Stærkt Løst Intravital Striped-belysning mikroskopi af kimcentre

Summary

Høj opløsning intravital billeddannelse med forbedret kontrast op til 120 um dybde i lymfeknuder voksne mus opnås ved rumligt at modulere excitation mønster af en multifokal to-foton mikroskop. I 100 um dybde målt vi beslutninger af 487 nm (laterale) og 551 nm (aksialt), derved omgå spredning og diffraktion grænser.

Abstract

Overvågning cellulær kommunikation ved intravital dybtliggende væv multi-foton mikroskopi er nøglen til at forstå den skæbne immunceller inden tykke vævsprøver og organer i sundhed og sygdom. Ved at styre scanning mønster i multi-foton mikroskopi og anvende passende numeriske algoritmer, udviklede vi en stribet-belysning tilgang, som gjorde det muligt for os at opnå 3-fold bedre aksial opløsning og forbedret signal-til-støj-forhold, dvs kontrast på mere end 100 mM vævsdybde indenfor stærkt spredende væv af lymfoide organer i forhold til standard multi-foton mikroskopi. Købet hastighed samt fotoblegning og solskader effekter var magen til standard foto-multiplikator-baserede teknik, mens den billeddannende dybde var lidt lavere på grund af brugen af ​​marken detektorer. Ved at bruge den stribede-belysning tilgang, er vi i stand til at observere dynamikken i immunkompleksaflejringer på sekundære follikulære dendritiske celler ̵1; på niveauet af nogle få proteinmolekyler i kimcentre.

Introduction

To-foton laser-scanning mikroskopi (TPLSM), med dens fordele for dybtliggende væv billedbehandling relateret til infrarød ultrakorte pulserende excitation ^1, har revolutioneret vores syn på vitale processer på en enkelt-celle niveau ved at afsløre motilitet og interaktion mønstre af forskellige celledelmængder i levende dyr ^2-5. Men den nuværende teknologi er stadig utilstrækkelig til at belyse de mekanismer, organfunktion og dysfunktion som en forudsætning for udvikling af nye terapeutiske strategier, idet den gør kun sparsomme oplysninger om den molekylære basis for cellulære svar inden væv i sundhed og sygdom. Moderne teknologi muliggør kun en rumlig vindue af få hundrede mikrometer grundet spredning og Bølgefrontkorrektionssystemer forvrængning effekter på rumlig opløsning og signal-til-støj-forhold ^6, som er særligt tydeligt i meget kompakt væv af voksne dyr. Disse spredning og Bølgefrontkorrektionssystemer forvrængning effekter skyldes en meget heterogen end anisotropisk fordeling af brydningsindekset i væv, hvilket i et første skridt til en dybde afhængig forringelse af 3D rumlig opløsning og endelig til det samlede tab af signal, der stammer fra ballistiske excitation fotoner, dvs tab af signal-til-støj-forhold. Med hensyn til biovidenskabelig og biomedicinske dybe væv applikationer, betyder det, at den nuværende teknologi er i stand til utvetydigt afslører cellulær kommunikation, fordi dårlig opløsning ville føre til falsk positive samspil mens reduktionen af ​​signal-til-støj-forhold vil få systemet til at overse nogle interaktioner mellem dim strukturer.

For at utvetydigt afsløre cellulære interaktioner på en dynamisk måde, er der behov for et stærkt forbedret rumlig opløsning dybt i vævet. De aktuelt indført kraftfulde Nanoscopy teknikker baseret på særlige numeriske algoritmer, fx struktur-belysning adgangsveje på udtynding af den første exciterede tilstand, fx fx dSTORM, Palm, har fundet mange anvendelser i faste celler såvel som i levende cellekulturer ^7. Men for at udvide disse programmer til vævssnit, levende væv og organismer vi stadig nødt til at overvinde alvorlige tekniske problemer. To-foton excitation place med forskellige bølgelængder samt med en enkelt bølgelængde (sw2PE-STED) til excitation og stimuleret emission er blevet anvendt til at forbedre lateral opløsning i hjernesnit ⁸ eller i kunstige matricer med indlejrede celler ^9, henholdsvis på samme aksial opløsning som standard TPLSM. Ved hjælp af en-foton STED kunne dynamik dendritiske spidser blive afbildet på overfladen af hjernebarken (op til 10-15 um dybde) i et levende Thy1 EGFP mus med en opløsning på 67 nm ^10. Et alsidigt værktøj til udviklingsmæssige biologi tilvejebringes af den multifokale strukturerede belysning mikroskopi, som giver to gange forbedret 2Dopløsning. Dog kan denne teknik kun anvendes i organismer med en lav tilbøjelighed til lysspredning såsom zebrafisklarver ^11. Alligevel kan ingen af ​​disse teknikker skal anvendes i stærkt spredende væv af voksne dyr i flere hundrede mikrometer, som er afgørende modeller for biomedicinsk og klinisk forskning af sygdomme med debut efter fødslen.

