Summary
Høyoppløselig intravital avbildning med forbedret kontrast til 120 mikrometer dybde i lymfeknuter hos voksne mus oppnås ved romlig modulerende magnetisering mønster av en multi-fokal to-foton mikroskop. I 100 mikrometer dybde målte vi en oppløsning på 487 nm (laterale) og 551 nm (aksial), og dermed omgå spredning og diffraksjon grenser.
Abstract
Overvåking cellulær kommunikasjon ved intra deep-tissue multi-foton mikroskopi er nøkkelen for å forstå skjebnen til immunceller innenfor tykke vevsprøver og organer i helse og sykdom. Ved å kontrollere skanning mønster i multi-foton mikroskopi og bruke de riktige numeriske algoritmer, utviklet vi en stripete-belysning tilnærming, noe som gjorde oss i stand til å oppnå tre ganger bedre aksial oppløsning og forbedret signal-til-støy-forhold, dvs. kontrast, i mer enn 100 mikrometer vev dybde innenfor sterkt spredte vev av lymfoide organer sammenlignet med standard multifotonmikroskopi. Ervervet hastighet samt fotobleking og photodamage effekter var lik standard foto-multiplikator basert teknikk, mens bildedybde var noe lavere på grunn av bruk av feltdetektorer. Ved å bruke den stripete-belysning tilnærming, er vi i stand til å observere dynamikken i immun komplekse innskudd på sekundære follikulære dendrittiske celler ̵1; på nivået for et par proteinmolekyler i germinale sentre.
Introduction
To-foton laserskanning mikroskopi (TPLSM), med sine fordeler for dyp-vev bildebehandling knyttet til infrarød ultrakorte pulset eksitasjon 1, har revolusjonert vårt syn på vitale prosesser på en encellet nivå ved å avsløre motilitet og samhandlingsmønstre av ulike celle undergrupper i levende dyr 2-5. Imidlertid er dagens teknologi fortsatt for lite til å belyse mekanismene for organfunksjon og dysfunksjon som en forutsetning for å utvikle nye terapeutiske strategier, siden det gjør bare sparsom informasjon om det molekylære grunnlaget for cellulær respons innen vev i helse og sykdom. Gjeldende teknologi gjør det mulig for bare en romlig vindu på noen hundre mikron på grunn av spredning og bølge framforstyrrelseseffekter på romlig oppløsning og signal-til-støy-forhold 6, som er særlig tydelig i meget kompakt vevet i voksne dyr. Disse spredning og bølgefront forstyrrelseseffekter skyldes et sterkt heterogen end anisotrop fordelingen av brytningsindeksen i vev, noe som fører i et første trinn til et dybdeavhengig forringelse av 3D romlig oppløsning og til slutt til fullstendig tap av signalet som stammer fra ballistiske fotoner magnetisering, dvs. tap av signal-til-støy-forhold. I form av bioscientific og biomedisinsk dype vevet programmer, betyr dette at dagens teknologi ikke er i stand til å utvetydig avsløre cellulære kommunikasjonen fordi dårlig oppløsning vil føre til falskt positive interaksjoner mens nedgangen av signal-til-støy-forhold ville føre til at systemet til å overse noen interaksjoner mellom dim strukturer.
For å utvetydig detektere cellulære interaksjoner i en dynamisk måte, er en svært forbedret romlig oppløsning trengte dypt inne i vevet. Den tiden innført kraftige nanoscopy teknikker basert på spesielle numeriske algoritmer, for eksempel struktur-belysning tilnærminger, om uttømming av den første eksiterte tilstand, for eksempel f.eks dSTORM, PALM, har funnet mange programmer i faste celler så vel som i levende cellekulturer 7. Men, for å utvide disse programmene til vevssnitt, levende vev og organismer vi fortsatt trenger å overvinne alvorlige tekniske problemer. To-foton eksitasjon STED med forskjellige bølgelengder, så vel som med en enkel bølgelengde (sw2PE-STED) for eksitasjon og stimulert emisjon har vært anvendt for å bedre lateral oppløsning i hjernen skiver 8 eller i kunstige matriser med innebygde celler 9, henholdsvis, i det samme aksial oppløsning som standard TPLSM. Ved hjelp av en foton-STED, kan dynamikken til dendrittutløperne avbildes på overflaten av hjernen cortex (opp til 10 til 15 mikrometer dybde) i en levende Thy1 EGFP mus med en oppløsning på 67 nm 10. En allsidig verktøy for utviklingsbiologi er levert av multifokal strukturert-belysning mikroskopi, som gir to ganger forbedret 2Doppløsning. Imidlertid kan denne teknikken brukes kun i organismer med en lav tilbøyelighet til lysspredning som sebra fisk embryoer 11. Likevel, kan ingen av disse teknikker bli anvendt i den svært spredning vev av voksne dyr på flere hundre mikrometer, som er avgjørende modeller for den biomedisinske-og klinisk forskning av sykdommer med start etter fødselen.
