Summary
Hoge-resolutie intravitale beeldvorming met verbeterd contrast tot 120 urn diepte lymfklieren van volwassen muizen wordt bereikt door ruimtelijk moduleren van de excitatie patroon van een multi-focale twee-foton microscoop. In 100 micrometer diepte gemeten we resoluties van 487 nm (lateraal) en 551 nm (axiaal), waardoor verstrooiing en diffractie grenzen omzeilen.
Abstract
Monitoring cellulaire communicatie door intravitale bindweefselmassages multi-foton microscopie is de sleutel voor het begrijpen van het lot van de immuuncellen in dikke weefselmonsters en organen in gezondheid en ziekte. Door het regelen van het aftastpatroon in multi-foton microscopie en toepassen van numerieke algoritmen hebben we een gestreepte-verlichting benadering, waardoor we bereiken 3-voudig beter axiale resolutie en verbeterde signaal-ruisverhouding, dus daarentegen meer dan 100 urn diepte in weefsel sterk verstrooiende weefsel van lymfoïde organen vergeleken met standaard multi-foton microscopie. De opnamesnelheid en fotobleken en photodamage effecten waren vergelijkbaar met standaard foto-multiplier-gebaseerde techniek, terwijl de beeldvormende diepte iets lager door het gebruik van velddetectoren. Door het gebruik van de gestreepte-verlichting aanpak zijn wij in staat om de dynamiek van immune complex afzettingen op secundaire folliculaire dendritische cellen waarnemen ̵1; het niveau van enkele eiwitmoleculen in kiemcentra.
Introduction
Twee-foton laser scanning microscopie (TPLSM), met zijn voordelen voor deep-tissue imaging gerelateerd aan infrarood ultrakorte gepulste excitatie 1, heeft een revolutie teweeggebracht in onze visie op vitale processen op een single-cell niveau door de onthulling van de beweeglijkheid en interactiepatronen van verschillende celsubsets levende dieren 2-5. De huidige technologie is nog onvoldoende om de mechanismen van orgaanfunctie en disfunctie helderen als voorwaarde voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën, want het maakt slechts spaarzame informatie over de moleculaire basis van cellulaire respons op weefsels in gezondheid en ziekte. De huidige technologie maakt slechts een ruimtelijk raam van enkele honderden micrometer door verstrooiing en golffront vervormingseffecten op de ruimtelijke resolutie en signaal-ruisverhouding 6, die bijzonder duidelijk in de zeer compacte weefsel van volwassen dieren. Deze verstrooiing en golffront distortion effecten ontstaan door een zeer heterogene eend anisotrope verdeling van de brekingsindex in weefsel, wat in een eerste stap een diepteafhankelijke verslechtering van 3D ruimtelijke resolutie en tenslotte het totale verlies van het signaal afkomstig van ballistische excitatie fotonen, onder meer verloren signaal-ruisverhouding. Qua biowetenschappelijke en biomedische bindweefselmassages toepassingen betekent dit dat de huidige technologie is niet ondubbelzinnig cellulair onthullen vanwege slechte resolutie leidt tot vals positieve interacties terwijl de afname van de signaal-ruisverhouding zou veroorzaken dat het systeem sommige kijken interacties tussen afm structuren.
Teneinde ondubbelzinnig te detecteren cellulaire interacties in een dynamische wijze wordt een sterk verbeterde ruimtelijke resolutie nodig diep in het weefsel. De momenteel geïntroduceerd krachtige nanoscopy technieken op basis van speciale numerieke algoritmen, zoals structuur-verlichting benaderingen, op uitputting van de eerste aangeslagen toestand, bijv. bijvoorbeeld dSTORM, PALM, hebben vele toepassingen gevonden in gefixeerde cellen en in levende celculturen 7. Echter, om deze toepassingen te breiden tot weefselsecties, levend weefsel en organismen we moeten nog ernstige technische problemen te overwinnen. Twee-foton excitatie sted met verschillende golflengtes en met een enkele golflengte (sw2PE-STED) voor excitatie en gestimuleerde emissie is toegepast op laterale resolutie in hersencoupes 8 of kunstmatige matrices verbeteren respectievelijk ingebedde cellen 9, terzelfder axiale resolutie standaard TPLSM. Met een foton STED kan de dynamiek van dendritische worden afgebeeld op het oppervlak van de hersenen cortex (tot 10-15 micrometer diepte) in een levend Thy1 EGFP muis met een resolutie van 67 nm 10. Een veelzijdig instrument voor ontwikkelingsbiologie wordt door de multifocale gestructureerde verlichting microscopie, die tweevoudige verbeterde 2D geeftresolutie. Echter, deze techniek alleen worden gebruikt in organismen met een lage neiging van lichtverstrooiing zoals zebravis embryo's 11. Maar geen van deze technieken in zeer verstrooiende weefsel van volwassen dieren worden toegepast in verscheidene honderden micrometers, die cruciaal modellen voor biomedisch en klinisch onderzoek van ziekten die ontstaan na de geboorte.