Uafhængigt af tilnærmelse bruges til at beregne diffraktionsbegrænset bølgefront facon, dvs punktspredningsfunktionen (PSF), efter fokusering gennem en linse, bredden af PSF langs den optiske akse (aksial opløsning) er mindst tre gange større end PSF bredde vinkelret på den optiske akse (lateral opløsning) ^12.. Bølgefrontkorrektionssystemer fordrejninger af forskellige rækkefølger kvantificeret ved Zernike koefficienter væsentligt ændre den bølge foran form af fokuseret elektromagnetisk bølge i dybtliggende væv billeddannelse fører til meget større vævede, især langs den optiskeal kernepunkt ^13-15. Derfor både diffraktion love og bølgefronten forvridninger peger på opløsning langs den optiske akse som den begrænsende faktor i dybtliggende væv billeddannelse. Betragtninger Nanoscopy teknikker fokus på at modvirke grænserne for diffraktion kun er en teknologi, der forbedrer aksial opløsning og kontrast ved at modvirke både diffraktion og bølge-front forvrængning effekter er nødvendige for høj opløsning intravital billeddannelse. Ideelt set bør denne teknik også være hurtig nok til at tillade overvågning af cellulære dynamik.

Den real-tid korrektion af PSF aberrationer og kontrast tab ved hjælp af adaptiv optik i TPLSM er blevet grundigt undersøgt og forbedret i det seneste årti ^13,14,16-18 og det er derfor i øjeblikket den bedste valg fører til en bedre forvaltning af ballistisk excitation fotoner ^14. Still, skyldes, at de fleste Bølgefrontkorrektionssystemer korrektion tilgange anvendes adaptiv optik er iterativ og at de have gentages for små områder (få 10 x 10 um ²⁾ på grund af den høje heterogenitet af brydningsindekset i væv, købet hastighed er betydeligt lavere end nødvendigt til billeddannelse cellemotilitet og kommunikation. Desuden er den fysiske grænse i adaptiv-optik forbedret TPLSM er fortsat bestemt af diffraktion.

Spatial graduering af belysning (SPIN) og tidsmæssige graduering på påvisning side (SPADE) er blevet teoretisk foreslået der skal anvendes på laser-scanning mikroskopi for at forbedre opløsningen. Deres praktiske anvendelse i intravital imaging stadig skal demonstreres ^19.

Tilsammen er der stor efterspørgsel efter udvikling af teknologier, som forbedrer opløsningen for dybtliggende væv billeddannelse i levende voksne dyr. I dette arbejde, opnår vi rumlig modulation af excitation mønster ved at styre scanningen i multi-beam stribet-belysning multi-foton laser-skonserves mikroskopi (MB-SI-MPLSM) ^20. I modsætning til strukturerede belysning tilgange, hvor exciteringsstrålen tværsnit rumligt modulerede, vi bruger kun den scanning proces at opnå den rumlige modulation af excitation. Ved at udvide excitation til en længere bølgelængde, vi er i stand til at forbedre både rumlig opløsning og signal-støj-forholdet i dyb-væv af stærkt spredende væv (f.eks lymfeknude, frit spredning sti 47 um ^6), uafhængigt af den optiske ikke-lineære signal, vi registrerer, fx fluorescens, anden harmonisk generation eller anden frekvens blanding fænomen. Ved hjælp af denne tilgang på excitationsbølgelængder op til 900 nm vi er i stand til dynamisk billede cellulære protein strukturer på omfanget af nogle molekyler i kimcentre af muse lymfeknuder. Således kan vi bedre visualisere samspillet mellem antigen bærer enheder på overfladen af ​​follikulære dendritiske celler og B-celler i processen sondering antigen under immunresponset i sekundære lymfoide organer.

Protocol

Multi-beam Opsætning til Striped-belysning TPLSM

Opsætningen bruges her er en specialiseret multi-beam to-foton laser-scanning mikroskop, som beskrevet tidligere ^6,20. Systemet er illustreret i figur 1. Kan Den fremgangsmåde anvendes på andre to-foton laser-scanning mikroskoper, som er i stand til at synkronisere kamera køb med bevægelsen af galvoscanner spejle, selv om de er kun i stand til at udføre single-beam scanning . I dette tilfælde vil den ulempe være en lavere erhvervelse hastighed, men ligesom ved erhvervelse hastighed i standard PMT-baserede TPLSM. For at opnå optimal kvalitet for så vidt opløsning og kontrast angår, ved den laveste fotoblegning og solskader og hurtigste køb, er det anbefalelsesværdigt at overveje følgende justering trin i opsætning:

1. Kontroller laser magt Tisa laser: check på 100%, sammenligne med fabriksindstillingerne og previoos ejer aflæsninger og bruge det som det er, hvis en excitation bølgelængde i området 700-1,000 nm er nødvendig.
2. Test indikationen fjernbetjening til Ti: Sa stråledeler, dvs kontrollere 0% og 100%-indstillinger. Hvis der en resterende Tisa stråle på 100%, så tjek og nulstille stepmotor null position. Ti: Sa stråledeler består af en lav-ordens λ / 2 plade og en polarisator, som opdeler vinkelret polariserede laserstråler på vinkelrette strålebaner: Den ene er rettet ind i mikroskopet til excitation, og den anden anvendes til at pumpe den optiske parametriske oscillator (OPO). Ved automatisk at dreje λ / 2 plade, en løbende tilpasning af Ti: Sa og OPO magt henholdsvis er opnået.
3. Juster OPO til den ønskede bølgelængde og måle udgangseffekten. Hvis strømmen er for lavt (med en 4 W Ti: Sa-laser ved 800 nm, man skal være i stand til at få 0,8-1 W OPO stråle på omkring 1.050-1.100 nm) optimere pumpebølgelængden og kontrollere indstillingerne for the spejl og pustet krystal. Vælg deres anbefalede optimale værdier, ofte tilgængelige som diagrammer eller grafer og derefter finjustere dem, indtil OPO genlyd i den ønskede bølgelængde output og magt øges.
   1. Hvis strømmen er stadig lav, skal du justere de to tilgængelige spejle OPO med de fire tilgængelige spejl-drejeknapper. Gør dette skridt meget langsomt og i meget små bevægelser, vekslende mellem de forreste og ende spejle.
4. Kontroller, at Ti: Sa og / eller OPO stråler ramte posten spejle på det rigtige, central position.
   1. Brug et stykke hvidt papir (ikke meget skinnende eller reflekterende!) Og en infrarød fremviser til at observere OPO stråle og den højere bølgelængde Ti: Sa bjælker.
      1. Bær beskyttelsesbriller ved arbejde med NIR Ti: Sa bjælker (normalt op til 720-750 nm er synlig for den gennemsnitlige person).
   2. Indstil lasereffekten (e) så lavt som muligt for justeringsproceduren således af minimize potentiel øjenskader.
   3. Hold altid rummets omgivende lys på, så øjets pupil indsnævres.
   4. Husk, at lasereffekten er fint kontrolleret af dæmpeled bestående af en λ / 2 plade og polarisatorer, som ikke er i kraft endnu, da Ti: Sa stråle ind i scan-head!
5. Kontroller, at indgang membran er ramt midt i Ti: Sa-og / eller OPO stråle; hvis ikke, skal du justere de sidste to spejle før laserstrålen ind i scanningen hovedet.
   1. Brug IR-fremviseren, og et lille stykke hvidt (men ikke skinnende / reflekterende!) Papir.
   2. Luk altid mellemgulvet ved indrejse i mikroskopet, så laserstrålen position kan bedømmes mere præcist. Vigtigt: Glem ikke at genåbne mellemgulvet, før du fortsætter til trin 6!
6. Juster den reflekterede laserstråle strålegang i mikroskop i overensstemmelse hermed. Gør dette på små segmenter og udføre iterativ stråle-walking.
   1. Kontrollér hele lys-sti, hvis lyseffekten fra objektivets ikke er tilstrækkelig.
   2. Kontroller altid let sti, når du bruger systemet for første gang efter en lang periode, hvor en større reparation, udskiftning af optiske elementer, eller hvis der er mistanke om at eksistere med output problemer.
7. Sørg for, at alle aktive optiske overflader er rene, især at de er fri for støv! Hvis overfladerne er dækket med et lag af støv, er bølgefronten forvrænget selv før indtastning objektivlinsen og den resulterende laserstråle vil aldrig give et skarpt billede af prøven!
   1. Rengør om nødvendigt spejlene med et foldet stykke linse papir, fugtet med ethanol eller isopropanol.
8. Kontroller, at strålen kommer tilbage til det spejl, der er placeret direkte over posten spejlet i slutningen af ​​prisme-baserede puls kompressor, efter at lyset stien er indstillet. Herfra er strålen reflekteres into strålen multiplexer (BM).
9. Tjek om laserstrålen rammer mellemgulvet, der er placeret ved indgangen af ​​bjælken multiplexer, direkte før λ / 2 plade, ændre polarisering af laserstrålen til at passe til kravene til et bredt bånd 50% transmission og 50% refleksion i BM.
   1. Først lukker membranen således at bjælken position kan bedømmes mere præcist og udføre stråle gå mellem de to membraner, nemlig en ved indrejse i mikroskop og den anden på BM post. For andre single-beam scanning mikroskoper membranen skal være placeret ved indgangen til xy-scanner.
   2. Hvis strålen ikke rammer midten af ​​nedlukket blænde justere ovennævnte spejl, placeret direkte før BM indgang mellemgulvet. Vigtigt: Glem ikke at genåbne mellemgulvet, før du fortsætter til trin 10.
10. Med mellemgulvet genåbnet, tjek om laserstrålen rammer BM spejle ideres midt-punkt. Brug en smal strimmel papir for ikke at blokere en anden del af BM komplekse lys-stier!
11. Tjek om strålen rammer midten af ​​exit spejle: top spejl for parallel polarisering "P", nederst spejl for vinkelret polarisering "S". Hvis ikke, skal du justere posten spejlet før BM.
12. Kontroller, om "S" og "P" polariseret stråle lader grupper ind polarisatorens terning og overlapper ordentligt på indrejse i xy-scanner. Springe disse trin i tilfælde en enkelt stråle scanning mikroskop anvendes.
13. Tjek om laserlys passerer centralt scanningen og røret linser og får gennem midten af ​​objektivets 'tilbage brændplanet. Vigtigt: dette trin skal gøres med laserstrålen i midterstilling, ikke i en parkeringsstilling!
    1. Udskift objektiv med et sigte værktøj ("bulls eye"), og se om laserstrålen rammer målet i midten, og ombelysning er endnu.
    2. Hvis det ser ud til at være tilfældet, lukke blænden før BM og undersøg om et cirkulært mønster forekommer interferens, med en sort cirkel i midten (minimum interferens).
       1. Juster posten spejlet, hvis der er et markant skift i forhold til midten af ​​plet.
14. Nu erstatte plet med et objektiv, fx med en 20X vand nedsænkning linse.
    1. Kontroller output lys-felt med et stykke hvidt papir. Dette bør være lyse, ensartet og centralt placeret.