Uavhengig av den tilnærmelse som brukes til å beregne diffraksjon begrensede bølgefront form, dvs. punktspredefunksjon (PSF), etter fokusering gjennom en linse, er bredden av PSF langs den optiske aksen (aksial-oppløsning) i det minste tre ganger større enn PSF bredde vinkelrett på den optiske aksen (lateral oppløsning) 12. Bølgefront forvrengninger av forskjellige ordrer kvantifisert ved Zernike koeffisienter betraktelig endre bølgen foran form av fokusert elektromagnetisk bølge i dype vev bildebehandling som fører til mye større PSFs, spesielt langs synsal aksen 13-15. Derfor er både diffraksjon lover og bølgefronten forvrengningseffekter peker på den oppløsning langs den optiske akse som den begrensende faktor i dype vev avbildning. Mens nanoscopy teknikker fokus på å motvirke grensene for diffraksjon bare, en teknologi som forbedrer aksial oppløsning og kontrast ved å motvirke både diffraksjon og bølge-front verknader er nødvendig for høyoppløselig intra bildebehandling. Ideelt sett bør denne teknikken også være rask nok til å tillate overvåking av mobilnettet dynamikk.
Sanntids korreksjon av PSF avvik og kontrast tap hjelp adaptiv optikk i TPLSM har blitt grundig studert og forbedret de siste ti årene 13,14,16-18 og det er derfor den beste tiden tilgjengelig valg som fører til en bedre forvaltning av ballistisk eksitasjon fotoner 14. Likevel, på grunn av det faktum at de fleste bølgefront korreksjon tilnærminger som brukes i adaptiv optikk er iterativ og at de HAve for å bli gjentatt for små områder (få 10 x 10 mm 2) på grunn av høy heterogenitet av brytningsindeksen i vev, er anskaffelsen hastighet vesentlig lavere enn nødvendig for avbildningscelle motilitet og kommunikasjon. Videre er fysisk grense i adaptiv optikk forbedret TPLSM fremdeles bestemmes av diffraksjon.
Spatial modulering av belysning (SPIN) og timelig modulasjon på deteksjon side (SPADE) har blitt teoretisk foreslås brukt på laser-scanning mikroskopi for å forbedre oppløsningen. Deres praktisk anvendelse i intra bildebehandling fortsatt gjenstår å bli demonstrert 19.
Tatt sammen, det er en høy etterspørsel for utvikling av teknologier som forbedrer oppløsningen for dype vev bildebehandling i levende voksne dyr. I dette arbeidet, vi oppnå romlig modulering av eksitasjon mønsteret ved å kontrollere skanneprosessen i multistråle stripete-belysning multi-foton laser shermetisering mikroskopi (MB-SI-MPLSM) 20. I motsetning til det strukturerte belysnings tilnærminger, hvor magnetiseringsstrømmen strålens tverrsnitt er romlig modulert, bruker vi bare skanningsprosessen for å oppnå den romlige modulering av eksitasjon. Ved å utvide eksitasjon til en lengre bølgelengde, er vi i stand til å forbedre både romlig oppløsning og signal-til-støy-forholdet i dype vev av høyt spredning vev (f.eks lymfeknute, fritt-scattering banen 47 mikrometer 6), uavhengig av den optiske ikke-lineær signal vi påvise, f.eks fluorescens, andre harmoniske generering eller annen frekvens blande fenomen. Ved hjelp av denne tilnærmingen på eksitasjonsbølgelengdene opp til 900 nm vi er i stand til å dynamisk image cellular proteinstrukturer på omfanget av noen molekyler i germinale sentre for muse lymfeknuter. Således er det enklere å visualisere interaksjonen mellom antigen bærere på overflaten av follikulære dendrittiske celler og B-celler i ferd med å undersøke den antigen i løpet av immunrespons hos sekundære lymfoide organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Multi-bjelke Setup for Striped-belysning TPLSM
Oppsettet som brukes her er en spesialisert flerstråle to-foton-laser scanning mikroskop, som tidligere beskrevet 6,20. Systemet er vist i figur 1. Kan Fremgangsmåten anvendes på andre to-foton laserskanningsmikroskop, som er i stand til å synkronisere kamera anskaffelse med bevegelsen av galvoscanner speil, selv om de bare er i stand til å utføre enkelt-stråleskanning . I dette tilfellet vil den ulempe være en lavere anskaffelses hastighet, men ligner på kjøpet hastighet i standard PMT-baserte TPLSM. For å oppnå optimal kvalitet så langt som oppløsning og kontrast er bekymret, til lavest fotobleking og photodamage og raskeste kjøpet, er det tilrådelig å vurdere følgende justering trinnene i oppsettet:
- Sjekk lasereffekten av Tisa laser: sjekk på 100%, sammenlignet med fabrikkinnstillinger og previooss eier opplesninger og bruke det som det er hvis en eksitasjon bølgelengde i området 700-1,000 nm er nødvendig.
- Test fjernkontrollen indikasjon for Ti: Sa beam splitter, dvs. sjekke 0% og 100% innstillinger. Hvis det en gjenværende Tisa strålen mot 100%, så sjekk og tilbakestille stepping motor null posisjon. Den Ti: Sa strålesplitter består av en lav-orden λ / 2-plate og en polarisator, som deler de vinkelrett polariserte laserstråler på vinkelrette bjelke baner: den ene er rettet inn i mikroskopet for eksitasjon, den andre brukes for å pumpe den optisk parametriske oscillator (OPO). Ved automatisk å rotere λ / 2-plate, en kontinuerlig justering av Ti: Sa og OPO kraft, henholdsvis er oppnådd.