Onafhankelijk van de benadering gebruikt om de buigingsbegrensde golfvorm voor berekenen, namelijk de puntspreidingsfunctie (PSF), na het scherpstellen door een lens, de breedte van de PSF langs de optische as (axiale resolutie) ten minste drie keer groter is dan de breedte PSF loodrecht op de optische as (laterale resolutie) 12. Golffront verstoringen van de verschillende orders gekwantificeerd door Zernike coëfficiënten het golffront vorm van gerichte elektromagnetische golf in diep-weefsel beeldvorming leidt tot veel grotere PSF's, met name langs de optische aanzienlijk wijzigenal. as 13-15. Dus zowel de diffractie wetten en golffront vervormingseffecten wijzen op de resolutie langs de optische as als de beperkende factor in diep weefsel beeldvorming. Overwegende nanoscopy technieken richten zich op het tegengaan van de grenzen van diffractie alleen, een technologie die axiale resolutie en het contrast aan het tegengaan van zowel diffractie en wave-front distortion effecten verbetert nodig is voor hoge-resolutie intravitale beeldvorming. Idealiter zou deze techniek ook snel genoeg om controle van cellulaire dynamiek mogelijk te maken.
De real-time correctie van PSF aberraties en contrast verlies met behulp van adaptieve optiek in TPLSM is uitgebreid bestudeerd en verbeterd in de afgelopen tien jaar 13,14,16-18 en het is daarom de beste momenteel beschikbare keuze leidt tot een beter beheer van ballistische excitatie fotonen 14. Toch, vanwege het feit dat de meeste golffront correctie gehanteerde adaptieve optiek iteratief en dat ze hanaar herhaald worden kleine gebieden (enkele 10 x 10 urn 2) vanwege de hoge heterogeniteit van de brekingsindex in het weefsel, de opnamesnelheid aanzienlijk lager dan voor beeldvorming celmotiliteit en communicatie. Bovendien is de fysieke grens in adaptieve optiek verbeterd TPLSM wordt nog bepaald door diffractie.
Ruimtelijke modulatie van verlichting (SPIN) en temporele modulatie op de detectie kant (SPADE) zijn theoretisch voorgesteld moeten worden toegepast op laser scanning microscopie om de resolutie te verbeteren. Hun praktische toepassing in intravitale beeldvorming moet nog worden aangetoond 19.
Samen genomen, is er een grote vraag naar de ontwikkeling van technologieën, die de resolutie voor deep-tissue imaging in levende volwassen dieren te verbeteren. In dit werk, we ruimtelijke modulatie van de excitatie patroon door het beheersen van het scanproces in multi-beam gestreept-verlichting multi-foton laser-s te bereikeninblikken microscopie (MB-SI-MPLSM) 20. Anders gestructureerde verlichting benaderingen, waarbij het gedeelte excitatiebundel kruis ruimtelijk gemoduleerde, gebruiken we alleen het scanproces de ruimtelijke modulatie van de excitatie bereiken. Door de uitbreiding van de excitatie naar een langere golflengte, kunnen we zowel ruimtelijke resolutie en signaal-ruisverhouding in diep weefsel van sterk verstrooiende weefsel (bijv. lymfeklieren, free-verstrooiing path 47 urn 6) te verbeteren, onafhankelijk van de optische niet-lineaire signaal dat we te detecteren, bijvoorbeeld fluorescentie, tweede harmonische generatie of andere frequentie mengen fenomeen. Met deze aanpak op golflengten tot 900 nm kunnen we dynamisch beeld cellulair eiwit structuren op de schaal van enkele moleculen in kiemcentra van muis lymfeklieren. Zo kunnen we beter visualiseren de interactie tussen antigeen dragende eenheden op het oppervlak van folliculaire dendritische cellen en B-cellen in het proces van onderzoeken van het antigen tijdens de immuunrespons bij secundaire lymfoïde organen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Multi-beam-instellingen voor Striped-verlichting TPLSM
De setup die hier gebruikt is een gespecialiseerde multi-beam twee-foton laser scanning microscoop, zoals eerder beschreven 6,20. Het systeem is in figuur 1. Kan de benadering worden toegepast op andere twee-foton laser scanning microscoop, die in staat zijn camera verkrijging synchroniseren met de beweging van de galvoscanner spiegels zijn, zelfs als ze alleen in staat single-beam te scannen . In dit geval wordt het nadeel een lagere opnamesnelheid echter vergelijkbaar met de opnamesnelheid in standaard PMT-gebaseerde TPLSM zijn. Om een optimale kwaliteit zover resolutie en contrast betreft bereiken, tegen de laagste photobleaching en photodamage en snelste acquisitie, is het aan te raden om de volgende aanpassing stappen van de installatie te overwegen:
- Controleer het laservermogen van de Tisa laser: checken op 100%, te vergelijken met de oorspronkelijke fabrieksinstellingen en previoons eigen metingen en het als het is als een excitatie golflengte van 700-1.000 nm noodzakelijk.
- Test de afstandsbediening aanwijzing voor de Ti: Sa bundeldeler, dwz controle 0% en 100% instellingen. Als er een resterende Tisa straal op 100%, dan controleren en de stappenmotor nulstand resetten. De Ti: Sa bundeldeler bestaat uit een lage-orde λ / 2 plaat en een polarisator, waarbij de loodrecht gepolariseerde laserstraal loodrecht op straalpaden splitst: een is gericht in de microscoop voor excitatie, de andere wordt gebruikt om de optische parametrische pompen oscillator (OPO). Door het automatisch roteren van de λ / 2 plaat, een continue aanpassing van de Ti: Sa en OPO kracht respectievelijk bereikt.
- Stel de OPO de gewenste golflengte en meet het uitgangsvermogen. Als de stroom te laag is (met een 4 W Ti: Sa laser bij 800 nm, moet men in staat zijn om 0,8-1 W van OPO straal rond 1,050-1,100 nm) optimaliseren van de pompen golflengte en controleer de instellingen van de ee spiegel en van de aangewakkerd kristal. Kies hun aanbevolen optimale waarden, vaak beschikbaar als grafieken en diagrammen, en dan fine-tunen tot het OPO resoneert bij de gewenste golflengte output en neemt het vermogen toe.
