ленты.
- Разрешить животное восстановить на теплую поверхность.
- После того, как проснулся, вернуть животное в клетку. Животные размещены 2-3 на клетку.
- Проверьте мышей регулярно во время восстановления для признаков боли или страданий. 10-14 дней после прививки, удалить пластырь, стараясь не нарушить трансплантата. По нашему опыту послеоперационная боль является мини-мал. Тем не менее животные должны контролироваться ежедневно в частности, в дни после операции. Критерии боли или дистресса являются следующие.
- Потеря веса более 10%
- Внешность, мех, положение горбун, глаза
- Увеличение доли дыхания или сердца
- Снижение или необычные движения.
- Повышение температуры тела
- В случае признаки боли обнаружены paracetamole вводят перорально (300 мг / кг, каждые 4 ч). Гуманные конечные точки строго соблюдаться, если боль сохраняется.
- Если трансплантат выглядит сухой применить детское масло каждые 2-3 дня, чтобы сохранить кожу эластичной.
- Трансплантат готов к экспериментирование 21 дней после трансплантата.
3. Инфекция
- За день до инфекции, подготовить бактериальный штамм по полос на GCB пластин агара с соответствующими антибиотиками. Расти в течение ночи при 37 ° С в 5% CO 2.
- Подготовка Бактерии
- Инкубируют при встряхивании в течение 2 ч в инкубаторе (37 ° C в 5% CO 2) с рыхлой крышкой, пока бактериальной плотности примерно 0,1 OD 600.
- Центрифуга бактерии в течение 3 мин 15,000 оборотов в минуту.
- Удалить супернатант и ресуспендируют в PBS, затем центрифуги снова.
- Повторите шаг стирки (2.2.4-2.2.5) дважды.
- Ресуспендируют осадок бактерий в PBS.
- Измерьте OD 600.
- Сделать культуры либо OD 600 0,1 (10 8 КОЕ / мл), или OD 600 1,0 (10 9 КОЕ / мл). С этой известной концентрации, разбавляют до 10 7 КОЕ / мл. Попробуйте приготовить бактерии как можно ближе к времени впрыска, насколько это возможно.
- Взвесьте мышей.
- Анестезировать мышей с кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) вводили внутрибрюшинно
- После того, как спит, счерт возьми, что ответ боль отсутствует на схождения крайнем случае, держать мышей тепло с тепловой площадку и поставить глазную мазь на, чтобы предотвратить высыхание.
- Дайте каждой мыши 8 мг человеческого трансферрина, ресуспендировали в физиологическом растворе или PBS, инъецировали внутрибрюшинно
- Берут маленькую каплю крови из хвоста и высевали на чашке с агаром, чтобы проверить кровь стерильна до заражения.
- Введите 100 мкл 10 7 КОЕ / мл бактериальной культуры (10 6 КОЕ всего) внутривенно через ретро-орбитального или хвостовую вену. Измерения КОЕ принятые 5 мин после инъекции согласуются независимо от инъекции.
- Через несколько минут, отрезать конец хвоста и распространение пробы крови на чашках с агаром с соответствующими антибиотиками с одним 10-кратного разведения для установления КОЕ крови сразу же после инфекции.
- Уплотнение хвост с ткани клеем.
- После инъекции, разбавить бактерий прививочный и высевали на чашки с агаром с соответствующими антибиотиками установить КОЕ.
- Разрешить мышамвосстановить на площадку тепла, пока они не вверх и движется
- В 6 ч после инфекции нарисовать небольшое количество крови из хвоста, разбавленных и пластина для установления КОЕ на 6 часов.
- Выдержите все агаром при 37 ° С в 5% CO 2 в течение ночи.
4. Жертва
- В выбранный момент времени инфекции, анестезировать мышей с кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) вводили внутрибрюшинно
- После того, как спит, держать в тепле мыши с тепловой площадку.
- Когда боль рефлекс пошел (схождение щепотку), СНиП конец хвоста и нарисовать кровь.
- Распространение кровь на чашках с агаром с соответствующими антибиотиками; 5 мкл прямого и 10 мкл разведение 1:10 установить КОЕ.
- Жертвоприношение мышь путем смещения шейных позвонков.
