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Immunology and Infection

कीटाणु केन्द्रों की अत्यधिक हल intravital धारीदार रोशनी माइक्रोस्कोपी

doi: 10.3791/51135 Published: April 9, 2014
* These authors contributed equally

Summary

वयस्क चूहों के लिम्फ नोड्स में 120 मीटर गहराई तक बढ़ाया विपरीत के साथ उच्च संकल्प intravital इमेजिंग स्थानिक एक बहु - फोकल दो photon माइक्रोस्कोप की उत्तेजना पैटर्न modulating द्वारा हासिल की है. 100 मीटर गहराई में हम इस तरह बिखरने और विवर्तन सीमा circumventing, 487 एनएम का संकल्प (पार्श्व) और 551 एनएम (अक्षीय) मापा.

Abstract

Intravital गहरे ऊतक बहु photon माइक्रोस्कोपी द्वारा सेलुलर संचार की निगरानी के लिए स्वास्थ्य और रोग में मोटी ऊतकों के नमूनों और अंगों के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के भाग्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. बहु photon माइक्रोस्कोपी में स्कैनिंग पैटर्न को नियंत्रित करने और उपयुक्त संख्यात्मक एल्गोरिदम को लागू करके, हम बेहतर अक्षीय संकल्प और अधिक से अधिक में सुधार के संकेत से शोर अनुपात, यानी इसके विपरीत, 3 गुना हासिल करने के लिए हमें सक्षम है, जो एक धारीदार रोशनी दृष्टिकोण विकसित मानक बहु photon माइक्रोस्कोपी की तुलना में अत्यधिक lymphoid अंगों के ऊतक बिखरने के भीतर 100 माइक्रोन ऊतक गहराई. इमेजिंग गहराई के कारण क्षेत्र का पता लगाने का उपयोग करने के लिए थोड़ा कम था जबकि अधिग्रहण की गति के साथ ही photobleaching और photodamage प्रभाव, मानक फोटो गुणक आधारित तकनीक के समान थे. धारीदार रोशनी दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम माध्यमिक कूपिक वृक्ष के समान कोशिकाओं पर प्रतिरक्षा जटिल जमा की गतिशीलता का पालन करने में सक्षम हैं ̵1; कीटाणु केन्द्रों में कुछ प्रोटीन अणुओं के स्तर पर.

Introduction

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दो photon लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (TPLSM), अवरक्त अति लघु स्पंदित उत्तेजना 1 से संबंधित गहरे ऊतक इमेजिंग के लिए अपने फायदे के साथ, विभिन्न की गतिशीलता और बातचीत के पैटर्न का खुलासा द्वारा एक एकल कोशिका स्तर पर महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं पर हमारे विचार क्रांति ला दी है जानवरों 2-5 जीने में सेल सबसेट. हालांकि, मौजूदा प्रौद्योगिकी यह स्वास्थ्य और रोग में ऊतकों के भीतर सेलुलर प्रतिक्रिया के आणविक आधार के बारे में केवल विरल जानकारी renders के बाद, नए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए एक शर्त के रूप में अंग समारोह और रोग के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए अभी भी अपर्याप्त है. वर्तमान प्रौद्योगिकी बिखरने की वजह से कुछ सौ माइक्रोन का केवल एक स्थानिक विंडो में सक्षम बनाता है और स्थानिक संकल्प और वयस्क पशुओं की अत्यधिक कॉम्पैक्ट ऊतक में विशेष रूप से स्पष्ट कर रहे हैं, जो संकेत करने वाली शोर अनुपात 6, पर सामने विरूपण प्रभाव लहर. ये बिखरने और लहर सामने विरूपण प्रभाव एक अत्यंत विषम एक की वजह से कर रहे हैं3 डी स्थानिक संकल्प की गहराई निर्भर गिरावट के लिए एक पहला कदम में प्रमुख ऊतक में अपवर्तनांक के डी anisotropic वितरण, और अंत में बैलिस्टिक उत्तेजना फोटॉनों, संकेत करने वाली शोर अनुपात यानी नुकसान से होने वाले संकेत के कुल नुकसान के लिए. Bioscientific और जैव चिकित्सा गहरी ऊतक अनुप्रयोगों के संदर्भ में, यह संकेत करने वाली शोर अनुपात की कमी प्रणाली कुछ अनदेखी करने के कारण होता है, जबकि गरीब संकल्प झूठा सकारात्मक बातचीत के लिए नेतृत्व करेंगे क्योंकि मौजूदा प्रौद्योगिकी स्पष्ट सेलुलर संचार प्रकट करने में असमर्थ है कि इसका मतलब है मंद संरचनाओं के बीच बातचीत.