    2. Mål udgangseffekt: 100% OPO med 100% pumpe Ti: Sa (4 W), bør man få ca. 100-150 mW efter linsen på 1.100 nm (i mikroskopet bruges her). Lavere laser beføjelser vil ikke være tilstrækkeligt til at udføre multi-beam SI-TPLSM. For single-beam scanning SI-TPLSM, 5-10 mW er tilstrækkelige. Laserstrålen skal forblive i midterstilling uden at scanned!
15. Hvis der udføres MB-SI-TPLSM, justere spejlene i BM som følger:
    1. Placer en homogent fluorescerende prøve, fx en rød fluorescens dias, på scenen og fokusere laserstrålen inde i prøven, men nær den øverste overflade (dvs. tæt på målet objektivets front).
    2. Indstil mikroskopet til multi-beam mode og vælg antallet af bjælker, i begyndelsen, helst kun én stråle, og polariseringen, fx "P".
       1. Find laserstrålen af ​​imaging den fluorescerende slide: Indstil "P" lukkeren åben og køre CCD-kameraet kontinuerligt, mens fokus strålen.
       2. Sørg for, at strålen er i midterstilling, og at scanneren er slukket. Sørg for, at strålen ikke scannet!
       3. Find strålen ved at lede efter et lyspunkt nær midten af ​​kameraets chip.
       4. Fokusere strålen, indtil stedet er den klareste og skarpeste, dvs billedplanet afmikroskop svarer til positionen af ​​kameraet chip; sænke lasereffekten således at stedet ikke er mættet. Med en godt afstemt system, betyder det, at laser magt har til at være i nærheden af ​​minimum, når man arbejder i en-beam mode (omkring 0,6 mW laser magt bør arbejde).
       5. Hvis pletten er betydeligt off-center, flytte den tættere på midten ved at justere spejlet foran BM (eller scanneren for single-beam scanning).
       6. Når tilpasser også den anden polarisering, nemlig "S"-stråle, nu skifte til 2-beam tilstand åbner "S" lukker og kontrollere placeringen af strålen (kun én stråle kan ses, hvis kun "S" lukkeren er åben ).
       7. Når du er færdig, skal du skifte til 4-stråle, og brug "P" polarisering mode ("P" lukkeren åben). Nu to beamlets vises.
       8. Arranger to beamlets at være perfekt parallelt med den nederste kant af kameraets visning, og sætte dem til at være 2,8 um hinanden.
          Hvis de ikke er justeret korrekt, skal du justere det første spejl af BM.
          1. Tilpasse aldrig skruen i midten, i stedet bruge de to perifere skruer til at flytte spejlet, indtil de to bjælker er 2,8 um fra hinanden og helt vandret arrangeret.
       9. Skift nu til 8-beam tilstanden i "P" polarisering, og tilpasse det andet BM spejl (også uden den røde prik), indtil de 4 beamlets er lige langt på 2,8 um, og er anbragt parallelt med den nederste kant af billedet.
       10. Gentag i 16 - og 32-beam-tilstand, justere 3. og 4. BS spejle, hhv. Det er vigtigt for beamlets at være lige langt, da SI-algoritmer, den enkleste er den min-max (HiLo) algoritme, baseret på denne antagelse.
16. Udskift ensartet fluorescerende prøve med et heterogent struktureret en, fx på tværs af farvede Convallaria rødder.
    1. Gå til parkering position exciteringsstrålen, which er normalt placeret ved store værdier af scanneren koordinater, fx (10,000; 10,000).
    2. Scan et (multi-beam) billede med CCD-kameraet. Kontroller, at billedet vises skarp, ensartet og lige.
    3. Indstil kameraet, hvis billedet vises drejet: vride kamerahuset aksialt omkring den lodrette akse med hånden (være blid!) Indtil billedet rettes.
17. Start xy-scanner for at styre scanning proces til at generere excitation mønster, dvs stribet billede.
    1. I tilfælde af multi-beam scanning flytte y-scanneren spejl, dvs. vinkelret på beamlet linje, på en sådan måde at generere en kvadratisk stribet billede.
    2. Hvis synsfeltet frembragt som beskrevet i trin 17.1. er for lille, forlænge scanning rutine ved at bevæge X-scanneren spejl til en position, der sikrer, at strålen-let linie fordobles og beamlets er ækvidistante langs hele linjen. Gentag den nøjagtige bevægelseaf y-scanneren spejl efter x-scanneren spejl bevæges til at generere større stribet billede.
    3. I tilfælde af enkelt-beam scanning, skifte y-scanneren spejl bevægelse med x-scanner spejl bevægelse gentagne gange på ækvidistante positioner - defineret af forskeren - at generere den ønskede stribede billedet.
    4. Sørg for at bruge for flytning af y-scanneren spejl en kommando for konstant hastighed (reduceret acceleration / deceleration), og for x-scanneren spejl én ved maksimal hastighed (maksimal acceleration / deceleration).
18. Automatisk erhverve og gem stribede billede med kameraet (felt-detektor). Derfor synkronisere kameraet med scanneren og bruge scanneren som master aftrækkeren.
19. Gentag erhverve stribede billeder (scanning protokollen beskrevet i protokol 17) ved at flytte x-scanneren spejl på forskellige positioner som følger:
    1. Vælg nok gentagelse trin og i passende længde skridt mellemto efterfølgende stribede billeder til at dække afstanden mellem to på hinanden følgende beamlets (i dette tilfælde 2,8 um og et skridt af scanner spejle lig 25 nm); kan det være tilrådeligt at lade en lille overlapning, dvs yderligere 0,3-0,4 um.
    2. Indstil x-skift til en værdi, der svarer til den lateral opløsning grænse ved en given bølgelængde. Som et eksempel, ved hjælp af 10 trin i x-scanneren spejl per skift og 12 eller 13 skift føre til bedst både aksiale og laterale opløsning giver dette system. Check med en struktureret dias, f.eks Convallaria rødder dias, hvilke numre fungerer bedst i systemet, der anvendes.
    3. Optimer disse to værdier, indtil Convallaria billede bliver det skarpeste: Brug den linje profilen værktøjet på de beregnede SI billederne og sammenligne bredden af ​​den linje profiler (som er fluorescens signalet fra Convallaria cellevægge).
    4. Erhverve hver stribet billede synkroniseret med scanneren bevægelse og gemme det separat, fx
20. Åbn et komplet sæt af stribet billeder som matricer, dvs 3D matrix, i evalueringen rutine og bruge enten min-max algoritme eller en Fourier-transform algoritme til at generere en 2D matrix af den høje opløsning SI-image. De algoritmer, der tidligere blev beskrevet i detaljer ^20.