- Juster OPO til ønsket bølgelengde og måle utgangseffekten. Hvis strømmen er for lavt (med en 4 W Ti: Sa laser på 800 nm, en bør kunne få 0,8-1 W av OPO bjelke på rundt 1,050-1,100 nm) optimalisere pumping bølgelengde og sjekke innstillingene the speil og av viftet krystall. Velg deres anbefalte optimale verdier, ofte tilgjengelige som diagrammer eller grafer, og så finjustere dem til OPO resonerer på ønsket bølgelengde utgang og øker effekten.
- Hvis strømmen er fortsatt lav, justere de to tilgjengelige speil av OPO med de fire tilgjengelige speiljuster knotter. Gjør dette trinnet svært sakte og i svært små bevegelser, alternerende mellom forse og slutt speil.
- Sjekk at Ti: SA og / eller OPO bjelker traff inngangs speil på riktig, sentral posisjon.
- Bruk et stykke hvitt papir (ikke veldig blanke eller reflekterende!) Og en infrarød viewer for å observere OPO trålen og høyere bølgelengde Ti: Sa bjelker.
- Bruk vernebriller når du arbeider med NIR Ti: Sa bjelker (vanligvis opp til 720-750 nm er synlig for den gjennomsnittlige person).
- Sett lasereffekten (e) så lav som mulig for justeringsprosedyren, slik som å minimize potensial øyeskade.
- Alltid holde rommets omgivelseslyset på, slik at øyets elev er innsnevret.
- Husk at lasereffekten er fin-kontrollert av lyddempere som består av en λ / 2 plate og polarizers, som ikke er i kraft ennå når Ti: Sa strålen går inn i scan-head!
- Bruk et stykke hvitt papir (ikke veldig blanke eller reflekterende!) Og en infrarød viewer for å observere OPO trålen og høyere bølgelengde Ti: Sa bjelker.
- Sjekk at inngangspunkt membranen er truffet i midten av Ti: Sa og / eller OPO bjelke; hvis ikke, juster de to siste speil før laserstrålen går skanne hodet.
- Bruk IR-viewer og et lite stykke hvitt papir (men ikke skinnende / reflekterende!).
- Alltid lukke membranen ved inntreden i mikroskop, slik at laserstrålens posisjon kan bli bedømt mer nøyaktig. Viktig: Ikke glem å gjenåpne membranen før du går videre til trinn 6!
- Juster reflekterte laserstrålen lysbanen inn i mikroskopet tilsvarende. Gjør dette på små segmenter og utføre iterativ beam-walking.
- Sjekk hele lys-banen hvis lyseffekten fra objektivet er ikke tilstrekkelig.
- Sjekk alltid lysbanen når du bruker systemet for første gang etter en lang inaktiv periode, en større reparasjon, noe utskifting av optiske elementer, eller hvis problemene er mistenkt for å eksistere med utgang.
- Sørg for at alle aktive optiske overflater er rene, spesielt at de er fri for støv! Hvis overflaten er dekket med et lag av støv, er bølgefronten forvrengt selv før inn i objektivlinsen og den resulterende laserstrålen aldri vil gi et skarpt bilde av prøven!
- Hvis nødvendig, rengjøre speil med en foldet stykke linsepapir fuktet med etanol eller isopropanol.
- Kontroller at strålen kommer tilbake til speilet som er plassert direkte over inngangs speilet i enden av den prisme-baserte pulskompressor, etter at lysbanen er angitt. Herfra blir strålen reflekteres into strålen multiplekser (BM).
- Sjekk om laserstrålen treffer membranen som er plassert ved inngangen til bjelken multiplekseren, rett før λ / 2-plate, å endre polarisasjonen av laserstrålen for å passe til kravene til en bred-bånd 50% overføring og 50% refleksjon innenfor BM.
- Først lukker blender slik at strålen stilling kan bli dømt mer presist og utføre bjelke gang mellom de to membraner, dvs. en på inntreden i mikroskop og den andre på BM oppføring. For andre enkeltstråle skanning mikroskop membranen bør være plassert ved inntreden i xy-skanner.
- Hvis strålen ikke treffer sentrum av den nedlagte åpning, justerer den nevnte speil, plassert direkte foran BM inngangs membran. Viktig: Ikke glem å gjenåpne membranen før du går videre til trinn 10..
- Med membranen gjenåpnet, sjekk om laserstrålen treffer BM speil ideres midt-punkt. Bruk en smal stripe av papir, slik som for ikke å blokkere en del av BM komplekse lys-baner!
- Sjekk om strålen treffer midten av exit speil: top speil for parallell polarisering "P", bunn speil for vinkelrett polarisering "S". Hvis ikke, juster oppføring speilet før BM.
- Sjekk om "S" og "P" polarisert strålen lar grupper inn polarisatoren kuben og lapper hensiktsmessig ved inntreden i xy-skanner. Hoppe over disse trinnene i tilfelle en enkeltstråle scanning mikroskop brukes.
- Sjekk om lasers lyset passerer sentralt skanningen og røret objektiver og får gjennom midten av objektivet 'tilbake fokusplan. Viktig: Dette trinnet må gjøres med laserstrålen i midtstilling, ikke i en parkeringsstilling!
- Bytt ut objektivet med et sikteverktøy ("blinken") og sjekk om laserstrålen treffer målet i midten, og ombelysning er jevn.