स्पष्ट एक गतिशील रास्ते में सेलुलर बातचीत का पता लगाने के लिए आदेश में, एक अत्यधिक सुधार स्थानिक संकल्प गहरी ऊतक के भीतर की जरूरत है. जैसे विशेष संख्यात्मक एल्गोरिदम, पहली उत्साहित राज्य की कमी पर जैसे संरचना रोशनी दृष्टिकोण के आधार पर, वर्तमान में पेश शक्तिशाली nanoscopy तकनीक जैसे dSTORM, पाम, तय कोशिकाओं में साथ ही रहते सेल संस्कृतियों 7 में कई आवेदन मिल गया है. हालांकि, ऊतक वर्गों, रहने वाले ऊतक और जीवों के लिए इन आवेदनों का विस्तार करने के लिए हमें अभी भी गंभीर तकनीकी कठिनाइयों को दूर करने की जरूरत है. दो photon उत्तेजना अलग तरंग दैर्ध्य के साथ के साथ ही उत्तेजना के लिए एक एकल तरंगदैर्ध्य (sw2PE-STED) के साथ sted और उत्सर्जन उसी में क्रमश: एम्बेडेड कोशिकाओं 9, साथ मस्तिष्क स्लाइसें 8 में या कृत्रिम matrices में पार्श्व संकल्प में सुधार करने के लिए लागू किया गया है प्रेरित मानक TPLSM रूप अक्षीय संकल्प. एक फोटान STED का उपयोग करना, वृक्ष के समान spines की गतिशीलता 67 एनएम 10 के एक प्रस्ताव पर रहने वाले एक Thy1 EGFP माउस में मस्तिष्क प्रांतस्था (अप करने के लिए 10-15 माइक्रोन गहराई) की सतह पर imaged किया जा सकता है. विकास जीव विज्ञान के लिए एक बहुमुखी उपकरण दो गुना सुधार 2D प्रदान करता है जो Multifocal संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान की गई हैसंकल्प. हालांकि, इस तकनीक ही ऐसी ज़ेबरा मछली भ्रूण के रूप में 11 प्रकाश बिखरने का एक कम प्रवृत्ति के साथ जीवों में इस्तेमाल किया जा सकता है. फिर भी, इन तकनीकों में से कोई भी जन्म के बाद शुरू होने के साथ बीमारियों की जैव चिकित्सा और नैदानिक ​​अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण मॉडल हैं जो micrometers के कई सैकड़ों, में वयस्क पशुओं की अत्यधिक बिखरने के ऊतकों में लागू किया जा सकता है.

बात फैल समारोह (पीएसएफ) यानी, विवर्तन सीमित लहर सामने आकार की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया सन्निकटन के स्वतंत्र, एक लेंस के माध्यम से ध्यान केंद्रित करने के बाद, ऑप्टिकल अक्ष (अक्षीय संकल्प) के साथ पीएसएफ की चौड़ाई से कम से कम तीन गुना बड़ा है ऑप्टिकल अक्ष (पार्श्व संकल्प) 12 को सीधा पीएसएफ चौड़ाई. काफी विशेष रूप से ऑप्टिक साथ बहुत बड़ा PSFs, के लिए अग्रणी गहरे ऊतक इमेजिंग में केंद्रित विद्युत चुम्बकीय तरंग की लहर सामने आकार को संशोधित Zernike के गुणांक द्वारा मात्रा अलग आदेशों के सामने विकृतियों वेवअल 13-15 अक्ष. इसलिए, विवर्तन कानूनों और लहर सामने विरूपण प्रभाव दोनों गहरे ऊतक इमेजिंग में सीमित कारक के रूप में ऑप्टिकल अक्ष के साथ संकल्प को इंगित करें. Nanoscopy तकनीक विवर्तन की सीमाओं का प्रतिकार करने पर ध्यान केंद्रित जबकि केवल अक्षीय संकल्प और विवर्तन और लहर सामने विरूपण प्रभाव दोनों का प्रतिकार द्वारा इसके विपरीत में सुधार एक तकनीक है जो उच्च संकल्प intravital इमेजिंग के लिए आवश्यक है. आदर्श रूप में, इस तकनीक को काफी तेजी से सेलुलर गतिशीलता की निगरानी की अनुमति के लिए भी होना चाहिए.

पीएसएफ aberrations और TPLSM में अनुकूली प्रकाशिकी का उपयोग विपरीत नुकसान की वास्तविक समय सुधार बड़े पैमाने पर अध्ययन और पिछले एक दशक 13,14,16-18 में सुधार हुआ है और यह इसलिए बैलिस्टिक उत्तेजना का एक बेहतर प्रबंधन के लिए अग्रणी सबसे अच्छा वर्तमान में उपलब्ध विकल्प है किया गया है 14 photons. फिर भी, कारण अधिकांश सामने सुधार अनुकूली प्रकाशिकी में इस्तेमाल किया दृष्टिकोण लहर तथ्य यह है कि चलने और वे हा कि कर रहे हैंकारण ऊतकों में अपवर्तनांक के उच्च विविधता के छोटे क्षेत्रों के लिए (कुछ 10 x 10 माइक्रोन 2) दोहराया जा ve, अधिग्रहण गति इमेजिंग सेल गतिशीलता और संचार के लिए आवश्यकता से काफी कम है. इसके अलावा, अनुकूली प्रकाशिकी में शारीरिक सीमा TPLSM अभी भी विवर्तन द्वारा निर्धारित किया जाता है सुधार हुआ.

रोशनी (स्पिन) और पहचान पक्ष (कुदाल) पर अस्थायी मॉडुलन के स्थानिक मॉडुलन सैद्धांतिक रूप से संकल्प में सुधार करने के लिए लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के लिए लागू किए जाने का प्रस्ताव किया गया है. Intravital इमेजिंग में उनके व्यावहारिक आवेदन अभी भी 19 का प्रदर्शन किया जाना बना रहता है.