Mus immunisering og forberedelse til Intravital Imaging

De dyreforsøg blev godkendt af de relevante statslige udvalg for dyrevelfærd (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) og blev udført i overensstemmelse med gældende retningslinjer og forskrifter (dyreforsøg licens G0153/08).

21. Induktion af en kimcenter reaktion i knæhaselymfeknuderne lymfeknude og forberedelse af imaging felt blev udført som beskrevet før ^4.. Renses B-celler immunomagnetically fra milten fra B1-8 ^{+ / +} JK ^{- / -}og B-celler af B1-8 ^{+ / +} JK ^{- / -} GFP ⁺ mus.
22. Injiceres intravenøst ​​3 x 10 ⁶ NP-specifikke B-celler med en renhed på> 95% ved hjælp ⅛ B1-8 ^{+ / +} JK ^{- / -} GFP ⁺ og ⅞ fluorescerende B1-8 ^{+ / +} JK ^{- / -} i C57BI / 6 modtagere .
23. En dag efter celleoverførsel immunisere modtagerne med 10 ug NP-CGG (nitrophenyl-kylling ɣ globulin) emulgeret i komplet Freunds adjuvans (CFA) i højre bagben mad pad.
24. Label Fab-fragmenter af anti-CD21/CD35 antistoffer med ATTO590-succinimidylester.
    1. For at fremhæve netværket af follikulære dendritiske celler (FDC) inden for kimcenter in vivo, injicere 10 ug fluorochrommærkede Fab fragmenter i det højre bagben trædepuden af musene 12-24 hr før intravital analysen er gennemført.

Følgende trin skal være considerød for udarbejdelsen af ​​popliteale lymfeknude for intravital imaging (dag 8-10 efter immunisering):

25. Bedøver musen ved ip injektion af ketamin / xylazin, mængden afhængigt af deres vægt.
26. Test reflekser til at overvåge dybden af ​​bedøvelse i hele billeddannelse periode.
27. Shave ben, ryg og højre flanke af mus streng og bruge depilating creme for at fjerne resterende hår fuldstændigt.
28. Fix højre lårknude: lokalisere knoklet chip med fingrene, sæt en lille incision i huden med en saks, indtil en lille hvid trekant-formet fascia vises.
29. Clamp knoklet chip under denne fascia med spidse pincet af restrainer.
30. Fastgør rygsøjlen i lænde-området ved hjælp tandede pincet.
31. Fix højre bagben på restrainer og spænd skruen.
32. Tape hale for at holde benet i den rigtige position.
33. På den kaudale side af låret, skabe et indsnit i huden, i det område, hvor den fremtrædende popliteal vein enters vævet, adskille huden fra det underliggende væv med stumpe pincet og følg knæhasen vene fra proximale til den distale.
34. Expose lymfeknude ved stump pincet, så prøv at undgå at skære for at beskytte de fine lymfekar (holde lymfeknude i PBS under udsætter).
35. Opret en kreds af vakuum fedt omkring lymfeknude, udfylde dette pyt med PBS.
36. Sæt dækglasset på sin position og placere termometeret-probe (holde temperaturen på 37 ° C, ellers cellen hastighed vil dramatisk variere).
37. Langs den øverste kant af dækglasset tilføje en kreds af vakuum fedt.
38. Sæt varmefladen i sin position på vakuum fedt, skabe en sæl på en lignende måde som før og tilsæt vand / PBS på dækglas at dyppe målet ind.
39. Efter billeddannelse, er musen holdes i anæstesi, mens stigende doser af ketamin / xylazin til en dødelig dosis, efterfulgt af cervikal dislokation.