- Als de stroom is nog steeds laag, passen de twee toegankelijke spiegels van de OPO met de vier toegankelijke-spiegel draaiknoppen. Doe dit langzaam en in zeer kleine bewegingen, afwisselend voor en eindspiegels.
- Controleer of de Ti: Sa en / of OPO balken raakte de vermelding spiegels op de juiste, centrale ligging.
- Gebruik een stuk wit papier (niet erg glanzend of reflecterende!) En een infrarood kijker voor het observeren van de OPO balk en de hogere golflengte Ti: Sa balken.
- Draag een veiligheidsbril bij het werken met NIR Ti: Sa balken (meestal maximaal 720-750 nm is toegankelijk voor de gemiddelde persoon).
- Stel het laservermogen (s) zo laag mogelijk voor de uitlijnprocedure teneinde minimaliseren potentiële oogletsel.
- Houden sfeerverlichting van de kamer altijd op, zodat pupil van het oog wordt vernauwd.
- Houd in gedachten dat het laservermogen is prima-gecontroleerd door dempers, bestaande uit een λ / 2 plaat en polarisatoren, die niet in werking maar toen de Ti: Sa bundel komt in de scan-hoofd!
- Gebruik een stuk wit papier (niet erg glanzend of reflecterende!) En een infrarood kijker voor het observeren van de OPO balk en de hogere golflengte Ti: Sa balken.
- Controleer of de ingangspunt diafragma wordt geraakt in het midden door de Ti: Sa en / of OPO ligger; zo niet, pas de laatste twee spiegels af, voordat de laserstraal gaat de scan hoofd.
- Gebruik de IR-viewer en een klein stukje wit (maar niet glanzend / reflecterend!) Papier.
- Sluit altijd het middenrif bij de binnenkomst in de microscoop, zodat de laserstraal positie nauwkeuriger kan worden beoordeeld. Belangrijk: Vergeet niet om het diafragma te heropenen voordat u verder gaat met stap 6!
- Pas de gereflecteerde laserstraal lichtpad in de microscoop dienovereenkomstig. Doe dit op kleine segmenten en het uitvoeren van iteratieve beam-waLKing.
- Controleer de gehele licht-pad als de lichtopbrengst van het objectief is niet voldoende.
- Controleer altijd het lichtpad bij het gebruik van het systeem voor de eerste keer na een lange periode van inactiviteit, een grote reparatie, vervanging van optische elementen, of als er problemen worden verdacht te bestaan met de uitgang.
- Zorg ervoor dat alle actieve optische oppervlakken schoon, in het bijzonder dat zij vrij zijn van stof! Als de oppervlakken zijn bedekt met een laag stof, wordt het golffront nog voordat de objectieflens vervormd en de resulterende laserstraal een scherp beeld van het monster nooit leveren!
- Reinig indien nodig de spiegels met een opgevouwen stuk lens papier, bevochtigd met ethanol of isopropanol.
- Controleer of de bundel komt terug naar de spiegel die zich direct boven de ingang spiegel aan het eind van de prisma-gebaseerde puls compressor, na het lichtpad is ingesteld. Vanaf hier wordt de gereflecteerde bundel into de bundel multiplexer (BM).
- Controleer of de laserstraal het diafragma dat ligt aan de ingang van de balk multiplexer, direct voor de λ / 2 plaat, het veranderen van de polarisatie van de laserbundel aan de eisen voor een breed-band 50% transmissie en 50% reflectie past binnen de BM.
- Sluit eerst het membraan dat de balk positie nauwkeuriger kan worden beoordeeld en uitvoeren balk lopen tussen de twee membranen, dwz die bij binnenkomst op de microscoop en de andere aan de BM ingang. Voor andere single-beam scanning microscopen het membraan moet zich bij binnenkomst op het xy-scanner.
- Als de bundel niet raken het midden van de gesloten-down opening, past de bovengenoemde spiegel, direct voor de BM ingang membraan geplaatst. Belangrijk: Vergeet niet om het diafragma te heropenen voordat u verder gaat met stap 10.
- Met het diafragma heropend, controleer dan of de laserstraal raakt de BM spiegels inhun midden-punt. Gebruik een smalle strook papier om niet naar een ander deel van het complex lichtpaden de BM te blokkeren!
- Controleer of de balk raakt het midden van de afrit spiegels: top spiegel voor parallel polarisatie "P", onderaan spiegel voor loodrechte polarisatie "S". Zo niet, stel de ingang spiegel voor de BM.
- Controleer of de "S" en "P" gepolariseerde bundel laat groepen voeren de polarisator kubus en overlappen adequaat bij binnenkomst op het xy-scanner. Door deze stappen in het geval van een single-beam scanning microscoop wordt gebruikt.
- Controleer of het laserlicht passeert centraal de scan en de buis lenzen en krijgt door het midden van het objectief 'back focal plane. Belangrijk: deze stap moet worden gedaan met de laserstraal in middenpositie niet parkeerstand!
- Vervang het objectief met een gericht instrument ("bull's eye") en controleer of de laserstraal raakt het doel in het midden, en of deverlichting is zelfs.
- Als dit het geval lijkt te zijn, sluit het diafragma voor de BM en controleer of een cirkelvormig interferentiepatroon verschijnt, met een zwarte cirkel in het midden (interferentie minimum).
