Summary
성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.
Abstract
의 intravital 깊은 조직 다 광자 현미경으로 세포 통신을 모니터링하는 것은 건강과 질병에있는 두꺼운 조직 샘플 및 기관 내에서 면역 세포의 운명을 이해하기위한 열쇠입니다. 다 광자 현미경의 주사 패턴을 제어하고 적절한 수치 알고리즘을 적용하여, 우리는 더 나은 축 해상도 및보다 향상된 신호대 잡음비, 즉 콘트라스트를 3 배 달성 저희 활성화하는 스트라이프 - 조명 방식을 개발 표준 다 광자 현미경에 비해 높은 림프 기관의 조직을 산란 내에서 100 μm의 조직 깊이. 촬상 깊이 인해 전계 감지기의 사용에 약간 낮았다 반면 수집 속도뿐만 아니라 광표백 광 손상 및 효과는 표준 광 곱셈기 기반의 기술과 유사했다. 스트라이프 - 조명 방식을 사용함으로써, 우리는 보조 모낭 수지상 세포에 면역 복합체 침착의 역학을 관찰 할 수있다 ̵1; 본원 센터에서 몇 가지 단백질 분자의 수준에서.
Introduction
두 광자 레이저 스캐닝 현미경 (TPLSM)는 적외선 초단 펄스 여기 1 관련 깊은 조직 이미징을위한 장점과 함께, 각종의 운동과 상호 작용 패턴을 공개하여 단일 세포 수준에서 중요한 프로세스에 대한 우리의 관점을 혁명 동물에게 2-5 살아있는 세포의 부분 집합. 그러나, 현재의 기술은 건강과 질병에있는 조직 내에서 세포 반응의 분자 기초에 대한 전용 스파 스 정보를 렌더링하기 때문에, 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전제 조건으로 장기의 기능과 장애의 메커니즘을 규명하는 것은 여전히 불충분하다. 현재의 기술은 산란에 의한 수백 미크론의 공간 만 창을 가능하게하고, 공간 해상도 및 성인 동물의 매우 컴팩트 한 조직에서 특히 명백하다 신호대 잡음비 (6), 프런트 왜곡 효과 거절. 이러한 산란 및 파면 왜곡 효과는 매우 이질적인에 기인3D 공간 해상도의 깊이 의존 열화에 대한 첫 번째 단계에서 주요한 조직의 굴절률 이방성의 디 분포, 그리고 마지막 탄도 여진 광자, 신호 대 잡음비의 손실이 예에서 발생 된 신호의 총 손실이다. bioscientific 의치 깊은 조직 애플리케이션의 관점에서, 이는 신호 대 잡음비의 감소가 시스템을 간과하는 결과가 발생하는 반면 해상 불량 거짓 양성 상호 작용을 초래할 것이기 때문에 현재의 기술이 명백하게 셀룰러 통신을 공개 할 수없는 것을 의미 희미한 구조 사이의 상호 작용.
명백하게 동적 방식으로 셀룰러 상호 작용을 검출하기 위해, 높은 공간 해상도 향상 깊은 조직 내에서 필요하다. 예 특수 수치 알고리즘 제 여기 상태의 고갈에 예를 들면 구조 조명 접근법에 기초하여 현재 도입 강력한 nanoscopy 기법 예를 들면 dSTORM, PALM은 고정 된 세포뿐만 아니라 라이브 세포 배양 7에서 여러 응용 프로그램을 발견했다. 그러나, 조직 섹션, 생체 조직과 유기체에 이러한 응용 프로그램을 확장하기 위해 우리는 여전히 심각한 기술적 인 어려움을 극복해야합니다. 이광자 여기에서는 서로 다른 파장으로뿐만 아니라 여기에 대한 단일 파장 (sw2PE-STED)로 STED 및 배출 동일에서 각각 매립 셀 09과 뇌 조각 8 또는 인공 매트릭스에서 측 방향 해상도를 향상시키기 위해 적용된 자극 표준 TPLSM으로 축 해상도. 하나의 광자 STED를 사용하여, 돌기 쪽의 역학은 67 내지 10 nm의 해상도에서 생활 Thy1 EGFP 마우스의 뇌 피질 (최대 15 μm의 깊이)의 표면에 이미지가 될 수있다. 발달 생물학을위한 다양한 도구를 두 배 향상 차원을 제공하는 다 초점 구조화 조명 현미경에 의해 제공됩니다해상도. 그러나,이 기술은 단지 이러한 제브라 피쉬 배아 (11)로서 광 산란 낮은 성향 유기체에서 사용될 수있다. 그러나 이러한 기술 중 어느 것도 출산 후 증상과 질병의 생물 의학 및 임상 연구에 중요한 모델입니다 마이크로 미터의 수백에서 성인 동물의 높은 산란 조직에 적용 할 수 없습니다.
점 분포 함수 (PSF), 즉 회절 한정 파면 형상을 계산하는 데 사용되는 근사 독립, 렌즈를 포커싱 한 후, 광축 (축선 방향 해상도)을 따라 PSF의 폭보다 적어도 세 배 더 크다 광축 (측 방향 해상도) (12)에 수직 인 PSF 폭. 상당히, 특히 눈을 따라 훨씬 더 큰 PSFS, 선도 깊은 조직 이미징에 초점을 맞춘 전자파의 파면 형상을 수정 니케 계수에 의해 정량화 다른 순서의 앞에 왜곡 웨이브알은 13 ~ 15 축. 따라서, 회절 법 및 파면 왜곡 효과 모두는 깊은 조직 이미징 제한 요소로서, 광축을 따라 해상도를 가리. nanoscopy 기술이 회절 한계를 반작용 초점 반면 만, 축 방향 해상도 및 회절 파면 왜곡 효과를 모두 반작용에 의해 콘트라스트를 향상시키는 기술은 고해상도의 intravital 이미징을 위해 필요하다. 이상적으로,이 기술은 충분히 빨리 세포 역학의 모니터링을 허용 할 수도 있어야한다.
