Summary
De alta resolução de imagem intravital com melhor contraste de até 120 mM profundidade em linfonodos de camundongos adultos é conseguido através espacialmente modular o padrão de excitação de um multi-focal microscópio de dois fotões. Em 100 microns de dimensão medimos resoluções de 487 nm (laterais) e 551 nm (axial), evitando, assim, os limites de espalhamento e difração.
Abstract
Monitoramento de comunicação celular por microscopia multi-fotão-tecido profundo intravital é a chave para a compreensão do destino das células imunes dentro amostras de tecido grosso e órgãos de saúde e doença. Ao controlar o padrão de varredura em microscopia multi-fotão e aplicar algoritmos numéricos apropriados, desenvolvemos uma abordagem listrado-iluminação, o que nos permitiu alcançar 3 vezes melhor resolução axial e melhor relação sinal-ruído, ou seja, o contraste, em mais de 100 mM de profundidade de tecido dentro dispersores tecido de órgãos linfóides, em comparação com microscopia multi-fotão padrão. A velocidade de aquisição, bem como de fotobranqueamento e fotoenvelhecimento efeitos foram semelhantes à técnica de foto-multiplicador baseado no padrão, ao passo que a profundidade da imagem era ligeiramente inferior devido à utilização de detectores de campo. Usando a abordagem de risca-de-iluminação, somos capazes de observar a dinâmica de depósitos de complexos imunes nas células dendríticas foliculares secundárias ̵1; sobre o nível de algumas moléculas de proteínas nos centros germinais.
Introduction
Microscopia de varredura a laser de dois fótons (TPLSM), com as suas vantagens para a geração de imagens de tecidos profundos relacionados ao infravermelho excitação pulsada ultra-curto 1, revolucionou nossa visão sobre os processos vitais em um nível de uma única célula, revelando motilidade e interação de vários padrões subconjuntos de células em animais vivos 2-5. No entanto, a tecnologia atual ainda é insuficiente para explicar os mecanismos da função de órgãos e disfunção como um pré-requisito para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, uma vez que torna únicas informações esparsas sobre a base molecular da resposta celular nos tecidos na saúde e na doença. A tecnologia actual permite apenas uma janela espaço de algumas centenas de microns, devido ao espalhamento da onda e os efeitos de distorção da frente sobre a resolução espacial e de sinal-para-ruído 6, que são particularmente evidentes no tecido altamente compacta de animais adultos. Esses efeitos de distorção da frente de dispersão e onda são devido a uma uma grande heterogeneidaded distribuição anisotrópica de o índice de refracção no tecido, conduzindo a um primeiro passo para uma profundidade deterioração depende da resolução espacial 3D e finalmente para a perda total do sinal proveniente de fotões de excitação balísticos, ou seja, a perda de relação de sinal-para-ruído. Em termos de aplicações de tecido profundo biomédicas biotecnocientíficas e, isso significa que a tecnologia atual não é capaz de revelar de forma inequívoca a comunicação celular, porque pobre resolução levaria a interações falsamente positivos enquanto que a diminuição da relação sinal-ruído faria com que o sistema a ignorar alguns interações entre as estruturas fracas.
A fim de detectar de forma inequívoca interações celulares de uma forma dinâmica, uma resolução espacial muito melhorado é necessário profundo no interior do tecido. As técnicas Nanoscopia poderosos atualmente introduzidas com base em algoritmos numéricos especiais, por exemplo, abordagens estrutura de iluminação, sobre o esgotamento do primeiro estado animado, por exemplo, por exemplo, dSTORM, PALM, encontraram muitas aplicações em células fixas, bem como em culturas de células vivas 7. No entanto, a fim de estender esses aplicativos para cortes de tecidos, tecidos vivos e organismos ainda precisamos superar as dificuldades técnicas graves. Dois fotões de excitação STED com diferentes comprimentos de onda, bem como com um único comprimento de onda (sw2PE-STED) para a excitação e a emissão estimulada tem sido aplicado para melhorar a resolução lateral em fatias de cérebro ou em oito matrizes artificiais com células embutidas 9, respectivamente, ao mesmo resolução axial como TPLSM padrão. Usando um fotão STED, a dinâmica das espinhas dendriticas pode ser trabalhada na superfície do córtex cerebral (até 10-15 microns de dimensão) de um rato vivo Thy1 EGFP com uma resolução de 67 nm, 10. Uma ferramenta versátil para a biologia do desenvolvimento é fornecida pela microscopia estruturada-iluminação multifocal, que fornece duas vezes melhorado 2Dresolução. No entanto, esta técnica só pode ser utilizada em organismos com baixa propensão de espalhamento de luz, como embriões de peixe zebra 11. Ainda, nenhuma destas técnicas pode ser aplicado no tecido altamente espalhamento de animais adultos em várias centenas de micrómetros, que são modelos cruciais para a investigação biomédica e clínica de doenças com inicio após o nascimento.