- Stel de vermelding spiegel als er een significante verschuiving ten opzichte van het centrum van de roos.
- Vervang nu de roos met een objectief, bijvoorbeeld met een 20X water immersie lens.
- Controleer de licht-veld output met een stuk wit papier. Dit moet helder, uniform en centraal gelegen zijn.
- Meet het uitgangsvermogen: bij 100% OPO met 100% pompen Ti: Sa (4 W), moet men ca. krijgen. 100-150 mW na de lens op 1100 nm (de hier gebruikte microscoop). Lagere laser bevoegdheden zal niet volstaan voor het uitvoeren van multi-beam SI-TPLSM. Voor single-beam scanning SI-TPLSM, 5-10 mW voldoende. De laserstraal moet in de middelste stand blijven zonder scanned!
- Als het uitvoeren van MB-SI-TPLSM, lijnt de spiegels in de BM als volgt:
- Plaats een homogeen fluorescerende monster, bijvoorbeeld een rode fluorescentie glijbaan, op het podium en de focus van de laserstraal in de steekproef, maar in de buurt van de bovenkant (dwz dicht bij het objectief 'front).
- Stel de microscoop om de multi-beam mode en kies het aantal stralen, in het begin, bij voorkeur slechts een balk, en de polarisatie, bijv. "P".
- Vind de laserstraal door beeldvorming de fluorescerende dia: stel de "P" sluiter open en lopen de CCD-camera continu terwijl het richten van de bundel.
- Zorg ervoor dat de balk in het midden, en dat de scanner is uitgeschakeld. Zorg ervoor dat de lichtbundel wordt niet gescand!
- Vind de bundel door te zoeken naar een heldere vlek in het midden van de camera chip.
- Focus de balk totdat de plek is de helderste en scherpste, dwz het beeldvlak vande microscoop overeenkomt met de positie van de camera chip; het laservermogen te verminderen zodat de vlek niet verzadigd. Met een goed afgestemd systeem betekent dat het laservermogen moet dichtbij minimaal zijn bij het werken in een geluidsbundels (ongeveer 0,6 mW laservermogen moeten werken).
- Als de spot is beduidend uit het midden, verplaatsen dichter bij het centrum door het aanpassen van de spiegel voor de BM (of van de scanner voor single-beam scanning).
- Wanneer ook het uitlijnen van de andere polarisatie, namelijk "S"-bundels, nu overschakelen naar 2-beam-modus, open de "S" sluiter en controleer de positie van de balk (slechts een bundel kan worden gezien als alleen de "S" sluiter open ).
- Als je klaar bent, schakelt u over 4-beam mode en gebruik de "P" polarisatie-modus ("P" sluiter open). Nu twee beamlets zal verschijnen.
- Schik de twee beamlets perfect worden parallel aan de onderste rand van het oog van de camera, en zet ze op 2,8 micrometer van elkaar verwijderd zijn.
- Als ze niet goed zijn uitgelijnd, pas de eerste spiegel van de BM.
- Uitlijnen nooit de schroef in het midden, in plaats daarvan gebruik maken van de twee perifere schroeven om de spiegel te bewegen totdat de twee bundels zijn 2,8 um uit elkaar en perfect horizontaal gerangschikt.
- Schakel nu over naar 8-beam mode in "P" polarisatie, en pas de tweede BM spiegel (ook zonder de rode stip) tot de 4 beamlets op gelijke afstand op 2,8 um, en worden parallel aan de onderrand van het beeld.
- Herhaal in 16 - en 32-geluidsbundels aanpassing van de 3e en 4e BS spiegels resp. Het is belangrijk dat de beamlets te equidistante omdat SI-algoritmen, de eenvoudigste zijn de min-max (HiLo) algoritme, zijn hierop gebaseerd.
- Ga naar de parkeerstand van de excitatiebundel, which wordt meestal geplaatst op grote waarden van de scanner coördinaten, bijv. (10.000, 10.000).
- Scan een afbeelding (multi-beam) met de CCD-camera. Controleer of het beeld scherp wordt weergegeven, uniform, en recht.
- Stel de camera als het beeld wordt gedraaid: draai de camerabody axiaal om de verticale as met de hand (be gentle!) Totdat het beeld wordt rechtgetrokken.
- In het geval van multi-beam scanning, verplaats de y-scanner spiegel, dwz. loodrecht op de beamlet lijn, zodanig om beeld kwadratische gestreepte genereren.
- Als het gezichtsveld gegenereerd zoals beschreven in stap 17.1. is te klein, uitbreiding van de scanning routine door het bewegen van de x-scanner spiegel om een positie te waarborgen dat de bundel-let lijn wordt verdubbeld en de beamlets zijn op gelijke afstand langs de gehele lijn. Herhaal de exacte bewegingde y-scanner mirror na de x-scanner mirror verplaatst naar, hoe groter gestreepte genereren.
- In het geval van single-beam scanning, wisselen de y-scanner spiegel beweging met x-scanner spiegel beweging herhaaldelijk op equidistante posities - gedefinieerd door de wetenschapper - om het gewenste beeld gestreepte genereren.
- Zorg ervoor om te gebruiken voor de beweging van de y-scanner spiegel een opdracht voor constante snelheid (gereduceerd versnelling / vertraging) en voor de x-scanner spiegel op maximale snelheid (maximale versnelling / vertraging).