- После жертвуя мышь согласно всем соответствующим институциональным и этических принципов, подтвердить смерть из-за отсутствия сердцебиения. Сделайте срединный разрез, прорезать грудной клетки, и сделать надрез в том, чтобы слышатьт.
- Соберите столько крови, сколько возможно от сердца / грудной полости и места в стерильную пробирку.
- Удалить органы (например, печень, селезенка, головной мозг) в стерильную чашку.
- Снимите кожного лоскута и часть кожи мыши в стерильную чашку.
- Утилизировать корпусе мыши.
- После того, как собрали кровь была давали свернуться в течение 15 мин, центрифуге его 15 мин при 3000 оборотах в минуту.
- Удаление плазмы из крови и хранить при температуре -80 ° С для последующего анализа, например, для обнаружения цитокинов методами ELISA или FACS основе.
5. Орган КОЕ Графы
- Взвесьте гомогенизации пробирки, содержащие 500 мкл PBS каждый прежде чем принимать образцы биопсии.
- Возьмите 4 мм образцы биопсии от каждой ткани с помощью стерильного биопсии удар.
- Место биопсии в взвешенную гомогенизации пробирки, содержащие 500 мкл PBS. Гомогенизируют образцы кожи с 2 мм бисером, использовать меньшие шарики для других органов.
- Поместите оставшиеся твопросы в 4% параформальдегиде (PFA) и хранить при 4 ° С в течение микроскопии (см. ниже).
- Взвесить гомогенизации пробирки, содержащие биопсии, чтобы установить биопсии вес (для последующего вычисления КОЕ / мг ткани).
- Гомогенизируют образцы.
- Гомогенизируют печень, селезенка и мозг, на 6000 оборотах в минуту в течение 30 сек.
- Гомогенизируют образцы кожи при 6000 оборотах в минуту в течение 30 сек и при необходимости повторить.
- Распространение разведений от каждого гомогенизации трубки на чашках с агаром и расти в течение ночи при 37 ° С в 5% CO 2, чтобы установить счетчики КОЕ органов.
6. Гистология / Иммуногистохимия
- Фиксация
- Fix тканей в 4% PFA в течение ночи при 4 ° С. Стадию фиксации может быть больше, если хранение в течение длительных периодов разместить ткани в 0,25% PFA.
- Промыть ткань в PBS, а затем поместить в 20%-ном растворе сахарозы и возврата до 4 ° С в течение ночи или до тканей были погружены в раствор.
- Вымойте тканей в PBS, нарезанные по размеру и месту в растворе октября (либо в ткани формы или привязана к базовой плате).
- Быстро заморозить ткани на чашку Петри, плавающие в жидком азоте.
- После замораживания, положить в ткани на сухом льду до перевода в -80 ° С для хранения.
- Нарезки
- Удаление ткани от -80 ° C и позволить, чтобы уравновесить до -20 ° С в криостате.
- Ломтик ткани с толщиной приблизительно 10-15 мкм и разместить на покрытых микроскопии слайдов.
- Магазин скользит при -20 ° С до использования.
- Окрашивание
- Разрешить слайды до комнатной температуры.
- Нарисуйте вокруг среза на слайде с гидрофобным пера. Подождите 5-10 минут.
- Увлажняет / мытья кусочек в PBS в течение 5 мин, повторить дважды.
- Проницаемыми ломтик в 0,1% Triton в PBS в течение 10 мин.
- Стирать в PBS 2-3x в течение 5 мин.
- Блок в PBS0,1% Тритон 1% BSA в течение от 10-60 мин в зависимости от антитела или красителем, который будет использоваться.
- Удалить блокирующий буфер и добавить первичного антитела, разбавленного в соответствии с требованиями в блокирующем буфере. Выдержите в течение определенного времени. (Часто 1 час при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С).
- Стирать в PBS 2-3x в течение 5 мин.
- Применить вторичного антитела, разбавленного в надлежащих случаях в Бок буфера; ДАПИ обычно включается в этом шаге. Выдержите в течение определенного времени, часто 1-2 ч комнатной температуре, в темноте.
- Стирать в PBS 2-3x в течение 5 мин.
- Гора в увядает, защищающей монтажный СМИ с защитным стеклом и печать с лаком для ногтей.