साथ में ले ली, वयस्क रहने वाले जानवरों में गहरे ऊतक इमेजिंग के लिए बेहतर समाधान जो प्रौद्योगिकियों के विकास के लिए एक उच्च मांग है. इस काम में, हम बहु - किरण धारीदार रोशनी बहु फोटॉन लेजर-S में स्कैनिंग की प्रक्रिया को नियंत्रित करने से उत्तेजना पैटर्न के स्थानिक मॉडुलन प्राप्तकैनिंग माइक्रोस्कोपी (MB-सी-MPLSM) 20. उत्तेजना किरण पार अनुभाग स्थानिक संग्राहक है जिसमें संरचित रोशनी दृष्टिकोण के विपरीत, हम उत्तेजना के स्थानिक मॉडुलन प्राप्त करने के लिए केवल स्कैनिंग प्रक्रिया का उपयोग करें. एक लंबे समय तक तरंगदैर्ध्य को उत्तेजना के विस्तार से, हम स्वतंत्र रूप से ऑप्टिकल की, अत्यधिक ऊतक (जैसे लिम्फ नोड, मुफ्त बिखरने पथ 47 माइक्रोन 6) बिखरने के गहरे ऊतकों में स्थानिक संकल्प और संकेत करने वाली शोर अनुपात दोनों में सुधार करने में सक्षम हैं हम पता लगाने के लिए गैर रेखीय संकेत, जैसे प्रतिदीप्ति, दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी या अन्य आवृत्ति घटना मिश्रण. 900 एनएम के लिए ऊपर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में इस दृष्टिकोण का उपयोग हम माउस लिम्फ नोड्स के कीटाणु केन्द्रों में कुछ अणुओं के पैमाने पर गतिशील रूप से छवि सेलुलर प्रोटीन संरचनाओं करने में सक्षम हैं. इस प्रकार, हम बेहतर विरोधी जांच की प्रक्रिया में कूपिक वृक्ष के समान कोशिकाओं और बी कोशिकाओं की सतह पर प्रतिजन ले जाने इकाइयों के बीच बातचीत कल्पना कर सकते हैंमाध्यमिक lymphoid अंगों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान जन.

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Protocol

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धारीदार रोशनी TPLSM के लिए बहु किरण सेटअप

यहां इस्तेमाल किया सेटअप पहले से 6,20 वर्णित के रूप में, एक विशेष बहु किरण दो photon लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन है. प्रणाली चित्रा 1 में सचित्र है. दृष्टिकोण वे एकल बीम स्कैनिंग प्रदर्शन करने के लिए ही सक्षम हैं, भले ही galvoscanner दर्पण के आंदोलन के साथ कैमरा अधिग्रहण सिंक्रनाइज़ करने में सक्षम हैं जो अन्य दो photon लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप, के लिए लागू किया जा सकता है . इस मामले में, नुकसान मानक पीएमटी आधारित TPLSM में अधिग्रहण की गति को हालांकि इसी तरह की एक निचली अधिग्रहण की गति, हो जाएगा. अब तक संकल्प और विपरीत संबंध है इष्टतम गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए, सबसे कम photobleaching और photodamage और सबसे तेजी से अधिग्रहण पर, यह सेटअप के निम्नलिखित समायोजन कदमों पर विचार करने के लिए recommendable है:

  1. Tisa लेजर की लेजर शक्ति की जाँच करें: मूल कारखाना मूल्यों और previo साथ तुलना, 100% से कम की जांचहमें रीडिंग के मालिक हैं और सीमा 700-1,000 एनएम में एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य आवश्यक है, तो यह है के रूप में इसका इस्तेमाल करते हैं.
  2. तिवारी के लिए रिमोट कंट्रोल के संकेत टेस्ट: सा बीम फाड़नेवाला, यानी 0% की जाँच करें और 100% सेटिंग्स. 100% पर एक शेष Tisa किरण, तो वहाँ की जांच और मोटर कदम अशक्त स्थिति रीसेट है. तिवारी: सा बीम फाड़नेवाला सीधा किरण पथ पर लंब के रूप में polarized लेजर बीम विभाजन जो एक कम आदेश λ / 2 थाली और एक polarizer, के होते हैं: एक उत्तेजना के लिए माइक्रोस्कोप में निर्देश दिया है, अन्य ऑप्टिकल पैरामीट्रिक पंप करने के लिए प्रयोग किया जाता है थरथरानवाला (OPO). स्वतः λ / 2 थाली, तिवारी की एक निरंतर समायोजन घूर्णन द्वारा: एसए और OPO बिजली, क्रमशः, हासिल की है.
  3. वांछित तरंग दैर्ध्य है OPO समायोजित और बिजली उत्पादन के उपाय. शक्ति बहुत कम है: पम्पिंग तरंगदैर्ध्य अनुकूलन और वीं की सेटिंग्स की जाँच (तिवारी डब्ल्यू एक 4 के साथ सा लेजर 800 एनएम पर, एक के आसपास 1,050-1,100 एनएम पर OPO किरण डब्ल्यू 0.8-1 प्राप्त करने में सक्षम होना चाहिए)ई दर्पण और हवा दे दी क्रिस्टल की. OPO वांछित तरंगदैर्ध्य उत्पादन में प्रतिध्वनित और शक्ति बढ़ जाती है जब तक उनकी सिफारिश इष्टतम चार्ट या रेखांकन के रूप में अक्सर उपलब्ध मूल्यों, और फिर ठीक धुन उन्हें चुनें.
    1. बिजली अभी भी कम है, तो चार सुलभ दर्पण समायोजन knobs के साथ OPO के दो सुलभ दर्पण समायोजित. बहुत धीरे धीरे और बहुत छोटे आंदोलनों में, आगे और अंत दर्पण के बीच बारी इस कदम है.
  4. एसए और / या OPO मुस्कराते हुए उचित, केंद्रीय स्थिति में प्रवेश दर्पण मारा: तिवारी कि जाँच करें.
    1. सा मुस्कराते हुए: श्वेत पत्र (! बहुत चमकदार या प्रतिबिंबित नहीं) का एक टुकड़ा और OPO किरण के अवलोकन के लिए एक अवरक्त दर्शक और उच्च तरंगदैर्ध्य तिवारी का प्रयोग करें.
      1. NIR तिवारी के साथ कार्य करते समय सुरक्षात्मक काले चश्मे पहनने: सा मुस्कराते हुए (आमतौर पर 720-750 एनएम अप करने के लिए औसत व्यक्ति के लिए दिख रहा है).
    2. एमआई के लिए इतनी के रूप में संरेखण प्रक्रिया के लिए जितना संभव हो कम लेजर पावर (ओं) सेटसंभावित आँख क्षति nimize.
    3. आंख की पुतली constricted इतना है कि हमेशा की तरह, पर कमरे के परिवेश रोशनी रखना.
    4. सा बीम स्कैन सिर में प्रवेश करती है: लेजर बिजली ठीक नियंत्रित तिवारी जब अभी तक प्रभाव में नहीं हैं जो एक λ / 2 थाली और polarizers, के बाहर मिलकर attenuators से है कि मन में रखो!
  5. प्रवेश बिंदु डायाफ्राम तिवारी ने बीच में मारा जाता है कि जांच: एसए और / या OPO किरण; यदि नहीं, तो लेजर बीम स्कैन सिर में प्रवेश करती है, इससे पहले पिछले दो दर्पण समायोजित.
    1. आईआर दर्शक और सफेद (चिंतनशील / लेकिन चमकदार नहीं!) कागज का एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग करें.
    2. लेजर बीम की स्थिति ज्यादा ठीक आंका जा सकता है कि तो हमेशा, माइक्रोस्कोप में प्रवेश पर डायाफ्राम बंद करें. महत्वपूर्ण: चरण 6 पर आगे बढ़ने से पहले डायाफ्राम फिर से खोलना मत भूलना!
  6. तदनुसार माइक्रोस्कोप में परिलक्षित लेजर बीम प्रकाश पथ को समायोजित करें. छोटे खंडों पर यह करने और चलने का बीम वा प्रदर्शनlking.
    1. उद्देश्य लेंस से प्रकाश उत्पादन पर्याप्त नहीं है अगर पूरे प्रकाश पथ की जाँच करें.
    2. एक लंबे समय से निष्क्रिय अवधि, एक प्रमुख मरम्मत, ऑप्टिकल तत्वों की किसी भी प्रतिस्थापन, के बाद से पहली बार के लिए इस प्रणाली का उपयोग करते समय हमेशा प्रकाश पथ की जाँच करें या समस्याओं उत्पादन के साथ करने के लिए मौजूद संदेह कर रहे हैं.
  7. वे धूल से मुक्त कर रहे हैं विशेष रूप से है कि, सभी सक्रिय ऑप्टिकल सतहों साफ कर रहे हैं सुनिश्चित करें! सतहों धूल की एक परत के साथ कवर कर रहे हैं, लहर सामने भी उद्देश्य लेंस प्रवेश करने से पहले विकृत है और जिसके परिणामस्वरूप लेजर बीम नमूने के एक तेज छवि देने के लिए कभी नहीं होगा!
    1. यदि आवश्यक हो, इथेनॉल या isopropanol साथ सिक्त लेंस कागज का एक मुड़ा हुआ टुकड़ा, साथ दर्पण साफ.
  8. किरण प्रकाश पथ सेट होने के बाद, चश्मे आधारित पल्स कंप्रेसर के अंत में सीधे प्रवेश दर्पण के ऊपर स्थित है कि दर्पण को वापस आता है कि जाँच करें. यहाँ से, किरण दिखाई देता है मैंकिरण बहुसंकेतक (बीएम) Nto.
  9. लेजर बीम एक व्यापक बैंड 50% पारेषण और 50% प्रतिबिंब के लिए आवश्यकताओं को फिट करने के लिए लेजर बीम का ध्रुवीकरण बदल रहा है, सीधे λ / 2 थाली से पहले, किरण बहुसंकेतक के प्रवेश द्वार पर स्थित है कि डायाफ्राम हिट अगर जाँचें बी.एम. के भीतर.