- Kies genoeg herhaling stappen en de juiste stap lengte tussentwee opeenvolgende gestreepte beelden naar de afstand tussen twee opeenvolgende beamlets (in dit geval 2.8 pm en een stap van de scanner spiegels gelijk aan 25 nm) dekken; kan het raadzaam zijn om een beetje overlap mogelijk te maken, dat wil zeggen een extra 0,3-0,4 micrometer.
- Stel de x-verschuiving naar een waarde die overeenkomt met de laterale resolutie te beperken bij de gegeven golflengte. Als voorbeeld, met 10 stappen van de x-scanner mirror per shift en 12 of 13 verschuift tot beste zowel axiale als laterale resolutie heeft dit systeem. Controleer een gestructureerde glijbaan, bijv. Convallaria wortels dia welke nummers het beste werken in het systeem wordt gebruikt.
- Optimaliseer deze twee waarden tot het imago van de Convallaria wordt de scherpste: gebruik de lijn profiel tool op de berekende SI afbeeldingen en vergelijk de breedte van de lijn profielen (dat is de fluorescentie-signaal van Convallaria celwanden).
- Acquire elk gestreept beeld gesynchroniseerd met de scanner beweging en dit afzonderlijk bewaren, bv
Muizen Immunisatie en voorbereiding voor intravitale Imaging
De dierproeven werden goedgekeurd door de betreffende staat comites voor dierenwelzijn (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlijn) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de geldende richtlijnen en voorschriften (dierproef licentie G0153/08).
- De inductie van een kiemcentrum reactie in de popliteale lymfeknoop en voorbereiding van het beeldveld werd uitgevoerd zoals eerder beschreven 4. Zuiveren B-cellen immunomagnetically van milt van B1-8 + / + JK - / -en B-cellen B1-8 + / + JK - / - GFP + muizen.
- Injecteer intraveneus 3 x 10 6 NP-specifieke B-cellen met een zuiverheid van> 95% met ⅛ B1-8 + / + JK - / - GFP + en ⅞ niet-fluorescerende B1-8 + / + JK - / - in C57Bl / 6 ontvangers .
- Een dag na cel overdracht immuniseren de ontvangers met 10 ug van NP-CGG (nitrofenyl-kip ɣ globuline) geëmulgeerd in compleet Freund's adjuvant (CFA) in de rechter achterpoot eten pad.
- Label Fab fragmenten van antilichamen met anti-CD21/CD35 ATTO590-succinimidyl ester.
- Om het netwerk van folliculaire dendritische cellen (FDC) te markeren binnen de kiemcentrum in vivo, injecteren 10 pg-fluorochroom gelabelde Fab-fragmenten in de rechter achterpoot voetzool van de muizen 12-24 uur voor intravitale analyse wordt uitgevoerd.
De volgende stappen moeten worden ontrood voor de voorbereiding van de knieholte lymfeklier voor intravitale beeldvorming (dag 8-10 na immunisatie):
- Verdoven muis door ip injectie van ketamine / xylazine, het bedrag afhankelijk van hun gewicht.
- Test reflexen om de diepte van anesthesie gedurende de gehele controleperiode beeldvorming.
- Scheren been, rug en rechter flank van de muis strenge en gebruiken ontharen crème om de resterende haren volledig te verwijderen.
- Fix rechts trochanter major: lokaliseren benige chip met vingers, zet een kleine incisie in de huid met een schaar tot een kleine witte driehoekige fascia verschijnt.
- Klem benige chip onder deze fascia met puntige pincet van de restrainer.
- Bevestig de wervelkolom in de lumbale gebied met behulp van getande pincet.
- Fix rechter achterpoot op restrainer en draai de schroef.
- Tape-staart aan het been in de juiste positie te houden.
- Aan het caudale zijde van de dij, maak een incisie in de huid, in het gebied waar de prominente popliteale ader enters het weefsel, scheiden de huid van het onderliggende weefsel met stompe pincet en volg de knieholte ader van proximaal naar distaal.
- Expose de lymfeklieren met behulp van stompe pincet, proberen te voorkomen dat het snijden om de fijne lymfevaten beschermen (houd de lymfeklier in PBS gedurende het blootstellen).
- Maak een cirkel van vacuüm vet rond de lymfeklier, vul deze plas met PBS.
- Kap slip op zijn plaats en plaats de thermometer-probe (houden temperatuur op 37 ° C, omdat anders de cel velocity sterk variëren).
- Langs de bovenrand van het dekglas voeg een cirkel van vacuüm vet.
- Zet de verwarming spoel in zijn positie op de vacuüm vet, maak een zegel op een soortgelijke manier als voorheen en voeg water / PBS op de glazen afdekplaat slip aan de doelstelling duik in.
- Na beeldvorming wordt de muis bewaard in anesthesie, terwijl het verhogen van de dosis van ketamine / xylazine een letale dosis, gevolgd door cervicale dislocatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ruimtelijke resolutie in de lymfklieren
De afmetingen van de effectieve puntspreidingsfunctie (EPSF) corresponderen met de ruimtelijke resolutie van een microscoop 12. We maten deze driedimensionale functie van het verwerven van de tweede harmonische generatie signaal collageenvezels in lymfklieren onze MB-SI-TPLSM tegenover waarbij twee-foton laser scanning microscopie methodes, detectieveld TPLSM (via CCD-camera) en puntdetectie TPLSM (door middel van PMT's).