Independentemente da aproximação usada para calcular a forma da frente de onda de difração limitada, ou seja, a função de contagem de pontos (PSF), concentrando-se depois através de uma lente, a largura do PSF ao longo do eixo óptico (resolução axial) é, pelo menos, três vezes maior do que a largura PSF perpendicular ao eixo óptico (resolução lateral) 12. Acene distorções da frente de diferentes ordens quantificados por coeficientes de Zernike modificar consideravelmente a forma da frente de onda da onda eletromagnética focado na geração de imagens de tecidos profundos levando a muito maiores PSFs, especialmente ao longo da ópticaal eixo 13-15. Assim, tanto as leis de difração e os efeitos de distorção da frente de onda apontar para a resolução ao longo do eixo óptico, como o fator limitante na geração de imagens de tecidos profundos. Considerando que as técnicas Nanoscopia concentrar em contrariar os limites da difração só, uma tecnologia que melhora a resolução axial e contraste por contrariar tanto difração e efeitos de distorção de onda-frente é necessária para alta resolução de imagens intravital. Idealmente, esta técnica deve ser igualmente rápido o suficiente para permitir o monitoramento da dinâmica celular.
A correção em tempo real das aberrações do PSF e perda de contraste usando óptica adaptativa em TPLSM tem sido amplamente estudado e melhorado na última década 13,14,16-18 e, portanto, é a melhor escolha atualmente disponível levando a uma melhor gestão da excitação balístico fótons 14. Ainda assim, devido ao fato de que a maior onda de correção frente abordagens utilizadas na óptica adaptativa são iterativos e que have ser repetido para pequenas áreas (poucos 10 x 10 um 2), devido à grande heterogeneidade do índice de refracção no tecido, a velocidade de aquisição é significativamente menor do que o necessário para a motilidade das células de imagiologia e de comunicação. Além disso, o limite físico em ótica adaptativa melhorou TPLSM ainda é determinada por difração.
Modulação espacial de iluminação (SPIN) e modulação temporais no lado de detecção (pá) foram teoricamente proposto para ser aplicada a microscopia de varrimento de laser para melhorar a resolução. A sua aplicação prática em imagens intravital ainda precisa ser demonstrado 19.
Tomados em conjunto, há uma alta demanda para o desenvolvimento de tecnologias que melhoram a resolução de imagem de tecidos profundos em animais adultos vivos. Neste trabalho, nós conseguimos modulação espacial do padrão de excitação, controlando o processo de digitalização em multi-feixe de risca-de-iluminação multi-fotão de laser-smicroscopia de conservas (MB-SI-MPLSM) 20. Ao contrário do que as abordagens de iluminação estruturada, em que a secção de excitação travessa é espacialmente modulados, usamos apenas o processo de digitalização para alcançar a modulação espacial da excitação. Ao expandir a excitação de um comprimento de onda mais longo, que são capazes de melhorar a resolução espacial e relação sinal-ruído em tecidos profundos de dispersores tecido (por exemplo, do nó de linfa, o caminho livre de espalhamento de 47 mM 6), independentemente da óptica sinal não-linear que detectar, por exemplo, de fluorescência, geração de segundo harmônico ou outra freqüência mistura fenômeno. Usando essa abordagem em comprimentos de onda de excitação de até 900 nm, somos capazes de dinamicamente imagem estruturas de proteína celular na escala de algumas moléculas em centros germinativos dos linfonodos do mouse. Assim, podemos visualizar melhor a interacção entre as unidades de antigénio transportando na superfície das células foliculares dendríticas e células B no processo de sondagem do antigen durante a resposta imunitária de órgãos linfóides secundários.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Instalação Multi-feixe para Striped-iluminação TPLSM
A configuração usada aqui é um multi-feixe de dois fótons microscópio de varredura a laser especializado, como descrito anteriormente 6,20. O sistema encontra-se ilustrada na Figura 1. Esta abordagem pode ser aplicada a outros microscópios de varrimento laser de dois fotões, que são capazes de sincronizar aquisição câmara com o movimento dos espelhos galvoscanner, mesmo que eles só são capazes de realizar a verificação de feixe único . Neste caso, a desvantagem será uma velocidade de aquisição de menor, no entanto, semelhante à velocidade de aquisição em TPLSM baseado no PMT padrão. Para atingir a qualidade ideal medida em resolução e contraste estão em causa, com o menor fotodegradação e fotoenvelhecimento e aquisição mais rápida, é recomendável considerar as seguintes etapas de ajuste da configuração:
- Verifique a potência do laser do laser Tisa: verifique a 100%, compare com os valores originais de fábrica e previonós próprios leituras e usá-lo como ele é, se um comprimento de onda de excitação na faixa 700-1,000 nm é necessária.
- Teste a indicação de controle remoto para o Ti: Sa divisor de feixe, verifique ou seja 0% e 100% configurações. Se houver uma viga remanescente Tisa em 100%, em seguida, verificar e redefinir a posição nula motor de passo. O Ti: Sa divisor de feixe consiste em uma baixa ordem λ / 2 prato e um polarizador, que divide os feixes de laser perpendicularmente polarizados em caminhos perpendiculares: um feixe é direcionado para o microscópio para a excitação, o outro é usado para bombear o paramétrico óptico oscilador (OPO). Ao rodar automaticamente a placa de λ / 2, um ajustamento contínuo do Ti: Sa e poder OPO, respectivamente, é conseguido.
- Ajuste o OPO para o comprimento de onda desejado e medir a potência de saída. Se a energia é muito baixo (com um 4 W Ti: Sa laser em 800 nm, a pessoa deve ser capaz de obter 0,8-1 W de feixe OPO em torno de 1,050-1,100 nm) otimizar o comprimento de onda de bombeamento e verifique as configurações do diae espelho e do cristal se espalharam. Escolha seus valores recomendados ideal, muitas vezes disponíveis como tabelas ou gráficos e, em seguida afinar-los até que a OPO ressoa na saída do comprimento de onda desejado e os aumentos de potência.