- Hvis dette synes å være tilfelle, stenge åpningen før BM og sjekk om et sirkulært interferensmønster vises, med en svart sirkel i midten (minimum forstyrrelse).
- Juster oppføring speilet hvis det er en betydelig endring i forhold til midten av blinken.
- Nå erstatte blink med et objektiv, for eksempel med en 20X vann nedsenking linse.
- Kontroller utgangs lys-feltet med et stykke hvitt papir. Dette bør være lyse, uniform og sentralt plassert.
- Mål utgangseffekt: 100% OPO med 100% pumping Ti: Sa (4 W), bør man få ca. 100-150 mW etter objektivet på 1100 nm (i mikroskopet brukes her). Lavere laser krefter vil ikke være tilstrekkelig for å utføre multi-beam SI-TPLSM. For enkeltstråleskanning SI-TPLSM, 5-10 mW er tilstrekkelig. Laserstrålen må stå i midtstilling uten å være Scanned!
- Hvis du utfører MB-SI-TPLSM, justere speilene i BM som følger:
- Plasser et homogent fluorescerende prøve, f.eks en rød fluorescens lysbilde, på scenen og fokusere laserstrålen inne i prøven, men nær toppen overflaten (dvs. nær objektiv 'foran).
- Sett i mikroskop for å multi-strålemodus og velge antall bjelker, i begynnelsen, fortrinnsvis bare en stråle, og polariseringen, f. eks "P".
- Finn laserstrålen av tenkelig fluorescerende bilde: sette "P" lukkeren åpen og kjør CCD-kamera kontinuerlig mens fokusere strålen.
- Sørg for at bjelken er i midtstilling, og at skanneren er slått av. Kontroller at strålen er ikke skannet!
- Finn strålen ved å se etter et lyspunkt nær sentrum av kamerabrikken.
- Fokusere strålen til stedet er den klareste og skarpeste, dvs. bildeplanet avmikroskopet svarer til posisjonen for kameraet chip; redusere lasereffekten slik at flekken ikke er mettet. Med en godt justert system betyr dette at laser makt må være nær minimum når du arbeider i en bjelke modus (rundt 0,6 mW laser makt skal fungere).
- Hvis flekken er et godt stykke utenfor sentrum, flytte den nærmere sentrum ved å justere speilet foran BM (eller av skanneren for enkeltstråleskanning).
- Ved også å innrette den andre polarisasjonen, dvs. "S" stråle, nå gå over til 2-beam mode, åpne "S" lukker og kontrollere posisjonen av strålen (bare én bjelke kan sees dersom bare "S" lukkeren er åpen ).
- Når du er ferdig, bytte til 4-beam-modus og bruke "P" polarisering modus ("P" lukkeren åpen). Nå to beamlets vises.
- Ordne de to beamlets å være perfekt parallell til den nederste kanten av kameraets syn, og sette dem til å være 2,8 mikrometer fra hverandre.
- Hvis de ikke er riktig justert, justere første speil av BM.
- Aldri justere skruen i midten, i stedet bruke de to perifere skruer å flytte speilet før de to bjelker er 2,8 um hverandre og perfekt horisontalt arrangert.
- Nå bytte til 8-beam-modus i "P" polarisering, og justere andre BM speil (også uten den røde prikken) inntil 4 beamlets er like langt på 2,8 um, og arrangeres parallelt med nedre kant av bildet.
- Gjenta i 16 - og 32-beam modus, justere tredje og fjerde BS speil, henholdsvis. Det er viktig for de beamlets å være like langt fordi SI-algoritmer, det enkleste er det min-max (HiLo) algoritme, er basert på denne antakelsen.
- Gå til parkeringsposisjonen i magnetiseringseffekten strålen, which er vanligvis plassert på store verdier i skanner koordinater, f.eks (10000, 10000).
- Skanne et (multi-beam) bilde med CCD-kamera. Kontroller at bildet vises skarpt, uniform, og rett.
- Juster kameraet hvis bildet vises rotert: vri kamerahuset aksialt rundt den vertikale aksen for hånd (vær forsiktig!) Til bildet blir rettet.
- I tilfellet med flerstråleskanning, bevege y-scanner speil, f.eks. vinkelrett på beamlet linje, på en slik måte for å generere en kvadratisk stripet bilde.
- Hvis synsfeltet ble generert som beskrevet i trinn 17.1. er for liten, forlenge scanning rutinen ved å bevege x-scanner speilet til en stilling som sikrer at strålen-let linje fordobles og beamlets har samme avstand langs hele linjen. Gjenta den eksakte bevegelseav y-scanner speilet etter x-scanner speil blir beveget for å generere større stripete bilde.
- I tilfelle av enkelt-stråleskanning, veksle y-scanner speil bevegelse med x-scanner speilbevegelsen gjentatte ganger med ekvidistante posisjoner - definert av forskeren - å generere den ønskede stripete bilde.
- Sørg for å bruke for bevegelsen av y-scanner speil en kommando for konstant hastighet (redusert akselerasjon / retardasjon) og for x-scanner speil man med maksimal hastighet (maksimal akselerasjon / retardasjon).