PSF의 수차 및 TPLSM에 적응 광학을 사용하여 대비 손실의 실시간 보정이 광범위하게 연구 및 지난 십 13,14,16-18 개선하고 따라서 탄도 여기의 더 나은 관리에 이르는 최선의 현재의 선택을 한 14 광자. 아직도 인해 대부분의 전면 수정이 적응 광학에 사용되는 접근법 파도는 사실을 반복하고 그들이 하 것이있다인해 조직의 굴절률의 높은 이질성으로 작은 면적 (거의 없음 10 × 10 ㎛ 2)을 반복 할 적이, 수집 속도는 촬상 세포 운동성 및 통신을 위해 필요한 것보다 훨씬 낮다. 또한, 적응 광학의 물리적 한계는 TPLSM 여전히 회절에 의해 결정됩니다 향상.
조명 (SPIN) 및 검출 측 (SPADE)의 시간적 공간적으로 변조 된 변조 이론적 해상도를 향상시키기 위해 레이저 주사 현미경에 적용하는 것이 제안되어왔다. 의 intravital 영상에서의 실용적인 응용 프로그램은 여전히 19을 입증 할 수 남아 있습니다.
이와 함께, 성인 살아있는 동물의 깊은 조직 영상의 해상도 향상 기술의 개발에 대한 높은 수요가있다. 본 연구에서, 우리는 멀티 빔 스트라이프 - 조명 다중 광자 레이저들에서 스캐닝 과정을 제어함으로써, 여기 패턴의 공간 변조를 달성통조림 현미경 (MB-SI-MPLSM) 20. 여기 빔 단면이 공간적으로 변조 된 구조화 된 조명 방식, 반대로, 우리는 여기의 공간 변조를 달성하기 위해 단지 스캐닝 과정을 사용한다. 긴 파장으로 여기를 확장하여, 우리는 독립적으로 광 중에서, 높은 조직 (예, 림프절, 자유 산란 경로 47 μM 6) 비산 깊은 조직에서의 공간적 해상도 및 신호대 잡음비를 모두 향상시킬 수있다 우리가 감지 비선형 신호, 예를 들어, 형광, 두 번째 고조파 발생 또는 다른 주파수 현상을 혼합. 900 nm의 최대 여기 파장에서이 방법을 사용하여 우리는 마우스 림프절의 싹 센터에서 몇 분자의 규모에 동적으로 이미지 세포 단백질 구조 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 더 나은 항 프로빙 프로세스에 모낭 수지상 세포 및 B 세포의 표면에서 항원 운반 유닛 간의 상호 작용을 시각화 할차 림프 기관의 면역 반응 중에 세대.
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Protocol
스트라이프 - 조명 TPLSM에 대한 멀티 빔 설치
여기서 사용 설치 이전 6,20 바와 같이, 특수한 멀티 빔 이광자 레이저 주사 현미경이다. 시스템은도 1에 도시되어있다. 접근법들은 단일 빔 주사를 수행하기 만 할 수있는 경우에도, galvoscanner 거울의 이동과 카메라의 획득을 동기화 할 수있는 다른 이광자 레이저 스캐닝 현미경에 적용 할 수있다 . 이 경우, 단점은 표준 PMT 기반 TPLSM의 수집 속도로 그러나 유사한 하부 수집 속도 일 것이다. 지금까지의 해상도와 콘트라스트 관한 한 최적의 품질을 달성하기 위해, 최저 및 광표백 광 손상 빠른 습득, 그것은 설치 프로그램의 다음 조정 단계를 참고하기를 권장합니다 :
- TISA 레이저의 레이저 파워를 확인 : 공장 출하 값과 previo과 비교, 100 %로 확인우리는 독서를 소유하고 범위 700-1,000 nm의에서 여기 파장 필요한 경우 그것이 그것을 사용합니다.
- 티의 원격 제어 표시 테스트 : 사 빔 스플리터, 즉 0 %를 확인하고 100 % 설정. 100 % 남아있는 TISA 빔, 그리고 거기 확인하고 스테핑 모터 null의 위치를 재설정합니다. TI는 : 사 빔 스플리터는 수직 빔의 경로에 수직 편광 레이저 빔 분할 하위 λ / 2 판과 편광판, 구성 하나가 여기에 대한 현미경으로 감독을, 다른 하나는 광 파라 메트릭 펌프하는 데 사용됩니다 발진기 (OPO). 자동으로 λ / 2 판, 티의 연속 조정 회전 : 사 및 OPO 전력을 각각 얻을 수있다.
- 원하는 파장에 OPO를 조정하고, 출력 전력을 측정. 전원이 너무 낮은 경우 : 펌핑 파장을 최적화하고 일의 설정을 확인합니다 (티 W 4 사 레이저는 800 nm에서, 하나는 약 1,050-1,100 nm에서 OPO 빔의 W 0.8-1를 얻을 수 있어야합니다)전자 거울과 삼진 결정. OPO가 원하는 파장의 출력에서 공진 전원이 증가 할 때까지 권장되는 최적의 차트 나 그래프를 자주 사용할 수있는 값, 다음 미세 조정을 선택합니다.
- 전원이 여전히 낮 으면, 넷 액세스 미러 조절 노브로 OPO의 접근이 거울을 조정한다. 아주 천천히, 그리고 아주 작은 움직임으로, 전면과 끝 거울 교대로이 단계를 수행합니다.