- Se o poder ainda é baixo, ajustar os dois espelhos acessíveis do OPO com os quatro botões de ajuste do espelho acessíveis. Faça este passo muito lentamente e em movimentos muito pequenos, alternando entre a frente e finais espelhos.
- Verifique se o Ti: Sa e / ou OPO vigas acertar os espelhos de entrada na posição adequada, central.
- Use um pedaço de papel branco (não muito brilhante ou refletindo!) E um visualizador de infravermelho para observar o feixe OPO eo de maior comprimento de onda Ti: vigas de Sá.
- Usar óculos de protecção ao trabalhar com NIR Ti: vigas SA (geralmente até 720-750 nm é visível para a pessoa média).
- Ajustar a potência (s) de laser tão baixa quanto possível para o processo de alinhamento, de modo a mimizar lesões oculares potencial.
- Sempre mantenha luzes ambiente da sala, por isso que a pupila do olho é restrito.
- Tenha em mente que a potência do laser é de atenuadores que consistem de um prato e polarizadores λ / 2, que não estão em vigor ainda quando o Ti-controlado bem: feixe de Sa-entra na cabeça de leitura!
- Use um pedaço de papel branco (não muito brilhante ou refletindo!) E um visualizador de infravermelho para observar o feixe OPO eo de maior comprimento de onda Ti: vigas de Sá.
- Verifique se o diafragma ponto de entrada é atingido no meio pelo Ti: Sa e / ou OPO feixe; se não, ajustar os últimos dois espelhos antes de o feixe de laser entra na cabeça de leitura.
- Use o espectador IR e um pequeno pedaço de papel branco (mas não brilhante / reflexiva!).
- Sempre fechar o diafragma, a entrada para o microscópio, de modo que a posição do feixe de laser pode ser considerado de forma mais precisa. Importante: Não se esqueça de reabrir o diafragma antes de prosseguir para a etapa 6!
- Ajuste o caminho da luz a laser feixe refletido no microscópio em conformidade. Faça isso em pequenos segmentos e realizar iterativo raio-waLKing.
- Verifique a todo o percurso da luz, se a saída de luz da lente objectiva não é adequada.
- Verifique sempre o caminho da luz quando se utiliza o sistema pela primeira vez depois de um longo período inativo, uma grande reparação, qualquer substituição de elementos ópticos, ou se houver suspeita de problemas de existir com a saída.
- Certifique-se de que todas as superfícies ópticas ativas são limpos, especialmente que eles estão livres de poeira! Se as superfícies são cobertas com uma camada de pó, a frente de onda distorcida é mesmo antes de entrar na lente objectiva e o feixe de laser resultante nunca irá proporcionar uma imagem nítida da amostra!
- Se necessário, limpe os espelhos com um pedaço de papel dobrado lente, umedecido com etanol ou isopropanol.
- Verificar que o feixe de chegada de volta para o espelho, que está localizada directamente por cima do espelho de entrada na extremidade do compressor de impulsos baseado em prisma, depois do percurso da luz é definido. A partir daqui, o raio é refletido into o multiplexador feixe (BM).
- Verificar se o feixe de laser atinge a membrana, que está localizado na entrada do multiplexador feixe, imediatamente antes da placa λ / 2, mudando a polarização do feixe de laser para se adequar aos requisitos de uma banda larga de 50% de transmissão e 50% de reflexão dentro da BM.
- Em primeiro lugar, a fechar o diafragma de modo a que a posição do feixe pode ser julgado com mais precisão e efectuar viga curta entre os dois diafragmas, ou seja, a de a entrada no microscópio e o outro na entrada BM. Para outros microscópios de varredura de feixe único do diafragma deve ser colocado na entrada no xy-scanner.
- Se o feixe não atingir o centro da abertura fechada para baixo, ajustar o espelho acima mencionado, colocada directamente em frente da entrada do diafragma BM. Importante: Não se esqueça de reabrir o diafragma antes de prosseguir para a etapa 10.
- Com o diafragma reaberto, verificar se o feixe de laser atinge os espelhos BM emseu ponto médio. Use uma tira estreita de papel, de modo a não bloquear uma outra parte do complexo-luz caminhos da BM!
- Verifique se o feixe atinge o meio dos espelhos de saída: Espelho superior para polarização paralela "P", espelho de fundo para perpendicular polarização "S". Se não, ajuste o espelho de entrada antes do BM.
- Verifique se o "S" e "P" feixe polarizado permite que grupos de entrar no cubo polarizador e se sobrepõem de forma adequada na entrada no xy-scanner. Ir estes passos no caso de um microscópio de varredura de feixe único é usado.
- Verifique se a luz do laser passa centralmente a digitalização e as lentes de tubo e fica no meio da lente objetiva 'avião de volta focal. Importante: este passo tem de ser feito com o feixe de laser na posição central, não estão em posição de estacionamento!
- Substitua a lente objetiva com uma ferramenta com o objetivo ("olho de boi") e verifique se o feixe de laser atinge o alvo no meio, e se ailuminação é mesmo.