- Velg nok repetisjon trinn og riktig skrittlengden mellomto påfølgende stripete bilder for å dekke avstanden mellom to påfølgende beamlets (i dette tilfellet 2,8 mikrometer og ett skritt av skanner speil tilsvarer 25 nm); Det kan være tilrådelig for å tillate en liten overlapping, dvs. en ytterligere 0,3-0,4 mikrometer.
- Sett x-skift til en verdi som tilsvarer den laterale oppløsningen grensen ved gitt bølgelengde. Som et eksempel, ved å bruke 10 trinn på x-scanner speil per skift og 12 eller 13 skift fører til beste både aksiale og laterale oppløsning resultater i dette system. Sjekk med en strukturert sklie, f.eks Convallaria røtter lysbilde, hvilke tall som fungerer best i systemet som brukes.
- Optimalisere disse to verdiene helt til Convallaria bildet blir det skarpeste: bruke linjeprofilverktøy på de beregnede SI bilder og sammenligne bredden av linjen profiler (som er fluorescens signalet fra Convallaria cellevegger).
- Tilegne hver stripete bilde synkronisert med skanneren bevegelse og lagre det separat, f.eks
Mus Immunization og forberedelse til Intravital Imaging
Dyreforsøk ble godkjent av de relevante statlige komiteer for dyrevelferd (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) og ble utført i samsvar med gjeldende retningslinjer og forskrifter (dyreforsøk lisens G0153/08).
- Induksjon av en germinal sentrum respons i knehasecyste lymfeknute og forberedelse av imaging-feltet ble utført som beskrevet før fire. Rens B-celler immunomagnetically fra spleens av B1-8 + / + Jκ - / -og B-celler av B1-8 + / + Jκ - / - GFP + mus.
- Injisere intravenøst 3 x 10 6 NP-spesifikke B-celler med en renhet på> 95% ved hjelp av ⅛ B1-8 + / + Jκ - / - GFP + og ⅞ nonfluorescent B1-8 + / + Jκ - / - i C57Bl / 6 mottakere .
- En dag etter celleoverføring immunisere mottakerne med 10 ug NP-CGG (nitrofenyl-kylling ɣ globulin) emulgert i komplett Freunds adjuvans (CFA) i den høyre, bakre mat puten.
- Etikett Fab fragmenter av anti-CD21/CD35 antistoffer med ATTO590-succinimidyl ester.
- For å fremheve nettverket av follikulære dendrittceller (FDC) innenfor den germinal senter in vivo, injiserer 10 pg av fluorokromkonjugerte merkede Fab-fragmenter inn i den høyre, bakre fotpute på musene 12 til 24 timer før intravital analysen er utført.
Følgende trinn bør være betyderødt for utarbeidelse av knehasecyste lymfeknute for intra imaging (dag 8-10 etter immunisering):
- Anesthetize mus med ip-injeksjon av ketamin / xylazin, mengden avhengig av deres vekt.
- Test reflekser for å overvåke anestesidybden over hele bildeperiode.
- Barbere ben, rygg og høyre flanke av mus streng og bruke depilating krem for å fjerne rester av hår helt.
- Fix høyre trochanter major: finne benete chip med fingrene, satt en liten hud innsnitt med saks til en liten hvit trekant-formet konseptet vises.
- Klemme benete chip under dette konseptet med spisse pinsett av rainer.
- Fest ryggraden i korsryggen området ved hjelp av tann pinsett.
- Fix høyre bakben på rainer og stram skruen.
- Tape halen til å holde beinet i riktig posisjon.
- På halesiden av låret, lage et snitt i huden, i området der den fremtredende vena poplitea enters vevet, skiller huden fra den underliggende vev med butt pinsett og følg vena poplitea fra proksimale til distale.
- Expose lymfeknute med butte pinsett, prøv å unngå å kutte i for å beskytte de fine lymfekar (holde lymfeknute i PBS under den utsette).
- Lag en sirkel av vakuum fett rundt lymfeknute, fylle dette vanndam med PBS.
- Sett dekkglass i sin posisjon og plassere termometeret-sonden (holde temperaturen på 37 ° C, ellers cellen hastighet vil dramatisk variere).
- Langs den øvre kanten av dekkglass til en sirkel av vakuumfett.
- Sett varmebatteri i sin posisjon på vakuum fett, skape en sel på en lignende måte som før og tilsett vann / PBS på glasset dekkglass for å dyppe målet inn.
- Etter avbildning, blir mus holdes i anestesi, og samtidig øke dosene av ketamin / xylazin til en dødelig dose, fulgt av cervical dislokasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Romlig oppløsning i lymfeknuter
Dimensjonene av den effektive punktspredefunksjon (ePSF) svarer til den romlige oppløsningen av et mikroskop 12.. Vi målte dette tredimensjonal funksjon ved å kjøpe den andre harmoniske generasjon signal av kollagenfibre i lymfeknuter ved vår MB-SI-TPLSM i forhold til etablerte to-foton laserskanning mikroskopi teknikker, dvs. feltet deteksjon TPLSM (ved hjelp av CCD-kameraer), og punkt deteksjon TPLSM (ved hjelp av PMTs).