- Image окрашенных слайды сразу или хранить при 4 ° C.
- Выполните визуализацию с конфокальной или флуоресцентной микроскопии, созданной с фильтром / лазеров, соответствующих флуорофорами используемых.
- Гистология
- Разрешить слайды, которые будут использоваться для гистологии до комнатной температуры.
- Пятно слайды, используя в качествеtandard гематоксилин / эозином протокол.
- Поместите слайды в слайд-стойку.
- Трансфер стойку с горками между решениями в следующем порядке:
- 2 сек в проточной водопроводной водой.
- 3 мин в отфильтрованный раствор гематоксилином.
- 10 сек в проточной воде.
- 10 с дистиллированной водой.
- 10 сек в этанол 100%.
- 2 сек в фильтрованной эозином.
- 10 сек в проточной воде.
- 10 сек в этанол 100%
- 2 мин в ксилоле х 3 (ванна I, II, III).
- Трансфер сразу и добавить несколько капель фиксации клея на каждой горки, место покровным на вершине, удалить пузырьки воздуха, дайте высохнуть в течение нескольких часов.
- Изображение скользит под стандартный белый световой микроскоп.
Representative Results
Рассчитывает КОЕ
Н. Meningitidis штамм, используемый в этих представительных результатов Н. Meningitidis 8013 клон 12, серогруппы С клинический изолят, выражая класс я СО пилин, Опа -, OPC -, PilC1 + / PilC2 + 20. Штамм был спроектирован, чтобы выразить зеленый флуоресцентный белок (GFP) из вставки хромосомной 18. Бактериальные устройство считает колониеобразующих устанавливаются путем подсчета количества колоний на чашках с агаром и расчета либо КОЕ / мл крови или КОЕ / мг ткани от известных объемов покрытие. Анализы крови показали, что через 5 мин после внутривенной инъекции 10 6 КОЕ бактерий было в среднем 1,5 × 10 5 КОЕ / мл циркулирует в крови (рис. 1А). После 6 часов графы в среднем 4,8 х 10 4 КОЕ / мл. К 24 ч. рассчитывает средние были 2,4 × 10 4 КОЕ / мл, но в этой группе из 10 мышей, 5 имелинет обнаруживаются циркулирующие бактерии, а другой 5 были относительно высокие рассчитывает (рис. 1А). КОЕ отсчетов, взятых из образцов кожи показывают, что большинство мышей, имеющих значительные отсчеты в коже человека, в среднем 2,1 × 10 4 КОЕ / мг ткани через 6 ч и 4,4 х 10 2 КОЕ / мг ткани на 24 часов (Фигура 1В) . Контралатеральной образцы кожи мыши не показали содержание бактерий в 24 часов, и только очень низкой числа в 6 часов, демонстрируя явное предпочтение N. Meningitidis для человеческого судов в привитого кожи (рис. 1В). В целом количество бактерий были очень низкими, чтобы невыявляемый в других органах, отобранных хотя 2 животные действительно показывали отсчеты, которые могут быть отнесены к загрязнению из крови, так как они коррелируют с высокой циркулирующих числа бактерий (рис. 1с). Модель также может быть использован для определения роли факторов вирулентности в естественных условиях, например IV-Pi Типли. Бактериальные штаммы с определенных мутаций в гене 21 PILD, в результате деформации не хватает TFP, а также гена pilC1 8, не имея предложенный TFP 'адгезин "были введены в модель. Эти мутации не привело к бактериальной адгезии в человеческом кожного лоскута, подтверждая решающую роль Tfp играет в адгезии в естественных условиях (рис. 1D).