Uit deze metingen wordt het duidelijk dat aan het oppervlak van het monster, zowel de laterale en axiale resoluties overeen met de verwachte waarden voorspeld door de diffractie theorie 20. Echter, met beeldvorming diepte toe en dus met toenemende optische pad van zowel de excitatie en emissie straling door de media met zeer variërende brekingsindex, de ruimtelijke resolutie verslechtert aanzienlijk, onafhankelijk van de werkende setup (figuur 2). Door MB-SI-TPLSM bereikten we, onafhankelijk van beeldvorming diepte, een ca.. 20% betere laterale resolutie en een 220% beter axiale resolutie in vergelijking met de standaard TPLSM benaderingen.
Dynamiek van immuuncomplexen op folliculaire dendritische cellen in kiemcentra
De klonale selectie van B-cellen tijdens de immuunrespons, in secundaire lymfoïde organen van volwassen muizen is de eerste stap op weg naar differentiëren in geheugen B-cellen of plasmacellen 4. Hierbij wordt de zeer dynamische interactie tussen folliculaire dendritische cellen (FDC) en B-cellen op het niveau van immune complexe structuren (clusters van enkele eiwitmoleculen) in kiemcentra verondersteld een centrale rol spelen. Slechts door een uiterst oplossen intravitale microscopie technologie is het mogelijk om deze cellulaire communicatie en de gevolgen voor de immuunrespons ontleden. Onze aanpak van MB-SI-TPLSM voorziet voor het eerst de mogelijkheid intravitally visualiseren en kwantificeren van de afmetingen van de clusters van immuuncomplex deposito gelabeld door anti-CD21/35-Fab-ATTO590 op folliculaire dendritische cellen, in maximaal 120 urn diepte kiemcentra van knieholte lymfeklieren (figuren 3a en 3b). Hoewel dergelijke structuren zijn niet zichtbaar door de standaard TPLSM benaderingen, konden we ze individueel te identificeren en hun dynamiek zelfs visualiseren met behulp van onze aanpak. Figuren 3e en 3f dit inzicht ondersteunen en geven aan de directe vergelijking tussen de 3D-fluorescentie beeld van de immuun cel deposito's in een kiemcentrum zoals overgenomen door conventionele TPLSM (PMT-based) en MB-SI-TPLSM. Bovendien kon de interacties van het immuunsysteem complexe deposito's met kiemcentrum B-cellen sterk worden opgelost (figuren 3c en 3d, Films 1 en 2) en kan ik nunvestigated in combinatie met intravitale functionele probes voor proliferatie, differentiatie of apoptose. In een volgende stap zullen we onze aanpak gebruiken om ook de dynamische communicatie van germinal B-cellen met T-helpercellen, aangenomen dat de andere beslissende fenomeen voor B-cel klonale selectie in het secundair lymfoïde organen vormen te onderzoeken.
.. Figuur 1 Principe en setup van de multi-beam gestreept-verlichting twee-foton laser scanning microscoop De bundel van een afstembare fs-gepulste Ti: Sa laser (golflengte 690-1,080 nm, 140 FSEC, 80 MHz) wordt verzwakt een module uit een λ / 2 plaat en een dunne-film polarisator, worden de pulsen voorgespannen in een prismastuurelementen GVD-compensatie module en tenslotte gesplitst in 2, 4, 8, 16, 32 of 64 balken,de vorming van een beamlet lijn. Twee opeenvolgende beamlets binnen de lijn loodrecht polarisaties (label rood en groen in de beamlet lijn) en worden verschoven in de tijd, om interferentie te voorkomen. De tijd-verschuiving tussen twee opeenvolgende beamlets bedraagt 3 psec. Voor het verwerven, wordt de beamlet lijn zich in het monster door een objectieve lens (20X water immersie objectief, NA 0,95, WD 2 mm) en loodrecht gescand, zodat een goed gedefinieerde periodiek patroon wordt geproduceerd. Dit patroon is vertaald langs de beamlet lijn. De reeks beelden gegenereerd op deze manier worden opgespoord door middel van interferentie filters gemonteerd op een filter wiel door een EM-CCD-camera en uiteindelijk beoordeeld door een minimum-maximum-algoritme. Single-beam TPLSM gebaseerd op PMT-detectie werd uitgevoerd met dezelfde microscoop. In dit geval gebruikten we slechts een laserstraal om het monster te scannen en we spectraal opgelost het fluorescentiesignaal met bijbehorende dichroitische spiegels en interferentiefilters voor detecterening met fotomultiplicatorbuizen. In plaats van de Ti:. Sa laserstraal, de straal van een optische parametrische oscillator kan worden gekoppeld aan de microscoop te lange golflengte MB-SI-TPLSM voeren Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Ruimtelijke resolutie van multi-beam gestreept-verlichting TPLSM vergelijking met standaard PMT-gebaseerde en multifocale-CCD gebaseerde TPLSM. (A) Vertegenwoordiger axiale profielen evenals xy en xz projecties van SHG in collageenvezels in 100 micrometer diepte in lymfe node. lexc = 900 nm, detectiegolflengten variëren 447 ± 30 nm, fotonflux Φ = 4.75 x 10