    1. पहली किरण स्थिति ज्यादा ठीक न्याय किया जा सकता है, ताकि डायाफ्राम बंद और बीएम प्रविष्टि में माइक्रोस्कोप और दूसरे में प्रवेश पर एक यानी, दो diaphragms के बीच किरण पैदल प्रदर्शन करते हैं. अन्य एकल बीम स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के लिए डायाफ्राम XY-स्कैनर में प्रवेश पर स्थित होना चाहिए.
    2. किरण बंद नीचे एपर्चर के केंद्र हिट नहीं करता है, बी.एम. प्रवेश डायाफ्राम से पहले सीधे रखा, उपर्युक्त दर्पण समायोजित. महत्वपूर्ण: 10 कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले डायाफ्राम फिर से खोलना मत भूलना.
  10. डायाफ्राम फिर से खोल के साथ लेजर बीम बीएम दर्पण में हिट, तो जाँचउनके बीच सूत्री. बी.एम. जटिल प्रकाश पथ के दूसरे हिस्से को ब्लॉक करने के लिए तो नहीं के रूप में कागज के एक संकरी पट्टी का प्रयोग करें!
  11. समानांतर ध्रुवीकरण के लिए शीर्ष दर्पण 'पी', सीधा ध्रुवीकरण 'एस' के लिए नीचे दर्पण: किरण बाहर निकलें दर्पण के बीच हिट है की जाँच करें. यदि नहीं, बी.एम. से पहले प्रवेश दर्पण समायोजित.
  12. "एस" और "पी" ध्रुवीकृत किरण समूहों polarizer घन भर XY-स्कैनर में प्रवेश पर उचित रूप से ओवरलैप देता है की जाँच करें. मामले में इन चरणों का एक भी किरण स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जाता है करें.
  13. लेजर प्रकाश केंद्रीय स्कैन और ट्यूब लेंस गुजरता है और उद्देश्य लेंस 'वापस फोकल हवाई जहाज़ के बीच के माध्यम से हो जाता है तो चेक करें. महत्वपूर्ण: इस कदम नहीं एक पार्किंग स्थिति में, केंद्र की स्थिति में लेजर बीम के साथ किया जा सकता है!
    1. एक लक्ष्य उपकरण ("सांड की आंख") के साथ उद्देश्य लेंस की जगह और लेजर बीम बीच में लक्ष्य हिट अगर जाँच, और चाहेरोशनी भी है.
    2. इस मामले में हो रहा है, बी.एम. पहले एपर्चर नीचे बंद करें और एक परिपत्र हस्तक्षेप पैटर्न दिखाई देता है अगर मध्य (हस्तक्षेप न्यूनतम) में एक काले वृत्त के साथ, की जाँच करें.
      1. सांड की आंख के केंद्र के सापेक्ष एक महत्वपूर्ण बदलाव है अगर प्रविष्टि दर्पण समायोजित करें.
  14. अब एक 20x पानी विसर्जन लेंस के साथ उदाहरण के लिए एक उद्देश्य लेंस, साथ सांड की आंख की जगह.
    1. सफेद कागज के एक टुकड़े के साथ उत्पादन प्रकाश क्षेत्र की जाँच करें. यह उज्ज्वल वर्दी और केन्द्र तैनात किया जाना चाहिए.
    2. बिजली उत्पादन के उपाय: 100% तिवारी पंप के साथ 100% OPO में: सा (4 प.), एक लगभग मिलना चाहिए. (यहां इस्तेमाल माइक्रोस्कोप में) 1,100 एनएम पर लेंस के बाद 100-150 मेगावाट. लोअर लेजर शक्तियों बहु किरण सी-TPLSM प्रदर्शन के लिए पर्याप्त नहीं होगा. एकल बीम स्कैनिंग सी-TPLSM के लिए, 5-10 मेगावाट पर्याप्त हैं. लेजर बीम scanne होने के बिना केंद्र की स्थिति में रहना चाहिएडी!
  15. MB-सी-TPLSM प्रदर्शन, तो आप निम्नानुसार बी.एम. में दर्पण संरेखण:
    1. मंच पर एक homogenously fluorescing नमूना, जैसे एक लाल प्रतिदीप्ति स्लाइड, स्थान और नमूना अंदर लेकिन (ऑब्जेक्टिव लेंस 'सामने यानी करीब) ऊपर की सतह के पास लेजर बीम ध्यान केंद्रित.
    2. बहु - किरण मोड के लिए माइक्रोस्कोप सेट और शुरुआत में मुस्कराते हुए की संख्या, अधिमानतः केवल एक बीम, और ध्रुवीकरण, उदाहरण के लिए "पी" का चयन करें.
      1. फ्लोरोसेंट स्लाइड इमेजिंग द्वारा लेजर बीम का पता: खुला "पी" शटर सेट और बीम ध्यान केंद्रित whilst के लगातार सीसीडी कैमरा चलाते हैं.
      2. किरण केंद्र की स्थिति में है, और स्कैनर बंद है कि सुनिश्चित करें. किरण स्कैन नहीं है सुनिश्चित करें!
      3. कैमरा चिप के केन्द्र के निकट एक उज्ज्वल स्थान की तलाश द्वारा किरण का पता लगाएं.
      4. मौके छवि विमान की यानी, प्रतिभाशाली और सबसे अधिक है जब तक बीम ध्यानमाइक्रोस्कोप कैमरा चिप की स्थिति से मेल खाती है; मौके संतृप्त नहीं है कि इतनी लेजर शक्ति कम होती है. एक अच्छी तरह से गठबंधन प्रणाली के साथ इस लेजर शक्ति एक बीम मोड (करीब 0.6 मेगावाट लेजर शक्ति से काम करना चाहिए) में कार्य करते समय पास न्यूनतम हो गया है कि इसका मतलब है.
      5. मौके केन्द्र बंद काफी है, तो सामने बी.एम. (या एकल बीम स्कैनिंग के लिए स्कैनर का) दर्पण समायोजन करके करीब केन्द्र के लिए यह कदम.
      6. इसके अलावा, यानी 'एस' किरण अन्य ध्रुवीकरण aligning करते हैं, तो अब, 2 बीम मोड में स्विच "एस" शटर खुला है और केवल "एस" शटर खुला है, तो (केवल एक किरण को देखा जा सकता है बीम की स्थिति की जांच ).
      7. जब किया, 4-किरण मोड में स्विच और "पी" ध्रुवीकरण मोड ("पी" शटर खुला) का उपयोग करें. अब दो beamlets दिखाई देगा.