Ut fra disse målingene blir det åpenbart at ved overflaten av prøven, både sideveis og aksial oppløsninger svarer til de forventede verdier forutsett av diffraksjonsteori 20.. Imidlertid, ved økende avbildningsdybde og således med økende optisk bane for både eksitasjon og emisjonsstråling gjennom media med meget varierende brytningsindeks, forringes romlig oppløsning betydelig, uavhengig av de sysselsatte oppsett (figur 2). Av MB-SI-TPLSM nådde vi, uavhengig av bildedybde, en ca. 20% bedre lateral oppløsning og en 220% bedre aksial oppløsning i forhold til standard TPLSM tilnærminger.
Dynamics av immunkomplekser på follikulære dendrittiske celler i germinale sentre
Den klonal utvalg av B-celler i løpet av immunrespons, innen sekundære lymfoide organer i voksen mus er første skritt på vei til å differensiere i minne B-celler eller plasmaceller fire. I denne prosessen, er det svært dynamisk samspill mellom follikulære dendrittiske celler (FDC) og B-celler på nivået av immun komplekse strukturer (klynger av noen proteinmolekyler) innen germinale sentre antas å spille en sentral rolle. Bare ved hjelp av en meget løse intravital mikros teknologi er det mulig å dissekere denne mobil kommunikasjon, og dets virkning på immunresponsen. Vår tilnærming av MB-SI-TPLSM gir for første gang muligheten for intravitally visualisering og kvantifisering av dimensjonene av klynger av immunkompleks avleiringer som angitt ved anti-CD21/35-Fab-ATTO590 på follikulære dendrittiske celler, i opptil 120 mikrometer dybde i germinale sentre i knehasecyste lymfeknuter (3a og 3b). Mens slike strukturer er ikke synlig ved standard TPLSM tilnærminger, kan vi identifisere dem individuelt og selv visualisere sine dynamikk ved hjelp av vår tilnærming. Tall 3e og 3f støtte denne innsikten, som viser direkte sammenligning mellom den 3D fluorescens bilde av immuncelle innskudd i en germinal sentrum som ervervet ved konvensjonell TPLSM (PMT-basert) og MB-SI-TPLSM. Videre kunne interaksjoner av immun komplekse innskudd med germinal sentrum B-celler bli svært løst (Tall 3c og 3d, Movies 1 og 2), og kan nå være investigated i kombinasjon med intra funksjonelle prober for spredning, differensiering eller apoptose. I et neste trinn, vil vi bruke vår tilnærming til også undersøke den dynamiske kommunikasjon av germinale B-celler med T-hjelpeceller, som antas å utgjøre den andre avgjørende fenomen for B-celle klonal seleksjon i sekundære lymfoide organer.
.. Figur 1. Prinsipp og oppsett av multistråle stripete-belysning to-foton laserskanning mikroskop Strålen av en fleksibel fs-pulset Ti: Sa laser (bølgelengdeområdet 690-1,080 nm, 140 fsec, 80 MHz) er dempet av en modul er laget av et λ / 2-plate og en tynn-film-polarisator, er dens pulser forkomprimert i et prisme basert GVD-kompensasjonsmodulen og til slutt delt i 2, 4, 8, 16, 32, eller 64 bjelker,danner en beamlet linje. To påfølgende beamlets innenfor linjen har vinkelrette polarisasjonene (merket rødt og grønt i beamlet linjen), og er forskjøvet i tid for å unngå interferens. Den tidsforskyvning mellom to påfølgende beamlets beløper seg til 3 psec. For bilde oppkjøpet, er det beamlet linjen fokusert inn prøven ved et objektiv (20X vannimmersjonsobjektiv linse, NA 0.95, WD 2 mm) og vinkelrett skannet, slik at en veldefinert periodisk mønster genereres. Dette mønsteret er oversatt langs beamlet linjen. Den serie av bilder generert på denne måten detekteres gjennom interferensfiltre som er montert på et filterhjul med en EM-CCD-kamera og til slutt undersøkt med et minimum-maksimum-algoritmen. Single-bjelke TPLSM basert på PMT-deteksjon ble utført med samme mikroskop. I dette tilfellet har vi brukt bare en laserstråle for å skanne prøven, og vi spektralt løst i fluorescens-signal med tilsvarende dikroiske speil og interferensfiltre før detekterering det med fotomultiplikatorrør. Alternativt, i stedet for Ti:. Sa laserstråle, at strålen av en optisk parametriske oscillatoren kan sammenkoples med mikroskop for å utføre lang bølgelengde MB-SI-TPLSM Trykk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Spatial oppløsning av multistråle stripete-belysning TPLSM forhold til standard PMT-basert og multifokal CCD-basert TPLSM. (A) Representative aksiale profiler samt xy og XZ projeksjoner av SHG i kollagenfibre i 100 mikrometer dybde innen lymfe node. lexc = 900 nm, deteksjonsbølgelengder varierer 447 ± 30 nm, foton flux Φ = 4,75 x 10
Figur 3 Intravital avbildning av germinale sentre fra MB-SI-TPLSM (a) 3D fluorescens bilde av lyset sonen til en germinal senter merket ved CD21/35-Fab-ATTO590 (rød) i en mus immunisert med haptene -.. Kylling γ -globulin (NP-CGG) etter adoptiv overføring av B1-8 EGFP + B-celler (grønne). Immun komplekse innskudd (CD21/35 merking) på follikulære dendrittiske celler (FDC) kan visualiseres individuelt, som observert i zoom-in (b) (a) på bildet, og har (både lateral og aksial) dimensjoner i området 400-800 nm i opp til 120 mikrometer dybde. Germinal sentrum B-celler i vaksinert B1-8 EGFP + mus er oppdaget (c), mens kontaktene (d) delvis ansvarlige for modningen av immunrespons kan nå også bli visualisert. λ exc = 850 nm, deteksjonsbølgelengder varierer 605 ± 20 nm (ATTO590) og 525 ± 25 nm (EGFP), foton flux Φ = 7,05 x 10 28 foton / cm 2 · sek. Skala bar (a) 20 pm, (b) 10 pm, (c) 30 mikrometer, (d) 10 mikrometer. 3D fluorescens bilder av samme område innenforlys sone av en germinal sentrum merket av CD21/35-Fab-ATTO590 som registrert av MB-SI-TPLSM (e) og konvensjonell (PMT-basert) TPLSM (f), henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette figuren.