Figuur 3 Intravitale beeldvorming van kiemcentra door MB-SI-TPLSM (a) 3D fluorescentie beeld van het licht zone van een kiemcentrum gelabeld door CD21/35-Fab-ATTO590 (rood) in een muis geïmmuniseerd met haptene -.. Kip γ -globulin (NP-CgG) na adoptieve overdracht van B1-8 EGFP + B-cellen (groen). Het immuunsysteem complex deposito (CD21/35 etikettering) op folliculaire dendritische cellen (FDC) kunnen afzonderlijk worden gevisualiseerd, zoals waargenomen in de zoom-in (b) van het beeld (a), en hebben (laterale en axiale) afmetingen in de bereik van 400-800 nm tot 120 micrometer diepte. Kiemcentrum B-cellen in het geïmmuniseerde B1-8 EGFP + muis gedetecteerd (c), waarbij de contacten (d) gedeeltelijk verantwoordelijk voor de rijping van de immuunrespons nu ook gevisualiseerd. λ exc = 850 nm, detectiegolflengten variëren 605 ± 20 nm (ATTO590) en 525 ± 25 nm (EGFP), fotonflux Φ = 7,05 x 10 28 foton / cm 2 · sec. Schaalbalk (a) 20 urn, (b) 10 urn, (c) 30 urn, (d) 10 urn. 3D fluorescentiebeelden van hetzelfde gebied in delicht zone van een kiemcentrum gelabeld door CD21/35-Fab-ATTO590 zoals opgetekend door MB-SI-TPLSM (e) en conventionele (PMT-based) TPLSM (f), respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Movie bijschriften
Film-1 en -2
Dynamiek van immune complex afzettingen op secundaire folliculaire dendritische cellen (FDC) en hun interactie met kiemcentrum B-cellen zoals opgetekend door MB-SI-TPLSM. Het immuunsysteem complex borgsommen worden gelabeld door CD21/35-Fab-ATTO590 (rood), terwijl het kiemcentrum B-cellen zijn B1-8 Jk - / - EGFP + cellen (groen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van intravitale optische beeldvorming is dynamisch en functioneel visualiseren cellulaire motiliteit en interacties om weefsel en orgaanfunctie bij gezondheid en ziekte 5 begrijpen. De meest krachtige techniek om deze multi-foton laser scanning microscopie te realiseren, moet nog beperkingen in voor verstoringen, verstrooiing, trage verwerving, fotobleken en photodamage, die de ruimtelijke resolutie beperkt golf overwinnen, contrast en de tijdsresolutie .
Er zijn twee succesvolle oplossingen voor beter excitatie bereiken (en emissie) Fotonenmanagement in diep weefsel waardoor betere ruimtelijke resoluties, meer contrast (verhoogde signaal-ruisverhouding, vanwege de toegenomen signaal) en dus verminderde fotobleken en photodamage : de adaptieve optiek benaderingen en het gebruik van langere golflengten - afstembare infrarood excitatie 6. In de afgelopen tien jaar, het concept van de golffront overeenkomstigectie van adaptieve optiek is overgedragen van astronomie tot bio-optische beeldvorming en ook multi-foton microscopie. Terwijl de eerste adaptieve optiek benaderingen voor twee-foton microscopie ingeroepen golffront sensing en hadden behoefte aan een subdiffraction referentie, dat wil zeggen een "gids ster", vergelijkbaar met de astronomie, de huidige systemen zijn beter geschikt voor deep-tissue imaging 12. Zo gebruiken ze coherentie-gating van de excitatiestraling voor golffront sensing 13,15, of ze hebben geen externe golffront sensing gebruikt op alle, maar ontwikkelen aanpassing algoritmen ofwel gebaseerd op cross-correlatie van beelden na leerling segmentatie 17 of op iteratieve stochastische zoek het ideale parameters en de daaropvolgende verstoring van de ongecorrigeerde beeld zoals verkregen uit de vorige iteratie - IMPACT 16, of ze gebruiken foto-akoestiek tot het golffront vervormingen en verstrooiingseffecten 20 karakteriseren. Toch, als gevolg van een sterk variërende refractieve index in weefsel, de adaptieve optiek benaderingen nogal traag, omdat de correctie stap herhaald worden voor relatief kleine gebieden (ongeveer 10 x 10 urn 2) 16. Bovendien, hetzij door golffront of verstrooiing effect correctie, het maximaal haalbare ruimtelijke resolutie is nog steeds beperkt door diffractie.
Onze aanpak is in staat om gedeeltelijk overwinnen van de lasten van golffrontafwijking en van verstrooiing maar ook duwt de resolutie boven de diffractie limiet. Het gebruik van objectieven met een hogere numerieke lensopening, kan de absolute waarden voor de axiale resolutie te verbeteren tot ongeveer 400 nm 20. De prijs voor de verbeterde resolutie is een steiler verval signaal-ruisverhouding in diep-weefsel in vergelijking met conventionele TPLSM. Dit komt door de noodzaak om detectieveld gebruiken MB-SI-TPLSM. Zoals zichtbaar voordat 15, wordt het gebruik van velddetectoren plaats van puntdetector waaraan deze steiler verval van SNR due de sterkere verstrooiing van uitgezonden licht die alleen relevant zijn voor detectieveld is. Zo is de maximale beeldvorming diepte voor detectieveld TPLSM methoden is ongeveer. 25% verminderd in vergelijking met conventionele (dat wil zeggen punt detectie gebaseerd) TPLSM. Een eenvoudige praktische oplossing is meer excitatiegolflengten toepassing en langere emissiegolflengten detecteren. Uiteraard daarmee wordt diepteafhankelijke SNR conventionele TPLSM dezelfde mate als in MB-SI-TPLSM.