      8. दो beamlets पूरी तरह से कैमरे के दृष्टिकोण के नीचे बढ़त के समानांतर, और अलग 2.8 माइक्रोन होना करने के लिए उन्हें निर्धारित किए जाने की व्यवस्था करो.
          वे ठीक से गठबंधन नहीं कर रहे हैं, बी.एम. के पहले दर्पण समायोजित.
        1. दो मुस्कराते हुए उम अलग और पूरी तरह से क्षैतिज रूप से व्यवस्थित 2.8 जब तक बजाय दर्पण ले जाने के लिए दो परिधीय शिकंजा उपयोग, बीच में पेंच संरेखित कभी.
      9. अब 'पी' ध्रुवीकरण में 8 बीम मोड में स्विच, और 4 beamlets 2.8 उम में समान दूरी पर हैं, और छवि के नीचे बढ़त के समानांतर व्यवस्था कर रहे हैं जब तक दूसरा बीएम दर्पण (भी लाल बिंदी के बिना) को समायोजित.
      10. क्रमशः, और 32 बीम मोड, 3 और 4 बी एस दर्पण एडजस्ट - 16 में दोहराएँ. एसआई एल्गोरिदम, सरलतम मिनट मैक्स (HiLo) एल्गोरिथ्म किया जा रहा है, इस धारणा पर आधारित हैं क्योंकि beamlets समान दूरी पर होने के लिए यह महत्वपूर्ण है.
  16. एक विभिन्नतापूर्वक संरचित एक, जैसे पार से सना हुआ Convallaria जड़ों के साथ समान रूप से फ्लोरोसेंट नमूना बदलें.
    1. डब्ल्यू, उत्तेजना बीम की पार्किंग स्थिति में जानाhich आमतौर पर स्कैनर निर्देशांक, जैसे (; 10,000 10,000) की बड़ी मूल्यों पर रखा गया है.
    2. सीसीडी कैमरे के साथ एक बहु (बीम) छवि स्कैन. छवि, तेज वर्दी, और सीधे प्रतीत होता है कि जाँच करें.
    3. छवि घुमाया प्रकट होता है कैमरे को समायोजित: छवि सीधा होने तक (! कोमल हो) हाथ से अक्षीय ऊर्ध्वाधर अक्ष के चारों ओर कैमरा शरीर मोड़.
  17. उत्तेजना पैटर्न, यानी धारीदार छवि उत्पन्न करने के लिए स्कैनिंग की प्रक्रिया को नियंत्रित करने के क्रम में XY-स्कैनर प्रारंभ करें.
    1. बहु - किरण स्कैनिंग के मामले में, यानी, Y-स्कैनर दर्पण चाल है. एक द्विघात धारीदार छवि उत्पन्न करने के लिए इस तरह से beamlet लाइन, सीधा करने के लिए.
    2. कदम 17.1 में वर्णित के रूप में देखने के क्षेत्र उत्पन्न हैं. बीम चलो लाइन दोगुनी और beamlets पूरी लाइन के साथ समान दूरी पर हैं सुनिश्चित करना है कि एक स्थिति के लिए X-स्कैनर दर्पण ले जाकर स्कैनिंग दिनचर्या का विस्तार, बहुत छोटा है. सटीक आंदोलन को दोहराएँX-स्कैनर दर्पण बड़ा धारीदार छवि उत्पन्न करने के लिए ले जाया जाता है Y-स्कैनर दर्पण के बाद.
    3. वांछित धारीदार छवि उत्पन्न करने के लिए - वैज्ञानिक द्वारा परिभाषित - एकल बीम स्कैनिंग के मामले में समान दूरी पदों पर बार बार एक्स स्कैनर दर्पण आंदोलन के साथ Y-स्कैनर दर्पण आंदोलन वैकल्पिक.
    4. निरंतर गति (कम त्वरण / मंदी) के लिए Y-स्कैनर दर्पण एक आदेश के आंदोलन के लिए और अधिकतम गति (अधिकतम त्वरण / मंदी) में एक्स स्कैनर दर्पण एक के लिए उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें.
  18. स्वचालित रूप से अधिग्रहण और कैमरा (क्षेत्र डिटेक्टर) के साथ धारीदार छवि बचाने के लिए. इसलिए, स्कैनर के साथ कैमरा सिंक्रनाइज़ और मास्टर ट्रिगर के रूप में स्कैनर का उपयोग करें.
  19. धारीदार छवियों को प्राप्त करने दोहराएँ रूप में इस प्रकार विभिन्न पदों पर एक्स स्कैनर दर्पण ले जाकर (प्रोटोकॉल 17 में वर्णित स्कैनिंग प्रोटोकॉल):
    1. पर्याप्त पुनरावृत्ति कदम और बीच में उचित कदम लंबाई चुनेंलगातार दो beamlets (इस मामले में 2.8 माइक्रोन और स्कैनर दर्पण के एक कदम और 25 एनएम के बराबर होती है) के बीच की दूरी को कवर करने के लिए दो बाद धारीदार छवियों; यह एक छोटे से ओवरलैप अनुमति देने के लिए उचित हो सकता है, एक अतिरिक्त 0.3-0.4 माइक्रोन यानी.
    2. दी तरंग दैर्ध्य में पार्श्व संकल्प सीमा मैच एक मूल्य के लिए एक्स पारी सेट करें. एक उदाहरण के रूप में पारी और 12 या 13 पारियों प्रति एक्स स्कैनर दर्पण के 10 चरणों के प्रयोग का नेतृत्व करने के लिए सबसे अच्छा अक्षीय और इस प्रणाली में पार्श्व संकल्प परिणाम दोनों. नंबरों का इस्तेमाल किया जा रहा है प्रणाली में सबसे अच्छा काम है, जो एक संरचित स्लाइड, जैसे Convallaria जड़ों स्लाइड, के साथ की जाँच करें.
    3. Convallaria छवि तीव्र हो जाता है जब तक इन दो मूल्यों का अनुकूलन: परिकलित एसआई छवियों पर लाइन प्रोफाइल उपकरण का उपयोग और रेखा प्रोफाइल (Convallaria सेल दीवारों से प्रतिदीप्ति संकेत है) की चौड़ाई की तुलना करें.
    4. स्कैनर आंदोलन के साथ सिंक्रनाइज़ प्रत्येक धारीदार छवि मोल और इसे अलग से बचाने के लिए, जैसे
  20. मूल्यांकन दिनचर्या में matrices, यानी 3 डी मैट्रिक्स, के रूप में धारीदार छवियों का एक पूरा सेट खोलें और उच्च संकल्प एसआई छवि का एक 2D मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए न्यूनतम अधिकतम एल्गोरिथ्म या एक फूरियर बदलने कलन विधि का उपयोग करें. एल्गोरिदम पहले से विस्तार 20 में वर्णित किया गया.