- 사 및 / 또는 OPO 빔이 적절한, 중앙 위치에서 항목 거울 조회수 : 티가 있는지 확인합니다.
- 사 광선 : 백서 (! 매우 반짝 또는 반영하지 않음)의 조각과 OPO 빔을 관찰하기위한 적외선 뷰어 및 더 높은 파장 티를 사용합니다.
- NIR 티 작업을 할 때 보호 안경을 착용 : 사 광선 (일반적으로 720-750 나노 미터까지의 평균 사람을 볼 수 있습니다).
- 미시간하도록 정렬 절차를위한 가능한 낮은 레이저 출력 (들)을 설정잠재적 인 눈 손상을 nimize.
- 동공이 수축되도록 항상에 실내의 주변 조명을 유지합니다.
- 사 빔이 스캔 헤드를 입력 : 레이저 파워 미세 조절 티 때 아직 적용되지 λ / 2 판과 편광판, 밖으로 구성된 감쇠기가 있음을 유의하십시오!
- 사 광선 : 백서 (! 매우 반짝 또는 반영하지 않음)의 조각과 OPO 빔을 관찰하기위한 적외선 뷰어 및 더 높은 파장 티를 사용합니다.
- 엔트리 포인트 다이어프램은 티타늄에 의해 중간에 명중되어 있는지 확인 : 사 및 / 또는 OPO 빔; 없는 경우, 레이저 빔이 스캔 헤드 들어가기 전에, 마지막 두 개의 거울을 조정한다.
- IR 뷰어 및 흰색 (반사 / 만 반짝하지!) 종이의 작은 조각을 사용합니다.
- 레이저 빔의 위치가보다 정확하게 판단 할 수 있도록 항상 현미경 진입에 진동판을 닫는다. 중요 : 6 단계로 진행하기 전에 다이어프램을 다시하는 것을 잊지 마세요!
- 따라서 현미경에 반사 된 레이저 빔의 빛 경로를 조정합니다. 작은 세그먼트에서이 작업을 수행하고 반복적 인 빔 워싱턴을 수행lking.
- 대물 렌즈의 광 출력이 충분하지 않은 경우 전체 빛의 경로를 확인합니다.
- 긴 유휴 기간, 주요 수리, 광학 요소의 교체 후 처음으로 시스템을 사용할 때는 항상 빛의 경로를 확인하거나 문제는 출력이 존재하는 것으로 의심되는 경우.
- 그들은 먼지 특히 것을, 모든 활성 광학 표면이 깨끗한 지 확인하십시오! 표면이 먼지 층으로 피복하는 경우, 파면 심지어 대물 렌즈를 입력하기 전에 왜곡 및 결과 레이저 빔은 샘플의 선명한 이미지를 제공하지 않을 것이다!
- 필요한 경우, 에탄올, 이소프로판올에 적신 렌즈 종이의 접힌 부분으로 거울을 청소합니다.
- 빔이 광 경로를 설정 한 후, 프리즘 기반 펄스 압축기의 끝에 직접 진입 미러 위에 위치 미러로 다시 도착한 것을 확인한다. 여기에서, 빔이 반사되어 나광 멀티플렉서 (BM) n을.
- 레이저 빔은 광대역 50 % 투과 및 50 %의 반사를위한 요구에 맞도록 레이저 빔의 편광을 변경하는, 직접 λ / 2 판 전에 빔 멀티플렉서의 입구에 위치되어 다이어프램 나가면 체크 BM 내.
- 먼저 빔 위치를보다 정확하게 판단 할 수 있도록 조리개를 닫고 BM 항목에서 현미경 및 기타에 항목의 하나, 즉 두 개의 다이아 프램 사이 빔 산책을 수행합니다. 다른 하나의 빔 스캐닝 현미경 다이어프램은 XY 스캐너의 진입에 위치해야한다.
- 빔 폐쇄 다운 개구의 중심에 충돌하지 않으면, BM 엔트리 조임 바로 앞에 배치 된, 상기 언급 된 거울을 조정한다. 중요 : 10 단계로 진행하기 전에 다이어프램을 다시하는 것을 잊지 마십시오.
- 다이어프램이 재개으로 레이저 빔이 BM 거울에 안타 있는지 확인자신의 중간 지점. BM의 복잡한 빛 경로의 다른 부분을 차단하지 않도록 종이의 좁은 스트립을 사용하십시오!
- 평행 편광에 대한 최고 거울 "P", 수직 편광 "S"에 대한 바닥 거울 : 빔 출구 거울의 중앙을 명중 있는지 확인합니다. 그렇지 않으면, BM 전에 엔트리 거울을 조정한다.
- "S"와 "P"는 편광 빔 그룹 편광판 큐브를 입력하고 XY 스캐너에 항목에서 적절하게 중첩 할 수 있는지 확인합니다. 경우에 다음과 같이 단일 빔 스캐닝 현미경을 사용하는 건너 뛰기.
- 레이저 광은 중앙에서 스캔 및 튜브 렌즈를 통과하여 대물 렌즈 '초점면의 중간을 통해 얻을 수 있는지 확인합니다. 중요 :이 단계는없는 주차 위치에서 중심 위치에 레이저 광을 수행되어야!
- 목표 도구 ( "황소의 눈")와 대물 렌즈를 장착하고 레이저 빔이 중간에 대상을 안타 확인하고 있는지 여부조명도 있습니다.
- 이 경우 것으로 보인다 경우, BM 전에 조리개를 닫고 원형의 간섭 패턴이 나타나는 경우 중간 (간섭 최소)에서 검은 색 원으로 확인합니다.