- Se este parece ser o caso, fechar a abertura antes do BM e verificar se um padrão de interferência circular aparece, com um círculo preto no meio (mínimo de interferência).
- Ajuste o espelho de entrada, se houver uma mudança significativa em relação ao centro do olho do touro.
- Agora substitua o olho do touro com uma lente objetiva, por exemplo, com uma lente de imersão em água 20X.
- Verifique o campo de luz de saída com um pedaço de papel branco. Este deve ser brilhante, uniforme e posicionado centralmente.
- Medir a potência de saída: em 100% OPO com 100% de bombeamento Ti: Sa (4 W), deve-se obter aprox. 100-150 mW após a lente de 1,100 nm (no microscópio utilizado aqui). Poderes de laser mais baixas não serão suficientes para a realização de multi-feixe SI-TPLSM. Para a digitalização de feixe único SI-TPLSM, 5-10 mW são suficientes. O feixe de laser deve permanecer na posição central sem ser scanned!
- Se realizar MB-SI-TPLSM, alinhar os espelhos na BM como segue:
- Coloque uma amostra homogénea fluorescente, por exemplo, um deslizamento de fluorescência vermelha, no palco e focar o feixe de laser dentro da amostra, mas perto da superfície superior (ou seja, perto da lente frontal da objectiva).
- Definir o microscópio para o modo multi-feixe e escolher o número de feixes, no inicio, de preferência, apenas um raio, e a polarização, por exemplo, "P".
- Encontre o feixe de laser pela imagem do slide fluorescente: definir o obturador "P" abrir e executar a câmera CCD continuamente enquanto focando o feixe.
- Certifique-se de que o feixe está na posição central, e que o scanner está desligado. Certifique-se que o feixe não é digitalizado!
- Encontre o feixe de olhar para um ponto brilhante perto do centro do chip da câmera.
- Concentre-se o feixe até o local é o mais brilhante e mais nítida, ou seja, o plano de imagem deo microscópio corresponde à posição da câmara de chip; A redução da potência do laser de modo a que o local não está saturado. Com um sistema bem alinhados, isto significa que a energia do laser tem de estar perto mínimo quando se trabalha no modo de um feixe (cerca de 0,6 mW de potência de laser deve funcionar).
- Se o local é significativamente fora do centro, movê-lo para mais perto do centro, ajustando o espelho na frente do BM (ou do scanner para a digitalização de feixe único).
- Quando também alinhar a outra polarização, ou seja, "S" do feixe, agora mudar para o modo 2-beam, abra o obturador "S" e verifique a posição do feixe (apenas um feixe pode ser visto que apenas o botão do obturador "S" está aberto ).
- Quando terminar, mudar para o modo de 4 feixes e usar o modo de polarização "P" (shutter "P" aberto). Agora, dois beamlets aparecerá.
- Organize as duas beamlets ser perfeitamente paralelos à borda inferior de vista da câmera, e pô-los a ser de 2,8 mM de intervalo.
- Se eles não estão alinhados corretamente, ajuste o primeiro espelho da BM.
- Nunca alinhar o parafuso no meio, em vez usar os dois parafusos periféricos para mover o espelho até que os dois feixes são 2,8 hum distante e perfeitamente dispostas horizontalmente.
- Agora mude para o modo de 8-beam na polarização "P", e ajuste o segundo espelho BM (também sem o ponto vermelho) até as 4 beamlets são eqüidistantes de 2,8 um, e estão dispostos paralelamente à borda inferior da imagem.
- Repetir em 16 - e modo de 32-feixe, ajustando os 3 º e 4 espelhos BS, respectivamente. É importante para os beamlets ser equidistante porque SI-algoritmos, o mais simples de ser o algoritmo min-max (HiLo), são baseadas nesta suposição.
- Vá para a posição de estacionamento do feixe de excitação, which geralmente é colocado em grandes valores das coordenadas do scanner, por exemplo, (10.000; 10.000).
- Digitalizar uma imagem (multi-feixe) com a câmera CCD. Verifique se a imagem aparece nítida, uniforme, e em linha reta.
- Ajuste a câmera se a imagem aparece girado: torcer o corpo da câmera axial em torno do eixo vertical com a mão (seja gentil!) Até que a imagem é esticado.
- No caso da verificação de multi-feixe, mover o espelho y-scanner, ou seja. perpendicular à linha beamlet, de modo a gerar uma imagem listrado quadrática.
- Se o campo de visão gerado como descrito no passo 17.1. é muito pequena, estender a rotina de varrimento, movendo o espelho x-scanner para uma posição de assegurar que o feixe de linha-let é dobrado e as beamlets são equidistantes ao longo de toda a linha. Repita o movimento exatodo espelho y scanner após o espelho x scanner é movido para gerar a imagem listrado maior.
- No caso de varredura de feixe único, alterne o movimento espelho y-scanner com x-scanner de movimento espelho várias vezes em posições equidistantes - definidos pelo cientista - para gerar a imagem listrado desejado.
- Certifique-se usar para o movimento do espelho y-scanner de um comando para a velocidade constante (redução de aceleração / desaceleração) e para o x-scanner de espelho, um de velocidade máxima (aceleração máxima / desaceleração).