Filmtekster
Film-1 og -2
Dynamics av immun komplekse innskudd på sekundære follikulære dendrittiske celler (FDC) og deres samspill med germinal sentrum B celler som nedtegnet av MB-SI-TPLSM. Immun komplekse forekomster er merket av CD21/35-Fab-ATTO590 (rød) mens germinal sentrum B-celler er B1-8 Jk - / - EGFP + celler (grønn).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med intra optisk avbildning er å dynamisk og funksjonelt visualisere cellular motilitet og samhandling for å forstå vev og organ funksjon i helse og sykdom 5. Den kraftigste teknologi for å oppnå dette, multi-foton laserskanning mikroskopi, har fortsatt å overvinne begrensninger knyttet til bølge foran forvrengninger, spredning, treg oppkjøp, fotobleking og photodamage, som begrenser dens romlig oppløsning, kontrast samt sin tid-oppløsning .
Det er to fremgangsrike løsninger for å oppnå en bedre magnetisering (og utslipp) foton styring i dype vev som fører til bedre romlig oppløsning, økt kontrast (økt signal-til-støy-forhold, på grunn av økt signal), og dermed redusert fotobleking og photodamage : de adaptive-optikk tilnærminger og bruk av lengre eksitasjonsbølgelengdene - tunbare infrarød eksitasjon seks. I det siste tiåret, begrepet bølge foran tilsvarDette skjer ved adaptiv optikk har blitt overført fra astronomi til bio-optisk bildebehandling og også til multi-foton mikroskopi. Mens den første adaptiv optikk tilnærminger for to-foton mikros stolt på bølgen foran sensing og trengte en subdiffraction referanse, dvs. en "guide star", i likhet med astronomi, dagens systemer er bedre egnet til dype vev bildebehandling 12. For eksempel, de bruker koherens-gating av eksitasjonsstråling for bølge foran sensing 13,15, eller at de ikke bruker noen eksterne bølge foran sensing i det hele tatt, men utvikle tilpasnings algoritmer basert enten på kryss-korrelasjon av bilder etter elev segmentering 17 eller på iterativ stokastiske søk av de ideelle parametre og påfølgende forstyrrelser med ukorrigert bilde som hentes fra forrige iterasjon trinn - Slag 16, eller de bruker fotoakustikk å karakterisere bølgen foran skjevheter og spredning effekter 20. Likevel, på grunn av en sterkt varierende foaktive indeks i vev, de adaptiv optikk tilnærminger er ganske lav, da korreksjonen trinn må gjentas for forholdsvis små områder (ca. 10 x 10 mm 2) 16. I tillegg, enten ved bølgefront eller spredningseffekt korreksjon, ligger det maksimalt oppnåe romlig oppløsning fremdeles er begrenset av diffraksjon.
Vår tilnærming er i stand til å delvis overvinne byrdene av bølgen foran aberrasjon og av spredning, men også presser oppløsningen utover diffraksjon grensen. Ved hjelp av objektiv med høyere numerisk apertur, kan de absolutte verdiene for aksial oppløsning bedre til rundt 400 nm 20. Prisen for forbedret oppløsning er en brattere nedbrytning av signal-til-støy-forholdet i dype vev, sammenlignet med konvensjonelle TPLSM. Dette skyldes nødvendigheten av å bruke felt deteksjon i MB-SI-TPLSM. Som vist før 15, er bruken av feltdetektorer istedenfor punktdetektorer forbundet med denne brattere nedbrytning av SNR due til sterkere spredning av lyset som er relevant bare for feltregistrering. Dermed er den maksimale bildedybde for feltregistrering TPLSM metoder ca. 25% redusert i forhold til konvensjonelle (dvs. punkt deteksjon basert) TPLSM. En grei praktisk løsning er å bruke lengre eksitasjonsbølgelengdene og å oppdage lengre utslippsbølgelengder. Naturligvis, forbedrer dette dybdeavhengige SNR i konvensjonell TPLSM i samme grad som i MB-SI-TPLSM.