- 황소의 눈의 중심을 기준에 상당한 변화가있을 경우 항목의 미러를 조정합니다.
- 지금 20X 물 침지 렌즈로 예를 들어 대물 렌즈와 황소의 눈을 교체합니다.
- 흰색 종이로 출력 광 필드를 확인합니다. 이 밝고 균일하고 중앙에 위치해야합니다.
- 출력 전력을 측정 : 100 % 티타늄을 펌핑 100 % OPO에 : 사 (4 W), 하나는 약 얻어야한다. (여기에 사용 된 현미경) 1,100 nm에서의 렌즈 후 100 ~ 150 mW의. 낮은 레이저 힘은 멀티 빔 SI-TPLSM을 수행하기에 충분하지 않습니다. 단일 빔 주사 SI-TPLSM의 경우, 5 ~ 10 ㎿가 충분합니다. 레이저 빔은 scanne 않고, 중앙 위치에 남아 있어야D!
- MB-SI-TPLSM을 수행하는 경우 다음과 같이 BM에 거울을 맞 춥니 다 :
- 무대에서 균일하게 형광 샘플, 예를 들어 적색 형광 슬라이드를 놓고 샘플 내부 만 (대물 렌즈 '앞에 즉, 닫기) 표면 근처의 레이저 빔을 초점을 맞추고있다.
- 멀티 빔 모드로 현미경을 설정하고 시작 부분에 빔의 수, 바람직하게는 하나의 빔, 편광, 예를 들어, "P"를 선택합니다.
- 형광 슬라이드 촬상하여 레이저 빔을 찾기 : 오픈 "P"셔터를 설정하고 빔을 포커싱하는 동안 연속적으로 CCD 카메라를 실행.
- 빔이 중앙 위치에 있고, 스캐너의 전원이 꺼져있는 것을 확인하십시오. 빔이 검색되지 않습니다 있는지 확인합니다!
- 카메라 칩의 중앙 부근에 밝은 반점을 찾아 빔을 찾을 수 있습니다.
- 스폿이 화상면의, 즉 밝고 선명해질 때까지 상기 빔을 초점현미경은 카메라 칩의 위치에 대응하고; 스폿이 포화되지 않도록 레이저 출력을 감소시킨다. 잘 정렬 된 시스템이 레이저 전원이 한 빔 모드 (약 0.6 mW의 레이저 전원이 작동합니다)에서 작업 할 때 인근 이상이어야한다는 것을 의미한다.
- 그 자리는 센터 떨어져 크게 경우, 앞의 BM (또는 단일 빔 스캔 스캐너를) 미러를 조정하여 가까운 센터로 이동합니다.
- 또한, 즉 "S"빔 다른 편광을 정렬 할 때, 이제, 2 - 빔 모드로 전환 "S"셔터를 열고 만 "S"셔터가 열려있는 경우 (하나의 빔이 볼 수있는 빔의 위치를 검사 ).
- 완료되면, 4 빔 모드로 전환하고 "P"편광 모드 ( "P"셔터 개방)를 사용합니다. 이제 두 빔릿가 나타납니다.
- 두 빔릿 완벽하게 카메라의 뷰의 아래쪽 가장자리에 평행하고, 떨어져 2.8 μm의 수를 설정할 수 있도록 준비.
- 이들이 적절하게 정렬되지 않으면, BM의 제 1 미러를 조정한다.
- 두 개의 빔이 음 분리와 완벽하게 수평으로 배열 2.8가 될 때까지 대신 거울을 이동하는 두 개의 주변 장치 나사를 사용, 중간에 나사를 정렬하지 마십시오.
- 이제 "P"편광의 8 - 빔 모드로 전환하고, 4 빔릿 2.8 UM에서 등거리이고, 이미지의 하부 에지에 평행하게 배치 될 때까지 제 BM 밀러 (도 빨간 점없이)를 조정한다.
- 각각 32 빔 모드, 3, 4 BS 거울을 조정 - 16에서 반복합니다. SI-알고리즘, 간단한이 최소 - 최대 (힐로) 알고리즘되고,이 가정에 기초하기 때문에 빔릿 등거리이어야하는 것은 중요하다.
- w, 여기 빔의 주차 위치로 이동HICH는 일반적으로 스캐너 좌표, 예를 들어 (10,000 10,000)의 큰 값에 배치됩니다.
- CCD 카메라와 함께 (멀티 빔) 이미지를 스캔합니다. 이미지가 선명한 유니폼과 직선이 나타나는지 확인합니다.
- 이미지를 회전 것 같으면 카메라를 조정 : 이미지가 정리 될 때까지 (! 온유) 손으로 축 방향으로 수직 축을 중심으로 카메라 본체를 비틀어.
- 멀티 빔 주사의 경우, 즉, Y 스캐너의 미러를 이동. 이차 줄무늬 화상을 생성하는 방식으로 빔릿 라인에 수직.
- 단계 17.1에 설명 된대로 시야가 발생합니다. 빔 렛 라인이 두 배로 빔릿은 전체 라인을 따라 등거리되는 것을 보장하는 위치로 x-스캐너의 미러를 이동하여 스캔 루틴을 연장 너무 작다. 정확한 움직임을 반복합니다x-스캐너 미러는 스트라이프 확대 화상을 생성하는 이동 Y 스캐너 미러의 전후.
- 원하는 스트라이프 화상을 생성 - 과학자에 의해 정의 - 단일 빔 주사의 경우, 등거리의 위치에 반복적으로 x-스캐너 미러 움직임-Y 스캐너 미러의 움직임을 번갈아.