- Escolha passos repetição suficiente eo comprimento do passo adequado entreduas imagens subsequentes listradas para cobrir a distância entre os dois beamlets consecutivos (neste caso 2,8 um e um passo dos espelhos de scanner iguala 25 nm); pode ser aconselhável permitir um pouco de sobreposição, isto é, um adicional de 0,3-0,4 ^ m.
- Defina o x-mudança para um valor que corresponda ao limite de resolução lateral no comprimento de onda dado. Como um exemplo, usando 10 passos do espelho x scanner por turnos e 12 ou 13 turnos levar a melhor axial e resultados de resolução laterais neste sistema. Verifique com um slide estruturada, por exemplo, Convallaria raízes slide, os números funcionam melhor no sistema que está sendo usado.
- Optimizar estes dois valores até que a imagem se torna mais nítida Convallaria: utilizar a ferramenta de perfil de linha nas imagens SI calculados e comparar a largura dos perfis de linha (que é o sinal de fluorescência a partir de paredes celulares Convallaria).
- Adquirir cada imagem listrado sincronizado com o movimento do scanner e guardá-lo em separado, por exemplo,
Ratos Imunização e Preparação para Imagem intravital
Os experimentos com animais foram aprovados pelos comitês estaduais apropriadas para bem-estar animal (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) e foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos (animais experimento licença G0153/08) atuais.
- A indução de uma resposta do centro germinativo no nódulo linfático poplíteo e preparação do campo de imagem foi realizada como se descreveu antes 4. Purifica-se as células B a partir de baços de imunomagneticamente B1-8 + / + Jκ - / -e as células B de B1-8 + / + Jκ - / - GFP + ratinhos.
- Injectar por via intravenosa 3 x 10 6 células específicas NP-B com uma pureza de> 95%, utilizando ⅛ B1-8 + / + Jκ - / - + GFP não fluorescente e ⅞ B1-8 + / + Jκ - / - em C57BL / 6 receptores .
- Um dia após a transferência de células imunizar os recipientes com 10 mg de NP-CGG (nitrofenil-globulina de galinha ɣ) emulsionado em adjuvante completo de Freund (CFA) no bloco de alimentação posterior direita.
- Fragmentos de anticorpos Fab etiqueta anti-CD21/CD35 com éster ATTO590-succinimidilo.
- Para realçar a rede de células dendríticas foliculares (CDF) dentro do centro germinal in vivo, injectam 10 ug de fragmentos Fab marcado com fluorocromo na almofada da pata traseira direita dos ratos 12-24 horas antes da análise é realizada intravital.
Os seguintes passos devem ser considevermelho para a preparação do linfonodo poplíteo para imagens intravital (dia 8-10 após a imunização):
- Anestesiar rato por injecção ip de cetamina / xilazina, a quantidade dependendo do seu peso.
- Teste reflexos para monitorizar a profundidade de anestesia ao longo de todo o período de imagem.
- Shave perna, costas e flanco direito do rato rigorosa e usar creme Depilating para remover pêlos residual completamente.
- Fix trocânter maior direito: localizar chip de ósseo com os dedos, coloque uma pequena incisão na pele com uma tesoura até um pequeno branco fascia forma de triângulo aparece.
- Braçadeira de chips óssea abaixo desta fáscia com pinças pontudas do limitador.
- Fixe a coluna na área lombar, usando uma pinça dentada.
- Fix pata traseira direita em limitador e aperte o parafuso.
- Fita cauda para manter a perna na posição direita.
- No lado caudal da coxa, criar uma incisão na pele, na área em que a veia ente poplítea proeminenters o tecido, separar a pele do tecido subjacente com uma pinça sem corte e seguir a veia poplítea de proximal para distal.
- Exponha o linfonodo, usando uma pinça sem corte, para tentar evitar o corte, a fim de proteger os finos vasos linfáticos (manter o linfonodo em PBS durante a exposição).
- Criar um círculo de graxa de vácuo ao redor do nó de linfa, preencher essa poça com PBS.
- Coloque tampa deslizante na sua posição e colocar a sonda-termómetro (manter a temperatura a 37 ° C, caso contrário a velocidade das células irá variar dramaticamente).
- Ao longo da borda superior da lâmina de cobertura adicionar um círculo de graxa vácuo.
- Coloque a bobina de aquecimento na sua posição sobre a graxa de vácuo, criar um selo de forma semelhante como antes e adicionar água / PBS sobre a lamínula de vidro para mergulhar o objetivo em.
- Após a imagiologia, o rato é mantido em anestesia, enquanto o aumento das doses de cetamina / xilazina a uma dose letal, seguido por deslocação cervical.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A resolução espacial nos linfonodos
As dimensões da função de ponto de difusão efetivo (EPSF) correspondem à resolução espacial de um microscópio 12. Medimos essa função tridimensional através da aquisição do sinal de segunda geração harmônicos de fibras colágenas em linfonodos pela nossa MB-SI-TPLSM, em comparação com as técnicas estabelecidas de dois fótons de microscopia de varredura a laser, ou seja TPLSM detecção de campo (por meio de câmeras CCD) e TPLSM detecção de ponto (por meio da PMT).