Wat de opnamesnelheid betreft, is MB-SI-TPLSM beperkt door de snelheid van de galvanometrische scanner en / of het uitlezen van de camera en de winst van de bundelsplitsing tot 32 laserstraal laat. Vergeleken met standaard meerdere bundels cameragebaseerde TPLSM, MB-SI-TPLSM iets trager door de noodzaak niet alleen scannen ook elk ca. synchroon verwerven. 10 gestreepte verlichte beelden naar het uiteindelijke hoge resolutie te genereren. Maar onze techniek behoudt een cloor snelheid voordeel boven de conventionele TPLSM (op basis van single-beam scanning en puntdetectie). Vandaar dat de acquisitie tijd van een 150 x 150 micrometer 2 (512 x 512 pixels) is 841 msec met behulp van conventionele TPLSM (scanner frequentie 800 Hz) en 109 msec met behulp van MB-SI-TPLSM. Daarbij, de excitatie vermogen per bundel en de verblijftijd per pixel zijn hetzelfde voor zowel conventionele als MB-SI TPLSM, zodat het signaal is vergelijkbaar voor beide opstellingen. Zoals eerder aangetoond 20, fotobleken en photodamage effecten in MB-SI-TPLSM experimenten zijn laag en vergelijkbaar met goed uitgevoerde conventionele TPLSM.
In de toekomst zou het wenselijk zijn om de complementaire benaderingen van adaptieve optica en gestreept verlichting combineren het infrarode bereik verder te verbeteren intravital TPLSM, vergelijkbaar met de prestaties in adaptieve optiek voor gestructureerde verlichting 21. Echter, om deze doelen te bereiken, aanzienlijk sneller adaptieve optiek benaderingenworden ontwikkeld.
De verwachte grote impact van de gestreepte-verlichting aanpak voor biowetenschappen en medische biologie ligt in zijn vermogen om de resolutie te verbeteren en verbetering van het contrast in diepe weefsel, het tegengaan golffront vervorming en verstrooiing effecten, maar ook verder gaan dan de diffractie grenzen in laser-scanning microscopen, door gewoon regelen van het scanproces en het kiezen van een adequaat gevoelig veld detector.
De verwachte grote impact van de gestreepte-verlichting aanpak voor biowetenschappen en medische biologie ligt in zijn vermogen om de resolutie te verbeteren en verbetering van het contrast in diepe weefsel, het tegengaan golffront vervorming en verstrooiing effecten, maar ook verder gaan dan de diffractie grenzen in laser-scanning microscopen, door gewoon regelen van het scanproces en het kiezen van een adequaat gevoelig veld detector.
De gestreepte-verlichting aanpak kan worden toegepast voor intravitale deep-tissue imveroudering in alle twee-foton laser scanning microscoop die in staat om de camera detectie synchroniseren met de galvoscanner beweging in single-beam scanning zijn. In dit geval worden de enkele strepen binnen de excitatiepatroon later en niet tegelijkertijd als in MB-SI-TPLSM gegenereerd. Met behulp van single beam scanning in SI-TPLSM we natuurlijk verwachten een iets trager tempo overname van de fluorescentie beelden in vergelijking met conventionele TPLSM (single beam scanning, point-detector gebaseerd TPLSM) maar dezelfde verbetering van de ruimtelijke resolutie en contrast als aangetoond voor MB- SI-TPLSM. De lagere overname snelheid samen met de beperking in de beeldvorming diepte aanzienlijk beperkt het toepassingsgebied van de single-beam SI-TPLSM vergeleken met MB-SI-TPLSM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Volker Andresen is een aandeelhouder van LaVision Biotec GmbH, Bielefeld, Duitsland. De andere auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken R. Heintzmann voor vruchtbare discussies tijdens de ontwikkeling van de gestreepte-verlichting aanpak, K. Rajewsky en A. Haberman voor het verstrekken van C57BL / 6 B1-8 GFP transgene muizen. Wij erkennen de Deutsche Forschungsgemeinschaft onder subsidie NI1167/3-1 (RN), HA5354/4-1 en SFB633, project A15 (naar AEH), de Charite onder subsidie Rahel-Hirsch fellowship (RN) voor financiële steun. Wij in het bijzonder erkennen het netwerk JIMI voor vruchtbare discussies en infrastructurele ondersteuning
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATTO590 – NSH for coupling | ATTO Tec, Germany | AD-590-35 | |
| CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 | DRFZ, Berlin | The coupling reaction was performed in the central lab of our institution. | |
| B1-8 Jk-/- EGFP+ | Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US | Can be also found at Jackson Laboratories (JAX). | |
| EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment | StemmCell Technologies, Germany | 19854 | |
| Polystyren beads (605), 0.2 µm | Life Technologies, Germany | F8803 | |
| Equipment | |||
| TriMScope I | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| OPO (manual version) | APE, Berlin, Germany | ||
| Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II | Coherent, Duisburg, Germany | ||
| Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm | Olympus Germany, Hamburg, Germany |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).
- Esplugues, E., et al. Control of Th17 cells occurs in the small intestine. Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26 (5), 655-667 (2007).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Herz, J., et al. Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator. Biophys. J. 98 (4), 715-723 (2010).
- Hell, S. W., Rittweger, E. Microscopy: Light from the dark. Nature. 461 (7267), 1069-1070 (2009).
- Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy. Neuron. 63 (4), 429-437 (2009).
- Bianchini, P., et al. Single-wavelength two-photon excitation - stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).
- Berning, S., et al. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551 (2012).
- York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).
- Gu, M. Advanced optical imaging. , Springer Verlag. Berlin. (2001).
- Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy. J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).
- Booth, M. J. Adaptive optics in microscopy. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).
- Niesner, R., et al. The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging. Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).
- Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).
- Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).
- Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues. Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).
- Lu, J., et al. Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation. Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).
- Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS ONE. 7 (12), (2012).
- Debarre, D., et al. Adaptive optics for structured-illumination. Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).