- 일정 속도 (감소 가속 / 감속)에 대한 Y-스캐너 거울 명령의 움직임과 최대 속도 (최대 가속 / 감속)의 X-스캐너 거울 하나에 사용할 수 있는지 확인하십시오.
- 충분히 반복 단계 사이의 적절한 단계 길이 선택두 개의 연속 된 빔릿 (이 경우 2.8 μM 및 스캐너 미러의 하나의 단계가 25 nm의 동일) 사이의 거리를 커버하는 두 개의 연속 스트라이프 이미지; 조금 중복을 허용하는 것이 바람직 할 수 있으며, 추가로 0.3 ~ 0.4 μm의 즉.
- 주어진 파장에서 측 방향 해상도 한계와 일치 값 x-시프트를 설정한다. 예를 들어, 이동, 12 또는 13 교대 당 X-스캐너 거울의 10 단계를 사용하여지도에 가장 축이 시스템의 측면 해상도 결과 모두. 번호가 사용되는 시스템에 가장 적합한 구조화 된 슬라이드, 예를 들면 Convallaria 뿌리 슬라이드, 확인하십시오.
- Convallaria 이미지가 선명해질 때까지이 두 값을 최적화 : 계산 된 SI 이미지에서 라인 프로파일 도구를 사용하여 라인 프로파일 (Convallaria 세포벽에서 형광 신호이다)의 폭과 비교.
- 스캐너의 움직임과 동기화 각 스트라이프 이미지를 획득하여 따로 저장, 예를 들어,
의 intravital 이미징 마우스 예방 접종 및 준비
동물 실험은 동물 복지 (LAGeSo, Landesamt FÜR 아퍼 싶게 Soziales, 베를린)에 해당하는 국가위원회에 의해 승인되었고, 현재의 지침과 규정 (동물 실험 라이센스 G0153/08)에 따라 수행되었다.
- 4 전에 설명한대로 오금 림프절 및 이미징 필드의 제조에서 본원 중심 응답 유도를 수행 하였다. immunomagnetically의 비장에서 B 세포를 정화 B1-8 + / + Jκ - / -와 B1-8 + / + Jκ의 B 세포 - / - GFP + 마우스.
- / - + / - + Jκ ⅛ B1-8을 사용하여> 95 %의 순도로 정맥 3 × 106 NP 특정 B 세포를 주입 GFP + 및 ⅞ 비 형광 B1-13 + / + Jκ - / - C57BL / 6받는 소재 .
- 셀 전송 후 어느 날 NP-CGG 오른쪽 뒷다리 음식 패드에 완전 프로 인트 아쥬 반트 (CFA) 유화 (니트로 페닐 - 닭 ɣ 글로불린)의 10 μg과받는 사람 면역.
- ATTO590 - 숙신 에스테르와 anti-CD21/CD35 항체의 라벨 Fab 단편.
- , 생체 내에서 싹 센터에서 여포 수지상 세포의 네트워크 (FDC)을 강조의 intravital 분석이 수행되기 전에 쥐 12 ~ 24 시간의 오른쪽 뒷다리 발바닥에 형광 색소 표지 Fab 단편의 10 μg을 주입합니다.
다음 단계는 conside해야의 intravital 이미징을위한 오금 림프절 (하루 8 ~ 10 예방 접종 후)의 준비를 위해 빨간색 :
- 케타민 / 자일 라진의 IP 주입, 자신의 체중에 따라 양에 마우스를 마취.
- 전체적인 촬상 기간 동안 마취 깊이를 모니터링하기 위해 테스트 반사.
- 다시 다리, 엄격한 마우스의 오른쪽 측면을 면도하고 완전하게 남아있는 머리카락을 제거하기 위해 제모 크림을 사용합니다.
- 주요 우측 대퇴 전자 수정 : 손가락 뼈 칩을 찾은 작은 흰색 삼각형 모양의 밴드가 나타날 때까지 가위로 작은 피부 절개를 설정합니다.
- 제한 기의 날카로운 핀셋이 근막 아래 뼈 칩을 클램프.
- 이빨 핀셋을 사용하여 요추 영역에서 척추를 고정합니다.
- 제한 수단을 마우스 오른쪽 뒷다리를 고정하고 나사를 조입니다.
- 올바른 위치에있는 다리를 유지하는 테이프의 꼬리.
- 허벅지의 꼬리 측면에서, 지역 유명 슬와 정맥 차가운 제품으로, 피부에 절개를 만들RS 조직, 무딘 핀셋 기본 조직으로부터 피부를 분리하고 말단에 인접한에서 슬와 정맥을 따르십시오.
- 무딘 집게를 사용 림프절을 노출 (노출 동안 PBS에서 림프절을 계속) 미세 림프관을 보호하기 위해 절단 피하려고.
- 림프절 주위에 진공 그리스의 원형을 만들어, PBS에이 웅덩이를 입력합니다.
- 그 위치에 커버 슬립을 넣고 온도계 프로브 (그렇지 않으면 셀 속도가 극적으로 변화 할 것이다, 37 ° C 온도에서 보관) 놓습니다.
- 커버 슬립의 위쪽 가장자리를 따라 진공 그리스의 원을 추가합니다.
- , 진공 그리스에서의 위치에 가열 코일을 넣어 이전과 비슷한 방식으로 실을 만들고 목표로 찍어 유리 커버 슬립에 물 / PBS를 추가합니다.
- 치사량에 케타민 / 자일 라진의 투여 량을 증가하고있는 동안 촬영 한 후, 마우스는 자궁 경부 전위 다음으로, 마취에 보관됩니다.