Intravital इमेजिंग के लिए चूहों टीकाकरण और तैयारी

पशु प्रयोगों पशु कल्याण (LAGeSo, Landesamt फर Gesundheit und Soziales, बर्लिन) के लिए उपयुक्त राज्य समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया और वर्तमान दिशा निर्देशों और नियमों (पशु प्रयोग लाइसेंस G0153/08) के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.

  1. 4 से पहले वर्णित के रूप में घुटने की चक्की लिम्फ नोड और इमेजिंग क्षेत्र की तैयारी में एक कीटाणु केंद्र प्रतिक्रिया की प्रेरण प्रदर्शन किया गया था. Immunomagnetically की spleens से बी कोशिकाओं को शुद्ध B1-8 + + /- / -और बी 1-8 + + / Jκ के बी कोशिकाओं - / - + GFP चूहों.
  2. / - + / - + Jκ ⅛ B1-8 का उपयोग> 95% की शुद्धता के साथ नसों 3 एक्स 10 6 एनपी विशिष्ट बी कोशिकाओं इंजेक्षन + GFP और ⅞ nonfluorescent बी 1-8 + + /- / - C57BL / 6 प्राप्तकर्ताओं में .
  3. सेल हस्तांतरण के एक दिन बाद एनपी CGG सही हिंद भोजन पैड में पूरी Freund के सहायक (सीएफए) में emulsified (nitrophenyl-चिकन ɣ ग्लोब्युलिन) की 10 ग्राम के साथ प्राप्तकर्ताओं छुटकारा.
  4. ATTO590-succinimidyl एस्टर साथ anti-CD21/CD35 एंटीबॉडी का लेबल फैब टुकड़े.
    1. Vivo में कीटाणु केंद्र के भीतर कूपिक वृक्ष के समान कोशिकाओं के नेटवर्क (एफडीसी) को उजागर intravital विश्लेषण किया जाता है इससे पहले चूहों 12-24 घंटे की सही हिंद लुटेरा में fluorochrome लेबल फैब टुकड़े की 10 ग्राम इंजेक्षन.

निम्नलिखित कदम conside होना चाहिएintravital इमेजिंग के लिए घुटने की चक्की लिम्फ नोड (सुबह 8-10 टीकाकरण के बाद) की तैयारी के लिए लाल:

  1. Ketamine / xylazine के आईपी इंजेक्शन, उनके वजन के आधार पर राशि द्वारा माउस anesthetize.
  2. पूरे इमेजिंग अवधि में संज्ञाहरण की गहराई पर नजर रखने के लिए सजगता का परीक्षण करें.
  3. वापस पैर, और कठोर माउस का सही दिशा दाढ़ी और पूरी तरह से अवशिष्ट बालों को हटाने के लिए depilating क्रीम का उपयोग करें.
  4. प्रमुख सही शिखरक फिक्स: उंगलियों के साथ बोनी चिप का पता लगाने, एक छोटे सफेद त्रिकोण के आकार का प्रावरणी प्रकट होता है जब तक कैंची के साथ एक छोटा सा चीरा त्वचा की स्थापना की.
  5. Restrainer की उठाई चिमटी के साथ इस प्रावरणी के नीचे बोनी चिप दबाना.
  6. दांतेदार चिमटी का उपयोग काठ का क्षेत्र में रीढ़ की हड्डी को ठीक करें.
  7. Restrainer पर सही हिंद पैर फिक्स और पेंच कस लें.
  8. सही स्थिति में पैर रखने के लिए टेप पूंछ.
  9. जांघ की दुम पक्ष में, क्षेत्र में जहां प्रमुख घुटने की चक्की नस ente में, त्वचा में एक चीरा बनानेरुपये ऊतक, कुंद चिमटी के साथ अंतर्निहित ऊतक से त्वचा को अलग और बाहर करने के लिए समीपस्थ से घुटने की चक्की नस का पालन करें.
  10. कुंद चिमटी का उपयोग कर लिम्फ नोड बेनकाब, (प्रकाश में लाने के दौरान पीबीएस में लिम्फ नोड रखने के लिए) ठीक लसीका वाहिकाओं की रक्षा करने के लिए आदेश में कटौती से बचने का प्रयास करें.
  11. लिम्फ नोड के आसपास वैक्यूम तेल का एक चक्र बनाने, पीबीएस के साथ इस पोखर भरें.
  12. अपनी स्थिति में कवर पर्ची रखो और थर्मामीटर जांच (अन्यथा सेल वेग नाटकीय रूप से अलग अलग होंगे, 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर रखना) रखें.
  13. कवर पर्ची के ऊपरी बढ़त के साथ वैक्यूम तेल का एक चक्र जोड़ें.
  14. , वैक्यूम तेल पर अपनी स्थिति में हीटिंग का तार डाल के रूप में पहले एक समान फैशन में एक मुहर बनाने और उद्देश्य में डुबकी गिलास को कवर पर्ची पर पानी / पीबीएस जोड़ने.
  15. एक घातक खुराक के लिए ketamine / xylazine की खुराक में वृद्धि करते हुए इमेजिंग के बाद, माउस ग्रीवा अव्यवस्था के बाद, संज्ञाहरण में रखा जाता है.