Representative Results

Rumlig opløsning i lymfeknuder

Dimensionerne af den effektive punktspredningsfunktionen (MIFRESTA) svarer til den rumlige opløsning af et mikroskop ^12.. Vi målte denne tredimensionelle funktion ved at erhverve den anden harmoniske generation signal af kollagen fibre i lymfeknuder af vores MB-SI-TPLSM sammenlignet med etablerede to-foton laser scanning mikroskopi teknikker, dvs afsløring felt TPLSM (ved hjælp af CCD-kameraer), og punkt afsløring TPLSM (ved hjælp af PMT'er).

Fra disse målinger bliver det tydeligt, at der på overfladen af prøven, svarer både tværgående og aksiale resolutioner til de forventede værdier forudsagt af diffraktionsteori ^20. Men med stigende billedbehandling dybde og dermed med stigende optisk vej både excitation og emission stråling gennem medier med meget varierende brydningsindeks, den rumlige opløsning forværres betragteligt, uafhænhængigt af de beskæftigede setup (Figur 2). Af MB-SI-TPLSM nåede vi, uafhængigt af imaging dybde, en ca. 20% bedre lateral opløsning og en 220% bedre aksial beslutning i forhold til de faste TPLSM tilgange.

Dynamik i immunkomplekser på follikulære dendritiske celler i kimcentre

Den klonselektion af B-celler i løbet af immunrespons, inden sekundære lymfoide organer af voksne mus er det første skridt på vej til at differentiere til memory B-celler eller plasmaceller ^4. I denne proces er det stærkt dynamisk interaktion mellem follikulære dendritceller (FDC) og B-celler på det niveau af immunkompleks (klynger i få proteinmolekyler) i kimcentre menes at spille en central rolle. Kun ved hjælp af en meget løse intravital mikroskopi teknologi er det muligt at dissekere denne cellulær kommunikation og dens konsekvenser for immunresponset. Vores tilgang MB-SI-TPLSM giver for første gang mulighed for intravitally visualisere og kvantificere dimensionerne af klynger af immunkompleksaflejringer som mærket af anti-CD21/35-Fab-ATTO590 på follikulære dendritiske celler, i op til 120 um dybde i germinale centre knæhaselymfeknuder (figur 3a og 3b). Mens sådanne strukturer er ikke synlige ved standard TPLSM tilgange, kunne vi identificere dem individuelt og endda visualisere deres dynamik ved hjælp af vores tilgang. Figur 3e og 3f støtte denne indsigt, der viser den direkte sammenligning mellem 3D-fluorescens billede af immuncelletyper indskud i en kimcenter som erhvervet ved konventionel TPLSM (PMT-baseret) og MB-SI-TPLSM. Desuden kunne vekselvirkninger immunkompleksaflejringer med kimcenter B-celler være meget løst (figur 3c og 3d film 1 og 2), og kan nu være jegnvestigated i kombination med intravital funktionelle prober til proliferation, differentiering eller apoptose. I et næste trin, vil vi bruge vores tilgang til også at undersøge den dynamiske kommunikation germinalceller B-celler med T-hjælper celler, som menes at udgøre den anden afgørende fænomen for B-celle klonselektion i sekundære lymfoide organer.