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Representative Results
림프절의 공간 해상도
효과적인 점 확산 함수 (EPSF)의 치수는 현미경 (12)의 공간 해상도에 대응한다. 우리는 (CCD 카메라에 의한) 설립이 광자 레이저 스캐닝 현미경 기술, 즉, 전계 검출 TPLSM에 비해 트립 MB-SI-TPLSM 의해 림프절에서 콜라겐 섬유의 제 고조파 발생 신호를 획득하여이 삼차원 함수를 측정하고, 포인트 검출 TPLSM (PMT의에 의해).
이러한 측정으로부터, 시료의 표면에서, 양 측 방향 및 축 방향의 해상도가 회절 이론 (20)에 의해 예측 된 기대 값과 일치하는 것이 명백해진다. 그러나, 증가하는 촬상 깊이로함으로써 매우 다양한 굴절률을 가진 매체를 통해 여기 및 방출 방사선 양자의 광로가 증가함에 따라, 공간 해상도는 앵드 상당히 저하화질 등 고용 설정의 (그림 2). MB-SI-TPLSM으로 우리는 독립적으로 영상의 깊이, 약에 도달했습니다. 20 % 더 나은 측면 해상도와 표준 TPLSM 방식에 비해 220 % 향상 축 해상도.
본원 센터에서 여포 수지상 세포에 면역 복합체의 역학
면역 반응 중에 B 세포의 클론 선택, 성인 마우스의 차 림프 기관 내에서 메모리 B 세포 또는 형질 세포 4로 분화하는 길에 첫 번째 단계입니다. 이 과정에서, 본원 센터 내의 면역 복합체 구조물 (몇 단백질 분자의 클러스터)의 수준에서 모낭 돌기 세포 (FDC) 및 B 세포 간의 고도의 동적 상호 작용은 중심 역할을하는 것으로 여겨진다. 남은 높게 해결의 intravital 현미경 기술을 이용하여이 셀룰러 통신 및 면역 반응에 대한 그 영향을 해부하는 것이 가능하다. M의 우리의 접근 방식B-SI-TPLSM 처음에 120 μm의 깊이에, 여포 수지상 세포에 anti-CD21/35-Fab-ATTO590에 의해 표시로 intravitally 면역 복합체 예금의 클러스터의 크기를 시각화하고 정량화 가능성을 제공합니다 오금 림프절 (그림 3a 및 3b)의 싹 센터. 이러한 구조는 표준 TPLSM 방식으로 볼 수는 없지만, 우리는 개별적으로 식별하고 심지어 우리의 접근 방식을 사용하여 자신의 역학을 시각화.도 3E 및 통찰력을 지원하는 3 층, 새싹 센터에서 면역 세포 예금의 3 차원 형광 이미지 사이의 직접 비교를 표시 할 수 기존의 TPLSM 인수로 (PMT 기반) 및 MB-SI-TPLSM. 또한, 본원 센터 B 세포와 면역 복합체 예금의 상호 작용은 매우 (그림 3C 및 3D, 영화 1, 2) 해결 될 수 그리고 지금 할 수있다증식, 분화 또는 세포 사멸에 대한의 intravital 기능 프로브와 함께 nvestigated. 다음 단계에서, 우리는 또한 이차 림프 기관에서 B 세포 클론 선택을위한 다른 결정적인 현상을 구성하는 것으로 T 헬퍼 세포와 생식 B 세포의 동적 통신을 조사하기 위해 우리의 접근 방식을 사용합니다.
.. 조정 가능한 FS-펄스 티의 그림 1 원리와 멀티 빔 줄무늬 - 조명 두 광자 레이저 스캐닝 현미경의 설정 빔 : 사 레이저 (파장 범위 690-1,080 nm의, 140 FSEC, 80 MHz의) 감쇠 λ / 2 판과 박막 편광자 이루어지는 모듈에 의해, 그 펄스가 프리즘 기반 GVD 보상 모듈에 미리 압축되고, 최종적으로 분할 2, 4, 8, 16, 32 또는 64 빔빔릿 라인을 형성한다. 줄에서 두 개의 연속 빔릿은 (빔릿 라인에 빨간색과 녹색 표시) 수직 편광이 간섭을 피하기 위해 시간에 이동합니다. 두 개의 연속 빔릿 사이의 시간 이동은 3 PSEC에 달한다. 잘 정의 된주기적인 패턴이 생성되도록 이미지 수집의 경우, 빔릿 라인은, 대물 렌즈 (20 배 침수 대물 렌즈, NA 0.95, WD 2mm)하여 샘플에 초점을 맞추고 수직 스캔됩니다. 이 패턴은 빔릿 라인을 따라 번역됩니다. 이미지의 시리즈는이 방법이 마지막으로 최소 - 최대 알고리즘에 의해 평가 EM-CCD 카메라에 의해 필터 휠에 장착 된 간섭 필터를 통해 감지 생성. PMT 검출을 기반으로 단일 빔 TPLSM는 동일 현미경으로 수행 하였다. 이 경우, 우리는 샘플을 스캔하는 하나의 레이저 빔을 사용하고, 우리는 스펙트럼 적으로 대응하는 이색 거울 및 간섭 필터 앞에 검출과 형광 신호를 해결광전자 증 배관 튜브로 주입. 또한, 대신 티의 :. 사 레이저 빔, 광 파라 메트릭 발진기의 빔은 장파장 MB-SI-TPLSM을 수행하기 위해 현미경에 결합 할 수있는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표준 PMT 기반 및 다 초점 CCD 기반 TPLSM에 비해 멀티 빔 스트라이프 - 조명 TPLSM의 그림 2. 공간 해상도. () 대표 축 프로파일뿐만 아니라 XY과 림프 내에서 100 μm의 깊이에있는 콜라겐 섬유의 SHG의 XZ 전망 노드. lexc = 900 nm의, 검출 파장은 447 ± 30 nm의 광자 플럭스 Φ = 4.75 × 10의 범위