A partir destas medições, torna-se óbvio que a superfície do espécime, tanto as resoluções laterais e axiais correspondem aos valores esperados previstos pela teoria de difracção 20. No entanto, com o aumento da profundidade da imagem e, portanto, com o aumento do caminho óptico de tanto excitação e emissão de radiação por meio da mídia com bastante variação do índice de refração, a resolução espacial se deteriora consideravelmente, indedentemente da configuração empregada (Figura 2). Por MB-SI-TPLSM chegamos, independentemente da profundidade da imagem, uma aprox. 20% melhor resolução lateral e uma resolução axial 220% superior, quando comparada com as abordagens TPLSM padrão.
Dinâmica dos complexos imunes nas células dendríticas foliculares em centros germinativos
A selecção clonal de células B durante a resposta imunitária, no prazo de órgãos linfoides secundários dos ratinhos adultos é o primeiro passo no seu caminho para se diferenciarem em células B de memória e células de plasma 4. Neste processo, se acredita que a interacção altamente dinâmica entre as células dendríticas foliculares (CDF) e células B ao nível de estruturas de complexos imunes (clusters de algumas moléculas de proteína) dentro de centros germinais de desempenhar um papel central. Somente com o uso de uma tecnologia de microscopia intravital altamente resolver é possível dissecar esta comunicação celular e suas implicações para a resposta imune. Nossa abordagem de MB-SI-TPLSM fornece, pela primeira vez, a possibilidade de intravitally visualizar e quantificar as dimensões dos conjuntos de depósitos de complexos imunes marcado como por anti-CD21/35-Fab-ATTO590 nas células dendríticas foliculares em até 120 microns de dimensão em centros germinais dos nódulos linfáticos poplíteos (figuras 3a e 3b). Enquanto essas estruturas não são visíveis por abordagens TPLSM padrão, podemos identificá-los individualmente e até mesmo visualizar sua dinâmica usando nossa abordagem. Figuras 3e e 3f apoiar essa visão, mostrando a comparação direta entre a imagem de fluorescência em 3D de depósitos de células imunes em um centro germinal como adquirida pela TPLSM convencional (com base em PMT) e MB-SI-TPLSM. Além disso, as interações dos depósitos complexos imunes com centro germinativo as células B podem ser altamente resolvido (Figuras 3c e 3d; Filmes 1 e 2) e agora pode ser investigated em combinação com sondas funcionais intravital para a proliferação, diferenciação ou apoptose. Em uma próxima etapa, vamos usar nossa abordagem para também investigar a comunicação dinâmica de células germinais B com células T helper, que se acredita constituir a outro fenômeno decisivo para a célula B selecção clonal em órgãos linfóides secundários.
.. Figura 1 Princípio e configuração do multi-feixe de risca-de-iluminação de dois fótons microscópio de varredura a laser O feixe de um sintonizável fs-pulsou Ti: Sa a laser (faixa de comprimento de onda 690-1,080 nm, 140 FSEC, 80 MHz) é atenuada por um módulo feito de uma placa de λ / 2 e um polarizador de película fina, os impulsos são pré-comprimida em um módulo GVD-compensação baseada prisma e finalmente dividido em 2, 4, 8, 16, 32, 64 ou vigas,formando uma linha beamlet. Dois beamlets consecutivos dentro da linha têm polarizações perpendiculares (rotulados vermelho e verde na linha beamlet) e são deslocados no tempo, a fim de evitar interferências. O tempo de deslocamento entre dois beamlets consecutivos equivale a 3 psec. Para a aquisição de imagem, a linha beamlet é focado na amostra por uma lente objectiva (imersão em água da lente objectiva 20X, NA 0,95, WD 2 mm) e perpendicularmente digitalizada, de modo a que um padrão periódico bem definido é gerado. Este padrão é traduzido ao longo da linha beamlet. A série de imagens geradas desta maneira são detectados através de filtros de interferência montadas numa roda de filtro por uma câmara CCD EM-e finalmente avaliado por um algoritmo mínimo-máximo. TPLSM de feixe único com base na detecção de-PMT foi realizada com o mesmo microscópio. Neste caso, usamos apenas um feixe de laser para escanear a amostra, e nós espectralmente resolvido o sinal de fluorescência com espelhos dicróicas correspondentes e filtros de interferência antes de detectarção com tubos fotomultiplicadores. Alternativamente, em vez do Ti:. Sa feixe de laser, o feixe de um oscilador paramétrico óptico pode ser acoplado ao microscópio para executar a longo comprimento de onda MB-SI-TPLSM Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Resolução espacial de multi-feixe de risca-de-iluminação TPLSM comparação com TPLSM baseados em CCD-base PMT e multifocal padrão. (A) perfis axiais representativos, bem como xy e xz projeções de SHG em fibras de colágeno em 100 microns de dimensão dentro de linfa nó. lexc = 900 nm, comprimentos de onda de detecção variam 447 ± 30 nm, de fluxo de fótons Φ = 4,75 x 10