Иммуногистохимия / Гистология
В этих экспериментах мы использовали N. штаммы менингита, которые экспрессируют белок зеленой флуоресценции (GFP), чтобы позволить флуоресцентной детекции без необходимости вторичного окрашивания. Человека сосуды были окрашены с помощью маркера для человеческого эндотелия, либо CD31 (РЕСАМ-1) или Лектин Ulex еигораеиз агглютинин (UEA) 18,22. UEA конъюгируют с родамин позволяя один шаг окрашивание (фиг.2А-С). Ядра клеток можно окрашиватьред с DAPI, чтобы помочь определить тканевых структур (рис. 2A-B). Гистологии проводили с использованием стандартного окрашивание гематоксилин / эозином. Эпидермальный / кожный граница кожи было четко идентифицировать. Воспаление, тромбоз и сосудистой утечки были сосредоточены на суда, близких к этой границы 24 часов после заражения (рис. 2D). Тромбоз было видно в нескольких небольших кожных сосудов, часто сопровождаемых заторов и воспаления. Утечка эритроцитов из в ткани можно увидеть, что указывает на обширный уровень повреждений сосудов. Гистопатологию привитого кожи в неинфицированной мышей оказались нормальными, не различимым воспаления 18. В около 30% инфекций бактериальной адгезии в коже приводит к развитию макроскопически обнаруживаемого пурпура (2E Цифры и 2F).
"5 дюймов" FO: Пребывание "/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg" Первоначально "/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg" />
Рисунок 1. Рассчитывает КОЕ. (А) Бактериальный КОЕ рассчитывает на мл крови у 5 мин, 6 часов и 24 часа после заражения. (B) Бактериальные КОЕ подсчитывает из образцов кожи по сравнению человеческую кожу (СС) и кожу мыши (MS) на обоих 6 ч и 24 ч после инфекции. (С) Бактериальный КОЕ считает от других органов принято 24 часа после инфицирования. (D) Сравнение количества бактерий КОЕ из образцов кожи человека и мыши, принятых на 24 ч после инфекции у мышей, инфицированных дикого типа N. Meningitidis 2C43 пятно (WT), штамм с мутацией в гене PILD (PILD) или штамма с мутацией в гене pilC1 (pilC1). Все графики показаны как исходные данные с медианой. Рисунок изменяется от Melican др. 18."_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Микроскопия. (А) Проекция конфокальной стека показывает человеческую микрососудов, окрашенных с ЕЭП лектина (красный), недалеко от кожных (г) эпидермиса (д) границы. Судно заражен N. Meningitidis (зеленый) 2 часа после заражения. (В) Оптический срез и проекция ломтик (С) показывает N. Meningitidis микроколонии (зеленый) инфекции человеку судно (ЕЭП - красный) в кожу трансплантат 2 часа после заражения. (D) Гематоксилин / эозином человеческого кожного лоскута инфицированных в течение 24 часов с N. Meningitidis. Эпидермиса (е), поражение кожи (г) граница четко видна и обширный тромбоз и скопление microvessELS (стрелки) видно в дерме. Воспаление и некоторые сосудистые утечка (стрелка) также могут быть идентифицированы. (E) трансплантат кожи человека до заражения. (F) То же пересадка кожи, как (E) 24 ч после заражения с N. Meningitidis показывая пурпура регионы (стрелки). Цифры 2B, 2D, 2E, 2F и модифицируются с Melican др.. 18 Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Discussion
Животные модели имеют критически важное значение для бактериального исследования патогенеза. Невозможно полностью имитировать среды в естественных условиях в культуре клеток, и это становится очевидным, что хозяин-патоген взаимодействия зависит от многих динамических факторов. Человеческий специфичность некоторых клинически значимых патогенов, таких как N. Meningitidis, ВИЧ, гепатита С, Plasmodium тропической, листерий, и сальмонеллы брюшного тифа ограничил использование естественных условиях моделей в этих инфекций. Однако, как мы начинаем понимать, какие инфекционные шаги, используемые при специфичности, в настоящее время разрабатываются гуманизированные модели. Протокол, описанный здесь является демонстрацией этого с введением человека микрососудов мышам, что позволяет обширная в естественных условиях заражение N. Meningitidis, в результате повреждения сосудов, а иногда и развития пурпура сыпи.
Используя эту модель,мы смогли определить, что адгезионные свойства TFP участвуют в сосудистой колонизации в естественных условиях с использованием бактериальных мутантов и что повреждение сосудов уменьшается в отсутствие адгезии 18. Ранее циркулирующие бактериальные продукты были вовлечены в этот ущерб, но наши результаты показывают, решающую роль для местного адгезии и колонизации сосудов. Это открывает новые возможности для развития целей роман лечения. Если адгезия патогенных бактерий может быть заблокирован фармацевтически она могла бы предотвратить развитие кожных поражений и привести к лучшим результатам для менингококковой выживших в плане некроза тканей, хирургическая обработка раны и ампутации. Работа также продемонстрировал сложность инфекции и участие в иммунном ответе и коагуляции каскада. Мы определили сигнализации цитокинов человека в сыворотке инфицированных мышей, несмотря на относительно небольшом количестве эндотелия человека настоящего 18.Это указывает на значительную реакцию цитокинов, наряду с инфильтрацией мыши популяции иммунных клеток в этой области.