.. Figur 1. Princip og opsætning af multi-beam stribet-illumination to-foton laser scanning mikroskop Strålen af en flydende FS-pulserede Ti: Sa-laser (bølgelængde interval 690-1,080 nm, 140 fsec, 80 MHz) er svækket af et modul fremstillet af et λ / 2 plade og en tynd-film-polarisator, er dens pulser forkomprimeres i en prisme-baseret GVD-kompensation modul og til sidst delt i 2, 4, 8, 16, 32, eller 64 bjælker,danner en beamlet linje. To på hinanden følgende beamlets inden for linjen har vinkelrette polariseringer (mærket rød og grøn i beamlet linie) og forskydes i tid for at undgå interferens. Tidsforskydningen mellem to på hinanden følgende beamlets udgør 3 psec. For billedet overtagelsestidspunktet, beamlet linje fokuseres i prøven ved en objektiv (20X vand nedsænkning objektiv, NA 0,95, WD 2 mm) og vinkelret scannet, således at en veldefineret periodisk mønster er genereret. Dette mønster omsættes langs beamlet linje. Genereret serie af billeder på denne måde opdages gennem interferensfiltre monteret på et filter hjul ved en EM-CCD-kamera og til sidst evalueret af en minimum-maksimum algoritme. Single-beam TPLSM baseret på PMT-detektion blev udført med det samme mikroskop. I dette tilfælde brugte vi kun én laserstråle til at scanne prøven, og vi spektralt løst fluorescens signal med tilsvarende dichroic spejle og interferensfiltre før detekterening det med lysforstærkningsrør. Alternativt i stedet for Ti:. Sa laserstråle, strålen af en optisk parametrisk oscillator kan kobles til mikroskopet til at udføre lang bølgelængde MB-SI-TPLSM Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2.. Rumlig opløsning af multi-beam stribet-belysning TPLSM forhold til standard PMT-baserede og multifokal CCD-baserede TPLSM. (A) Repræsentative aksiale profiler samt xy og XZ fremskrivninger af SHG i kollagen fibre i 100 mM dybden inden lymfeknuder node. lexc = 900 nm, afsløring bølgelængder spænder 447 ± 30 nm, fotonflux Φ = 4,75 x 10 cm2 · sek. (B) Gul-grøn fluorescerende perler indlejret i agarose som registreret af MB-SI-TPLSM og konventionelle TPLSM (SB-PMT). λ _exc = 850 nm, afsløring bølgelængder spænder 525 ± 25 nm, fotonflux Φ = 2,08 x 10 ²⁹ foton / cm ² · sek, mesh enhed = 3,7 mM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 Intravital billeddannelse af kimcentre af MB-SI-TPLSM (a) 3D-fluorescens billede af lyset zone af en kimcenter mærket af CD21/35-Fab-ATTO590 (rød) i en mus immuniseret med hapten -.. Kylling γ -globulin (NP-CgG) efter adoptiv overførsel af B1-8 EGFP ⁺ B-celler (grøn). De immunkompleksaflejringer (CD21/35 mærkning) på follikulære dendritiske celler (FDC) kan visualiseres enkeltvis, som observeret i (b), af billedet zoom-in (a), og har (både laterale og aksiale) dimensioner i området 400-800 nm i op til 120 um dybde. Kimcenter B-celler i den immuniserede B1-8 EGFP ⁺ mus opdages (c), mens kontakterne (D) delvis ansvarlige for modning af immunresponset kan nu også visualiseres. λ _exc = 850 nm, afsløring bølgelængder spænder 605 ± 20 nm (ATTO590), og 525 ± 25 nm (EGFP), fotonflux Φ = 7,05 x 10 ²⁸ foton / cm ² · sek. Scale bar (a) 20 um, (b) 10 um, (c) 30 mM, (d), 10 um. 3D-fluorescens billeder af det samme område inden forlys zone i en kimcenter mærket af CD21/35-Fab-ATTO590 som registreret af MB-SI-TPLSM (e) og konventionelle (PMT-baseret) TPLSM (f), hhv. Klik her for at se en større version af dette figur.

Film billedtekster

Movie-1 og -2

Dynamik i immunkompleksaflejringer på sekundære follikulære dendritiske celler (FDC) og deres interaktion med kimcenter B-celler, som er registreret af MB-SI-TPLSM. De immunkompleksaflejringer mærkes af CD21/35-Fab-ATTO590 (rød), mens kimcenter B-celler er B1-8 Jk ^{- / -} EGFP ⁺ celler (grøn).

Discussion

Formålet med intravital optisk billeddannelse er dynamisk og funktionelt visualisere cellulære motilitet og interaktioner for at forstå væv og organfunktion i sundhed og sygdom ^5. Den mest kraftfulde teknologi til at opnå dette, multi-foton laser-scanning mikroskopi, stadig at overvinde begrænsninger i relation til Bølgefrontkorrektionssystemer forvrængninger, spredning, langsom erhvervelse, fotoblegning og solskader, som begrænser dens rumlige opløsning, kontrast samt dens tid opløsning .

Der er to succesfulde løsninger for at opnå en bedre excitation (og emission) foton ledelse i dybtliggende væv fører til bedre rumlige resolutioner, øget kontrast (øget signal-til-støj-forhold, på grund af øget signal), og dermed reducerede fotoblegning og solskader : de adaptive-optik tilgange og brug af længere excitationsbølgelængder - afstemmelige infrarød excitation ^6. I det sidste årti, begrebet bølgefronten tilsvaIndsatsen ved adaptiv optik er blevet overført fra astronomi til bio-optisk billeddannelse og også til multi-foton mikroskopi. Mens den første adaptive optik tilgange til to-foton mikroskopi påberåbt bølgefront sensing og behov for en subdiffraction henvisning, dvs "vejledning stjerne", svarende til astronomi, nuværende systemer er bedre egnet til dyb-tissue imaging ^12. For eksempel bruger de sammenhængen-gating af excitationsstrålingen for bølgefront sensing ^13,15, eller at de ikke bruger nogen ekstern bølgefront sensing overhovedet, men udvikle tilpasnings algoritmer baseret enten på tværs af korrelation af billeder, efter elev segmentering ¹⁷ eller på iterativ stokastisk søgning af de ideelle parametre og efterfølgende indgreb i den ukorrigerede billede som stammer fra den tidligere iteration trin - IMPACT ^16, eller de bruger foto-akustik at karakterisere bølgefront forvridninger og spredningseffekter ^20. Stadig på grund af en stærkt varierende refraktiv indeks i væv, adaptive optik metoder er temmelig langsom, fordi trin korrektionen skal gentages for relativt små arealer (ca. 10 x 10 mM ^{2) 16.} Derudover enten ved bølgefront eller spredning effekt korrektion, den maksimalt opnåelige rumlige opløsning er stadig begrænset af diffraktion.