Figura 3 imagens intravital de centros germinativos por MB-SI-TPLSM (a) imagem de fluorescência em 3D da zona de luz de um centro germinativo rotulado por CD21/35-Fab-ATTO590 (vermelho) em um rato imunizado com haptene -.. Γ frango -globulin (NP-CgG) após a transferência adotiva de B1-8 EGFP + B células (verde). Os depósitos de complexos imunes (CD21/35) de rotulagem sobre as células dendríticas foliculares (CDF) podem ser visualizadas de forma individual, como observado em (b), a imagem a ser ampliada em (um), e têm dimensões (tanto laterais e axiais) na gama de 400-800 nm, em até 120 microns de dimensão. As células B do centro germinativo no imunizados B1-8 EGFP + rato são detectados (c), enquanto que os contactos (d) parcialmente responsáveis pela maturação da resposta imunitária pode agora também ser visualizado. λ exc = 850 nm, comprimentos de onda de detecção variam 605 ± 20 nm (ATTO590) e 525 ± 25 nm (EGFP), de fluxo de fótons Φ = 7,05 x 10 28 fótons / cm 2 · seg. Escala da barra (a), 20 mM, (b) de 10 um, (c) 30 mM, (d) de 10 um. Imagens de fluorescência em 3D de uma mesma área dentro dazona de luz de um centro germinativo rotulado por CD21/35-Fab-ATTO590 como registrado por MB-SI-TPLSM (e) e convencional (com base em PMT) TPLSM (f), respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Legendas do filme
Filme-1 e -2
Dinâmica de depósitos imunes complexas sobre as células dendríticas foliculares secundárias (FDC) e sua interação com centro germinativo células B como registrado por MB-SI-TPLSM. Os depósitos de complexos imunes são rotulados por CD21/35-Fab-ATTO590 (vermelho), enquanto que as células B do centro germinativo são B1-8 Jk - / - células EGFP + (verde).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O objectivo da imagiologia óptica intravital é dinamicamente e funcionalmente visualizar a motilidade celular e interacções, a fim de compreender a função do órgão e tecido na saúde e na doença 5. A tecnologia mais poderosa para atingir esse microscopia de varredura a laser, multi-fotão, ainda tem que superar as limitações relacionadas com a onda distorções frontais, dispersão, aquisição lenta, fotodegradação e fotoenvelhecimento, que limitam a sua resolução espacial, contraste, bem como a sua resolução de tempo .
Há duas soluções bem sucedidas para alcançar uma excitação melhor (e de emissões) de gerenciamento de fótons em tecidos profundos levando a melhores resoluções espaciais, maior contraste (aumento da relação sinal-ruído, devido ao aumento do sinal) e, portanto, redução de fotodegradação e photodamage : as abordagens adaptativas-óptica eo uso de comprimentos de onda de excitação mais longos - excitação infravermelho ajustável 6. Na última década, o conceito de frente de onda correspondentecção por óptica adaptativa foi transferido da astronomia à imagem bio-óptica e também a microscopia multi-fotão. Enquanto o primeiro se aproxima de óptica adaptativa para a microscopia de dois fótons contou com frente de onda de detecção e precisava de uma referência subdiffraction, ou seja, uma "estrela guia", similar à astronomia, os sistemas atuais são mais adequados para geração de imagens de tecidos profundos 12. Por exemplo, eles usam-gating coerência da radiação de excitação para frente de onda de detecção de 13,15, ou eles não usam qualquer sensoriamento frente de onda externa em tudo, mas desenvolver algoritmos de adaptação em função quer de correlação cruzada de imagens após 17 ou aluno segmentação em busca estocástica iterativa dos parâmetros ideais e interferência posterior com a imagem não corrigida como obtido o passo iteração anterior - IMPACT 16, ou eles usam foto-acústica para caracterizar as distorções da frente de onda e efeitos de dispersão 20. Ainda assim, devido a um refr altamente variávelíndice activo no tecido, as abordagens óptica adaptativa é bastante lento, uma vez que o passo de correcção tem de ser repetido para áreas relativamente pequenas (cerca de 10 x 10 um 2) 16. Além disso, quer por frente de onda ou correção do efeito de espalhamento, a resolução espacial máxima obtida é ainda limitado pela difração.
Nossa abordagem é capaz de superar parcialmente os encargos da frente de onda aberração e de dispersão, mas também empurra a resolução além do limite de difração. Usando lentes objetivas com maior abertura numérica, os valores absolutos para a resolução axial pode melhorar a cerca de 400 nm 20. O preço para a melhor resolução é uma decadência acentuada da relação sinal-ruído em tecidos profundos, em comparação com TPLSM convencional. Isto é devido à necessidade de utilizar a detecção de campo em MB-SI-TPLSM. Como mostrado antes dos 15, a utilização de detectores de campo em vez de detectores pontuais está associada com esta deterioração acentuada do SNR due à dispersão mais forte de luz emitida que é relevante apenas para a detecção de campo. Assim, a profundidade máxima de imagem para detecção de campo métodos TPLSM é de aprox. 25% de redução em relação ao (ou seja, detecção de pontos de base) TPLSM convencional. Uma solução simples é prático aplicar comprimentos de onda de excitação e mais longos para detectar comprimentos de onda de emissão mais longos. Naturalmente, isto melhora a SNR dependente da profundidade na TPLSM convencional para a mesma extensão como em MB-SI-TPLSM.