그림 3 MB-SI-TPLSM로 싹 센터의 intravital 이미징 haptene으로 예방 접종을 마우스에 CD21/35-Fab-ATTO590 (적색)로 표시 싹 센터의 빛 영역의 () 3 차원 형광 이미지 -.. 닭 γ -GLobulin (NP-CGG) B1-8 EGFP + B 세포 (녹색)의 입양 전송 후. 여포 수지상 세포 (FDC)에 면역 복합체 예금 (CD21/35 라벨링)는 줌 - 인 (B)의 이미지 (A)에서 관찰로, 개별적으로 시각화하고,에 (측면 및 축 방향 모두) 치수가 될 수있다 최대 120 μm의 깊이는 400 ~ 800 ㎚의 범위. 면역화 B1-8 + EGFP 마우스의 생식 중심 B 세포 (c), 면역 반응의 성숙을위한 부분적으로 책임이 접점 (d) 동안 이제 시각 수 검출된다. EXC λ = 850 nm의, 검출 파장은 605 ± 20 nm의 (ATTO590)과 525 ± 25 nm의 (EGFP), 광자 플럭스 Φ = 7.05 × 10 28 광자 / cm 2 · 초까지 다양합니다. 스케일 바 (a) 20 μM, (b) 10 ㎛, (c) 30 μM, (d) 10 μM. 내 같은 지역의 3 차원 형광 이미지MB-SI-TPLSM (E) 기존 (PMT-기준) TPLSM에 의해 기록 된 CD21/35-Fab-ATTO590으로 표시 싹 센터의 빛 영역 (F)이었다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.
영화 캡션
영화-1 및 -2
면역 복합체 차 여포 수지상 세포에 예금 (FDC)와 싹 센터 B 세포와의 상호 작용 MB-SI-TPLSM에 의해 기록 된대로의 역학. / - - EGFP + 세포 (녹색) 싹 센터 B 세포 B1-8 Jk의 반면 면역 복합체 보증금 CD21/35-Fab-ATTO590 (적색)로 표시되어 있습니다.
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Discussion
의 intravital 광학 영상의 목적은 동적으로 기능적 조직과 건강과 질병 5 장기의 기능을 이해하기 위해 세포 운동성 및 상호 작용을 시각화하는 것입니다. 이러한 다중 광자 레이저 주사 현미경을 달성하기 위해 가장 강력한 기술은, 아직, 그 공간 해상도를 제한 전면 왜곡 산란 느린 취득 photobleaching에 및 광 손상을 거절 관련된 한계를 극복 대조뿐만 아니라 시간 해상도를 가지고 .
이 성공적인 나은 여진을 달성하기 해법 (및 발광) 깊은 조직보다 공간적 해상도에 이르는, 콘트라스트 증가 (증가 된 신호에 증가 된 신호 - 대 - 잡음 비) 및, 따라서, 감소 광표백 및 광 손상에 광자 관리가있다 : 적응 광학 방식과 더 이상 여기 파장의 사용 - 조정 가능한 적외선 여기 6. 지난 10 년, 파면 대응의 개념적응 광학으로 ction의 다중 광자 현미경으로도 바이오 광학 영상에 천문학에서 전송하고있다. 처음 적응 광학은 파면 감지에 의존 천문학 유사한 subdiffraction 기준, 즉 "가이드 스타", 필요한 두 개의 광자 현미경에 접근하는 동안, 현재의 시스템은 깊은 조직 영상 (12)에 더 적합합니다. 예를 들어, 그들은 13, 15 감지 파면의 여기 방사선의 일관성 게이팅을 사용하거나 학생이 17 세그 이후 그들은 전혀 외부 파면 감지를 사용하지만, 두 이미지의 교차 상관 관계를 기반으로 적응 알고리즘을 개발하지 않습니다 IMPACT 16, 또는 그들이 파면 왜곡 및 산란 효과 (20)의 특성을 광 음향을 사용 - 최적의 파라미터와 보정되지 않은 이미지와 이후의 간섭 이전 반복 단계에서 얻은 반복적 확률 검색에. 그러나 매우 다양한 냉동 설비에 의한보정 단계는 상대적으로 작은 영역에 대해 반복되어야하는시기 조직에서 활성 지수는 적응 광학 접근 방법은, (약 10 × 10 ㎛ 2) (16)보다는 느리다. 또한, 어느 파면 또는 산란 효과 보정하여, 최대 달성 가능한 공간 분해능은 여전히 회절에 의해 제한된다.
우리의 접근은 부분적으로 파면 수차와 산란의 부담을 극복 할 수 있지만, 또한 회절 한계를 넘어 해상도를 민다. 높은 개구 수 대물 렌즈를 사용하여, 축 방향의 해상도에 대한 절대 값은 약 400 내지 20nm 향상시킬 수있다. TPLSM 종래에 비해 개선 된 해상도를위한 가격이 깊은 조직에서의 신호 - 대 - 잡음 비의 급격한 감쇠이다. 이것은 MB-SI-TPLSM 필드 검출 사용의 필요성 때문이다. (15) 전에 도시 된 바와 같이, 대신 포인트 검출기 필드 검출기의 사용은 SNR 뒤이 가파르게 감쇠와 관련된전용 필드 탐지와 관련이 방출되는 빛의 강한 산란 전자. 따라서, 필드 검출 TPLSM 방법의 최대 이미징 깊이는 약입니다. 기존 (기반 즉, 포인트 검출) TPLSM에 비해 25 % 감소했다. 간단 실용적인 해결책은 더 이상 여기 파장을 적용하고 더 긴 방출 파장을 검출하는 것이다. 당연히, 이것은 MB-SI-TPLSM에서와 같은 정도의 기존 TPLSM에 깊이 의존 SNR을 향상시킵니다.