Животные модели не может, конечно, никогда в полной мере имитировать человеческую болезнь, и все результаты получил от них следует рассматривать с учетом этого. Например, в этой модели кровь и циркулирующие клетки из мышиного происхождения, и мы не можем сбрасывать, что они могут вести себя по-разному в клетках человека. Преимуществом этого, однако, как показано в нашей недавней публикации 18, является способность дифференцировать сигналов, происходящих из эндотелия человека от того циркулирующих клеток мыши. Иммунитетом фон из мышей, используемых в этой модели также позволит для аллогенной перемещение населения иммунных клеток человека, добавив дальнейшей «гуманизации» аспект. Ослабленным иммунитетом фон из мышей, однако, может маскировать роль для NK, Т-или В-клеток, которые все отсутствуют или дефектных в этой модели. Относительно шорт сроки (24 часа в сутки), используемый в этой модели в основном касается врожденную реакцию, но для долгосрочных инфекций и развития иммунитета других вариантов, возможно, потребуется изучить.
Кожа является важным местом инфекции для N. Meningitidis, но имеющий относительно небольшое количество сосудов человека также означает, что экстраполяции данных к системной инфекции с участием многочисленных органов трудно. Хотя эта модель позволяет для изучения развития кожной поражения, важные шаги менингококковой инфекции, такие как эпителиальной и гематоэнцефалический пересечения не включены. Дальнейшее развитие этих очеловеченных моделей необходима для решения этих других аспектов инфекции. Тем не менее эта модель имеет большой потенциал для многочисленных человеческих конкретных патогенов, особенно ориентированных на кровеносные сосуды.
Disclosures
Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Dumenil, в частности Silke Сильва за критическое прочтение рукописи. Отдел хирургии в Больнице Européen Жорж-Помпиду (HEGP), д-р Дэвид Maladry. Майкл Hivelin и д-р Патрик Bruneval, Отделение патологии в HEGP. Вивария при PARCC во главе с Элизабет Хука. Эта работа была поддержана следующими грантовые учреждения: Мари Кюри МЭФ общение нет. 273223 (КМ), ATIP-Авенир Грант INSERM, CODDIM оборудование грант (Иль-де-Франс область), FRM (Фонд Pour La Recherche Medicale) Оборудование Грант, IBEID лаборатория передового опыта консорциума, ANR (Agence Nationale Pour La Recherche) грант " ошибки-в-поток ". Доноры не участвовал в разработке дизайна исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
| Ketamine 500 | Virbac France | lot no. VAL4243 | |
| Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | lot no. KPO809S |
| Optigel | Europhta | ||
| Lacrigel | Medicament Autorisé | ||
| Tronothane | Lisa Pharma | ||
| GC agar base | Conda | 1106 | |
| Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
| Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
| UEA lectin - rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
| Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
| Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
| Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
| Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
| MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
| MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
| VECTASHIELD mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
| OCT tissue tek | Sakura | 4583 |
References
- Davis, C. E., Arnold, K. Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura. J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).
- Mairey, E., et al. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J. Exp. Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Brandtzaeg, P., van Deuren, M. Classification and pathogenesis of meningococcal infections. Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).
- Guarner, J., et al. Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays. Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).
- Hill, W. R., Kinney, T. D. The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study. J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).
- Capecchi, B., et al. Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells. Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).
- Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells. Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).
- Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule. Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).
- Taha, M. K. Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells. Cytokine. 12, 21-25 (2000).
- Kirchner, M., Meyer, T. F. The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor. Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).
- Mikaty, G., et al. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, (2009).
- Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
- Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells. Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host's protein. Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Murray, A. G., et al. Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).
- Nassif, X., et al. Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells. Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).
- Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis. Genome Res. 13, 391-398 (2003).
- Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment. J. Exp. Med. 192, 1205-1211 (2000).