Na medida em que a velocidade de aquisição em causa, o MB-SI-TPLSM é limitado apenas pela velocidade de scanner galvanométrico e / ou por a-lido para fora da câmara e os lucros da divisão de feixe 32 para feixe de laser permite. Em comparação com multi-feixe TPLSM à base da câmara padrão, MB-SI-TPLSM é ligeiramente mais lenta devido à necessidade não só a verificação, mas também para adquirir sincronicamente cada uma de aprox. 10 listrado iluminado imagens para gerar a imagem final de alta resolução. No entanto, a nossa técnica mantém uma clvantagem de velocidade ouvido sobre o TPLSM convencional (com base em varredura de feixe único e detecção de ponto). Assim, o tempo de aquisição de uma (de 512 x 512), 150 x 150 mM 2 é 841 mseg utilizando TPLSM convencional (Frequência de digitalizador 800 Hz) e 109 mseg utilizando MB-SI-TPLSM. Deste modo, a energia de excitação por feixe e o tempo de permanência por pixel são os mesmos para ambos convencional e MB-SI TPLSM, de modo que o sinal é semelhante para ambas as configurações. Como demonstrado anteriormente 20, fotodegradação e efeitos photodamage em experiências MB-SI-TPLSM são baixos e comparável a um bom desempenho TPLSM convencional.
No futuro, seria desejável combinar as abordagens complementares de adaptação óptica e risca-de-iluminação na faixa do infravermelho para melhorar ainda mais TPLSM intravital, semelhante às conquistas na óptica adaptativa para estruturou-iluminação 21. No entanto, a fim de atingir essas metas, abordagens consideravelmente mais rápido adaptativo-ópticadeve ser desenvolvido.
O alto impacto esperado da abordagem risca-de-iluminação para ciências biológicas e biomedicina reside na sua capacidade para melhorar a resolução e aumentar o contraste em tecidos profundos, contrariando onda distorção da frente e efeitos de dispersão, mas também vai além dos limites de difração em microscópios de varredura a laser, por simplesmente controlar o processo de digitalização e escolher um detector de campo adequadamente sensível.
O alto impacto esperado da abordagem risca-de-iluminação para ciências biológicas e biomedicina reside na sua capacidade para melhorar a resolução e aumentar o contraste em tecidos profundos, contrariando onda distorção da frente e efeitos de dispersão, mas também vai além dos limites de difração em microscópios de varredura a laser, por simplesmente controlar o processo de digitalização e escolher um detector de campo adequadamente sensível.
A abordagem risca-de-iluminação pode ser aplicado para intravital im-tecidos profundosenvelhecimento em todos os microscópios de varredura a laser de dois fótons, que são capazes de sincronizar detecção câmera com o movimento galvoscanner em varredura de feixe único. Neste caso, as tiras individuais dentro do padrão de excitação são gerados posteriormente e não simultaneamente como em MB-SI-TPLSM. Usando varredura de feixe simples em SI-TPLSM nós naturalmente esperar uma taxa de aquisição de um pouco mais lenta das imagens de fluorescência em comparação com TPLSM convencional (varredura de feixe simples, ponto TPLSM baseada detector), mas a mesma melhoria na resolução espacial e contraste, como demonstrado por MB- SI-TPLSM. A velocidade de aquisição mais baixo junto com a limitação na profundidade da imagem reduz consideravelmente a área de aplicação de feixe único SI-TPLSM em relação ao MB-SI-TPLSM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Volker Andresen é acionista da LaVision Biotec GmbH, Bielefeld, Alemanha. Os outros autores não têm qualquer conflito de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos R. Heintzmann para discussões frutíferas durante o desenvolvimento da abordagem de risca-de-iluminação, K. Rajewsky e A. Haberman para a prestação de camundongos transgênicos C57BL / 6 B1-8 GFP. Reconhecemos a Deutsche Forschungsgemeinschaft sob concessão NI1167/3-1 (RN), HA5354/4-1 e SFB633, A15 projeto (para AEH), o Charité sob concessão Rahel-Hirsch comunhão (para RN) pelo apoio financeiro. Nós particularmente reconhecer a rede JIMI para discussões frutíferas e suporte de infra-estrutura
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATTO590 – NSH for coupling | ATTO Tec, Germany | AD-590-35 | |
| CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 | DRFZ, Berlin | The coupling reaction was performed in the central lab of our institution. | |
| B1-8 Jk-/- EGFP+ | Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US | Can be also found at Jackson Laboratories (JAX). | |
| EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment | StemmCell Technologies, Germany | 19854 | |
| Polystyren beads (605), 0.2 µm | Life Technologies, Germany | F8803 | |
| Equipment | |||
| TriMScope I | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| OPO (manual version) | APE, Berlin, Germany | ||
| Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II | Coherent, Duisburg, Germany | ||
| Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm | Olympus Germany, Hamburg, Germany |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).
- Esplugues, E., et al. Control of Th17 cells occurs in the small intestine. Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26 (5), 655-667 (2007).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Herz, J., et al. Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator. Biophys. J. 98 (4), 715-723 (2010).
- Hell, S. W., Rittweger, E. Microscopy: Light from the dark. Nature. 461 (7267), 1069-1070 (2009).
- Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy. Neuron. 63 (4), 429-437 (2009).
- Bianchini, P., et al. Single-wavelength two-photon excitation - stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).
- Berning, S., et al. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551 (2012).
- York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).
- Gu, M. Advanced optical imaging. , Springer Verlag. Berlin. (2001).
- Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy. J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).
- Booth, M. J. Adaptive optics in microscopy. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).
- Niesner, R., et al. The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging. Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).
- Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).
- Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).
- Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues. Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).
- Lu, J., et al. Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation. Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).
- Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS ONE. 7 (12), (2012).
- Debarre, D., et al. Adaptive optics for structured-illumination. Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).