Såvidt oppkjøpet hastighet er opptatt av, er MB-SI-TPLSM bare begrenset av hastigheten på galvanometric skanner og / eller ved å lese ut av kameraet og fortjeneste av strålen splitting til 32 laserstråle lar. I forhold til vanlige flerstråle kamerabasert TPLSM er MB-SI-TPLSM litt langsommere på grunn av behovet for ikke bare å skanne, men også til å skaffe seg synkront hver av ca. 10 stripet belyst bilder for å generere det endelige bilde med høy oppløsning. Men beholder vår teknikk en cløret hastighet fordel over konvensjonelle TPLSM (basert på enkeltstråle skanning og punkt gjenkjenning). Derfor er oppkjøpet tid for en 150 x 150 mikrometer 2 (512 x 512 piksler) 841 msek med konvensjonelle TPLSM (skanner frekvensen 800 Hz) og 109 msek ved hjelp av MB-SI-TPLSM. Derved magnetiseringseffekten per bjelke og holdetiden per piksel er de samme for både konvensjonelle og MB-SI TPLSM, slik at signalet er sammenlignbare for begge oppsettene. Som tidligere vist 20, fotobleking og photodamage effekter i MB-SI-TPLSM eksperimenter er lav og sammenlignbar med godt utført konvensjonell TPLSM.
I fremtiden vil det være ønskelig å kombinere de komplementære tilnærminger av adaptiv-optikk og stripete-belysning i det infrarøde området for ytterligere å forbedre intra TPLSM, som ligner på det som er oppnådd i adaptiv optikk for strukturert-belysning 21. Men for å oppnå disse målene, betydelig raskere adaptiv-optikk tilnærmingermå utvikles.
Den forventede høye effekten av den stripete-belysning tilnærming for biovitenskap og biomedisin ligger i dens evne til å forbedre oppløsningen og forbedrer kontrasten i dype vev, motvirke bølge foran forvrengning og spredning effekter, men også går utover diffraksjon grenser i laser-scanning mikroskop, etter ganske enkelt å styre skanningen, og velger en passende følsom feltdetektor.
Den forventede høye effekten av den stripete-belysning tilnærming for biovitenskap og biomedisin ligger i dens evne til å forbedre oppløsningen og forbedrer kontrasten i dype vev, motvirke bølge foran forvrengning og spredning effekter, men også går utover diffraksjon grenser i laser-scanning mikroskop, etter ganske enkelt å styre skanningen, og velger en passende følsom feltdetektor.
Den stripete-belysning tilnærming kan brukes for intra deep-tissue imaldring i alle to-foton laserskanning mikroskop som er i stand til å synkronisere kamera deteksjon med galvoscanner bevegelse i enkeltstråleskanning. I dette tilfellet er de enkle striper på det eksitasjon mønster genereres i ettertid og ikke samtidig som i MB-SI-TPLSM. Ved hjelp av enkel skanning bjelken i SI-TPLSM vi naturligvis forvente en litt langsommere oppkjøpet rate av fluorescens bildene i forhold til konvensjonell TPLSM (enkeltstråleskanning, punkt detektor-baserte TPLSM), men den samme forbedringen i romlig oppløsning og kontrast som demonstrert for MB- SI-TPLSM. Den nedre oppkjøpet hastighet sammen med den begrensning i bildedybde reduserer betraktelig bruksområdet til single-bjelke SI-TPLSM sammenlignet med MB-SI-TPLSM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Volker Andresen er aksjonær i LaVision Biotec GmbH, Bielefeld, Tyskland. De andre forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker R. Heintzmann for fruktbare diskusjoner under utviklingen av den stripete-belysning tilnærming, K. Rajewsky og A. Haberman for å gi C57BL / 6 B1-8 GFP transgene mus. Vi erkjenner at Deutsche Forschungsgemeinschaft henhold stipend NI1167/3-1 (til RN), HA5354/4-1 og SFB633, prosjekt A15 (til AEH), Charité henhold stipend Rahel-Hirsch fellesskap (til RN) for økonomisk støtte. Vi erkjenner spesielt nettverket JIMI for fruktbare diskusjoner og infrastrukturell støtte
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATTO590 – NSH for coupling | ATTO Tec, Germany | AD-590-35 | |
| CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 | DRFZ, Berlin | The coupling reaction was performed in the central lab of our institution. | |
| B1-8 Jk-/- EGFP+ | Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US | Can be also found at Jackson Laboratories (JAX). | |
| EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment | StemmCell Technologies, Germany | 19854 | |
| Polystyren beads (605), 0.2 µm | Life Technologies, Germany | F8803 | |
| Equipment | |||
| TriMScope I | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| OPO (manual version) | APE, Berlin, Germany | ||
| Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II | Coherent, Duisburg, Germany | ||
| Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm | Olympus Germany, Hamburg, Germany |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).
- Esplugues, E., et al. Control of Th17 cells occurs in the small intestine. Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26 (5), 655-667 (2007).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Herz, J., et al. Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator. Biophys. J. 98 (4), 715-723 (2010).
- Hell, S. W., Rittweger, E. Microscopy: Light from the dark. Nature. 461 (7267), 1069-1070 (2009).
- Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy. Neuron. 63 (4), 429-437 (2009).
- Bianchini, P., et al. Single-wavelength two-photon excitation - stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).
- Berning, S., et al. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551 (2012).
- York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).
- Gu, M. Advanced optical imaging. , Springer Verlag. Berlin. (2001).
- Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy. J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).
- Booth, M. J. Adaptive optics in microscopy. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).
- Niesner, R., et al. The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging. Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).
- Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).
- Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).
- Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues. Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).
- Lu, J., et al. Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation. Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).
- Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS ONE. 7 (12), (2012).
- Debarre, D., et al. Adaptive optics for structured-illumination. Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).