지금까지 획득 속도에 관한 한, MB-SI-TPLSM은 갈바 스캐너 및 / 또는 32 개의 레이저 빔이 수에 빔 분할의 카메라와 이윤 판독 기준 속도에 의해 제한된다. 표준 멀티 빔 카메라 기반 TPLSM에 비교하여, MB-SI-TPLSM 인해 스캔 할뿐만 아니라, 동기 대강의 각각을 취득뿐만 아니라 필요에 약간 느리다. 스트라이프 (10)는 최종적인 고해상도의 화상을 생성하는 이미지 조명. 그러나, 우리의 기술은 CL을 유지(단일 빔 스캐닝 포인트 검출 기준) 기존 TPLSM에 귀에 속도 장점. 따라서, 150 × 150 μm의 2 (512 X 512 픽셀)의 획득 시간은 MB-SI-TPLSM를 사용하여 기존의 TPLSM (스캐너 주파수 800 Hz에서) 109 밀리 초를 사용하여 841 밀리 초입니다. 신호가 모두 설정 비교 가능한되도록 이로써, 빔 당 여진 전력 및 픽셀 당 지속 시간은, 종래와 MB-SI TPLSM 모두에 대해 동일하다. 이전에 photobleaching에, 20을 입증하고 MB-SI-TPLSM 실험에서의 광 효과는 낮은 잘 수행 기존의 TPLSM에 필적으로.
향후에는 더욱 구조화 조명 (21)에 대한 적응 광학 업적 유사한의 intravital TPLSM을 향상시키기 위해 적외선 범위에서 적응 광학 스트라이프 - 조명의 상보 방식을 결합하는 것이 바람직 할 것이다. 그러나, 이러한 목표를 달성하기 위해, 상당히 빠른 적응 - 광학 접근법개발되어야한다.
생명 과학 및 생물 의학의 스트라이프 - 조명 방식의 예상 높은 영향은 해상도를 개선하고 깊은 조직의 대비를 향상, 파면 왜곡을 중화시키는 효과를 산란, 또한 레이저 스캐닝 현미경의 회절 한계를 넘어로하는 능력에 달려있다 단순히 스캐닝 프로세스를 제어하고 적절히 구분 필드 검출부를 선택할.
생명 과학 및 생물 의학의 스트라이프 - 조명 방식의 예상 높은 영향은 해상도를 개선하고 깊은 조직의 대비를 향상, 파면 왜곡을 중화시키는 효과를 산란, 또한 레이저 스캐닝 현미경의 회절 한계를 넘어로하는 능력에 달려있다 단순히 스캐닝 프로세스를 제어하고 적절히 구분 필드 검출부를 선택할.
스트라이프 - 조명 접근법의 intravital 깊은 조직 임에 대해 적용 할 수있다단일 빔 주사에 galvoscanner 이동 카메라 감지를 동기화 할 수있는 모든 두 광자 레이저 스캐닝 현미경 노화. 이 경우, 여기 패턴 내의 하나의 스트라이프는 연속적이 아닌 동시에 MB-SI-TPLSM 같이 생성된다. 우리는 자연스럽게 기존의 TPLSM (단일 빔 스캐닝, 포인트 검출기 기반 TPLSM)하지만 시연으로 공간 해상도와는 대조적으로 같은 개선에 비해 형광 이미지의 약간 느린 수집 속도를 기대 SI-TPLSM에서 단일 빔 스캐닝을 사용하여 MB- SI-TPLSM. 함께 영상의 깊이 제한과 낮은 수집 속도는 상당히 MB-SI-TPLSM에 비해 단일 빔 SI-TPLSM의 적용 범위를 줄일 수 있습니다.
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Disclosures
폴커 안드레 독일 LaVision 바이오텍 GmbH의 빌레펠트의 주주입니다. 다른 저자는 이익의 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 C57BL / 6 B1-8 GFP 형질 전환 마우스를 제공하기위한 스트라이프 - 조명 방식, K. Rajewsky 및 A. Haberman의 개발 기간 동안 유익한 토론을위한 R. Heintzmann 감사합니다. 우리는 재정 지원에 대한 독일 부여 NI1167/3-1에서 Forschungsgemeinschaft (RN에), HA5354/4-1 및 SFB633, 프로젝트 A15 (AEH에) 부여 한 Rahel - 허쉬의 교제에서 샤리 (RN에)을 인정합니다. 우리는 특히 유익한 토론과 인프라 지원을위한 네트워크 JIMI을 인정
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATTO590 – NSH for coupling | ATTO Tec, Germany | AD-590-35 | |
| CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 | DRFZ, Berlin | The coupling reaction was performed in the central lab of our institution. | |
| B1-8 Jk-/- EGFP+ | Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US | Can be also found at Jackson Laboratories (JAX). | |
| EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment | StemmCell Technologies, Germany | 19854 | |
| Polystyren beads (605), 0.2 µm | Life Technologies, Germany | F8803 | |
| Equipment | |||
| TriMScope I | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| OPO (manual version) | APE, Berlin, Germany | ||
| Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II | Coherent, Duisburg, Germany | ||
| Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm | Olympus Germany, Hamburg, Germany |
References
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