Vores tilgang er i stand til delvist at overvinde de byrder bølgefront aberration og spredning, men også skubber beslutningen ud over den diffraktion grænse. Brug objektivlinser med højere numeriske åbning, kan de absolutte værdier for aksial opløsning forbedres til omkring 400 nm ^20. Prisen for den forbedrede opløsning er en stejlere henfald af signal-til-støj-forholdet i dyb-væv i forhold til konventionel TPLSM. Dette skyldes, at det er nødvendigt at anvende påvisning felt i MB-SI-TPLSM. Som vist inden ¹⁵ er anvendelsen af marken detektorer i stedet for punkt detektorer forbundet med denne stejlere henfald af SNR due den stærkere spredning af udsendt lys, som kun er relevant for afsløring felt. Således den maksimale billedbehandling dybde for detektionsfelt TPLSM metoder er ca. Reduceret med 25% i forhold til konventionel (dvs. punkt påvisning baseret) TPLSM. En simpel praktisk løsning er at anvende længere excitationsbølgelængder og opdage længere emission bølgelængder. Naturligvis det forbedrer dybde afhængig SNR i konventionel TPLSM i samme omfang som i MB-SI-TPLSM.

For så vidt angår erhvervelse hastighed angår, er MB-SI-TPLSM kun begrænset af hastigheden af ​​galvanometrisk scanner og / eller ved udlæsning af kameraet og overskud af bjælken opsplitning til 32 laserstråle lader. I forhold til standard multi-beam kamera-baserede TPLSM, MB-SI-TPLSM er lidt langsommere på grund af behovet for ikke blot at scanne, men også til synkront erhverve hver på ca. 10 stribet belyste billeder til at generere det endelige billede med høj opløsning. Vores teknik bevarer dog en cløre hastighed fordel i forhold til konventionelle TPLSM (baseret på single-beam scanning og punkt detektion). Derfor købet tiden for en 150 x 150 mM ² (512 x 512 pixel) er 841 msek ved hjælp af konventionel TPLSM (scanner frekvens 800 Hz) og 109 msek hjælp MB-SI-TPLSM. Derved excitation effekt pr stråle og opholdstiden per pixel er de samme for både konventionelle og MB-SI TPLSM, så signalet er sammenlignelig for begge opsætninger. Som tidligere vist ^20, fotoblegning og solskader effekter i MB-SI-TPLSM eksperimenter er lav og kan sammenlignes med veludført konventionel TPLSM.

I fremtiden vil det være ønskeligt at kombinere de komplementære tilgange af adaptiv-optik og stribet-belysning i det infrarøde område for yderligere at forbedre intravital TPLSM, svarende til præstationerne i adaptive optik til struktureret-belysning ^21. For at nå disse mål, betydeligt hurtigere adaptive-optik tilgangeskal udvikles.

Den forventede stor gennemslagskraft af de stribede-belysning tilgang til biovidenskab og biomedicin ligger i dens evne til at forbedre opløsning og forbedre kontrasten i dybe væv, modvirke bølgefront forvrængning og spredning effekter, men også går ud over de diffraktion grænser i laser-scanning mikroskoper, ved blot at kontrollere scanningen og vælge en passende følsomme område detektor.

Den forventede stor gennemslagskraft af de stribede-belysning tilgang til biovidenskab og biomedicin ligger i dens kapacitet til at forbedre opløsning og forbedre kontrasten i dybe væv, modvirke bølgefront forvrængning og spredning effekter, men også går ud over de diffraktion grænser i laser-scanning mikroskoper, ved blot at kontrollere scanningen og vælge en passende følsomme område detektor.

Den stribede-belysning tilgang kan anvendes til intravital dybtliggende væv imaldring i alle to-foton laserscanningmikroskoper der er i stand til at synkronisere kamera detektion med galvoscanner bevægelse i single-beam scanning. I dette tilfælde er de enkelte striber i excitation mønster genereres efterfølgende og ikke samtidig som i MB-SI-TPLSM. Brug en enkelt stråle scanning i SI-TPLSM vi naturligvis forvente en lidt langsommere erhvervelse på fluorescens billeder sammenlignet med konventionel TPLSM (enkelt stråle scanning, punkt detektor-baserede TPLSM), men den samme forbedring i rumlig opløsning og kontrast som demonstreret for MB- SI-TPLSM. Den lavere erhvervelse hastighed sammen med begrænsningen i billedbehandling dybde reducerer anvendelsen vifte af single-beam SI-TPLSM i forhold til MB-SI-TPLSM.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATTO590 – NSH for coupling	ATTO Tec, Germany	AD-590-35
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590	DRFZ, Berlin		The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+	Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US		Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment	StemmCell Technologies, Germany	19854
Polystyren beads (605), 0.2 µm	Life Technologies, Germany	F8803
Equipment
TriMScope I	LaVision Biotec, Bielefeld, Germany
OPO (manual version)	APE, Berlin, Germany
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II	Coherent, Duisburg, Germany
Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm	Olympus Germany, Hamburg, Germany