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Representative Results

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लिम्फ नोड्स में स्थानिक संकल्प

प्रभावी बात फैल समारोह (ePSF) के आयाम एक माइक्रोस्कोप 12 के स्थानिक संकल्प के अनुरूप हैं. हम (सीसीडी कैमरों के माध्यम से) की स्थापना की दो photon माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर तकनीक, यानी क्षेत्र का पता लगाने TPLSM की तुलना में हमारे MB-सी-TPLSM द्वारा लिम्फ नोड्स में कोलेजन फाइबर का दूसरा harmonics पीढ़ी संकेत प्राप्त करके इस तीन आयामी समारोह मापा और बिंदु का पता लगाने TPLSM (PMTs के माध्यम से).

इन मापों से यह नमूना की सतह पर, दोनों पार्श्व और अक्षीय प्रस्तावों विवर्तन सिद्धांत 20 ने भविष्यवाणी की उम्मीद मूल्यों के अनुरूप है कि स्पष्ट हो जाता है. हालांकि, बढ़ती इमेजिंग गहराई के साथ है और इस प्रकार अत्यधिक अलग अपवर्तक सूचकांक के साथ मीडिया के माध्यम से उत्तेजना और उत्सर्जन विकिरण दोनों की ऑप्टिकल पथ में वृद्धि के साथ, स्थानिक संकल्प स्वतंत्र, काफी कमजोर होती जाती हैpendently कार्यरत सेटअप की (चित्रा 2). MB-सी-TPLSM से हम स्वतंत्र रूप से इमेजिंग गहराई से, एक लगभग पहुंच गया. 20% बेहतर पार्श्व संकल्प और मानक TPLSM दृष्टिकोण की तुलना में एक 220% बेहतर अक्षीय संकल्प.

कीटाणु केन्द्रों में कूपिक वृक्ष के समान कोशिकाओं पर प्रतिरक्षा परिसरों की गतिशीलता

प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान बी कोशिकाओं का प्रतिरूप चयन, वयस्क चूहों के माध्यमिक lymphoid अंगों के भीतर स्मृति बी कोशिकाओं या प्लाज्मा कोशिकाओं 4 में अंतर करने के लिए अपने रास्ते पर पहला कदम है. इस प्रक्रिया में, कीटाणु केन्द्रों के भीतर प्रतिरक्षा जटिल संरचनाओं (कुछ प्रोटीन अणुओं के समूहों) के स्तर पर कूपिक वृक्ष के समान कोशिकाओं (एफडीसी) और बी कोशिकाओं के बीच अत्यधिक गतिशील बातचीत एक केंद्रीय भूमिका निभा माना जाता है. केवल एक अत्यधिक हल करने intravital माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकी का उपयोग करके यह इस सेलुलर संचार और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए इसके निहितार्थ टुकड़े करना संभव है. एम के हमारे दृष्टिकोणबी सी-TPLSM पहली बार में 120 मीटर गहराई में, कूपिक वृक्ष के समान कोशिकाओं पर anti-CD21/35-Fab-ATTO590 द्वारा लेबल के रूप में intravitally प्रतिरक्षा जटिल जमा के समूहों के आयामों visualizing और बढ़ाता करने की संभावना के लिए प्रदान करता है घुटने की चक्की लिम्फ नोड्स (आंकड़े 3 ए और 3 बी) के कीटाणु केन्द्रों. ऐसी संरचनाओं मानक TPLSM दृष्टिकोण से दिखाई नहीं कर रहे हैं, हम उन्हें व्यक्तिगत रूप से पहचान करने और यहां तक कि हमारे दृष्टिकोण का उपयोग कर उनकी गतिशीलता कल्पना. आंकड़े 3E और इस अंतर्दृष्टि का समर्थन 3F, एक कीटाणु केंद्र में प्रतिरक्षा सेल जमा की 3 डी प्रतिदीप्ति छवि के बीच सीधी तुलना दिखा सकता है पारंपरिक TPLSM ने अधिग्रहण के रूप में (पीएमटी आधारित) और MB-सी-TPLSM. इसके अलावा, कीटाणु केंद्र बी कोशिकाओं के साथ प्रतिरक्षा जटिल जमा की बातचीत अत्यधिक (आंकड़े -3 सी और 3 डी, सिनेमा 1 और 2) हल किया जा सकता है और अब मैं हो सकता हैप्रसार, भेदभाव या apoptosis के लिए intravital कार्यात्मक जांच के साथ संयोजन में nvestigated. एक अगले चरण में, हम भी माध्यमिक lymphoid अंगों में बी सेल प्रतिरूप चयन के लिए दूसरे निर्णायक घटना का गठन करने के लिए विश्वास टी सहायक कोशिकाओं, साथ कीटाणु बी कोशिकाओं के गतिशील संचार की जांच करने के लिए हमारे दृष्टिकोण का उपयोग करेगा.

चित्रा 1
.. एक tunable FS स्पंदित तिवारी की चित्रा 1 सिद्धांत और बहु - किरण धारीदार रोशनी दो photon लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन के सेटअप किरण: सा लेजर (तरंगदैर्ध्य रेंज 690-1,080 एनएम, 140 FSEC, 80 मेगाहर्ट्ज) तनु है एक λ / 2 थाली और एक पतली फिल्म polarizer का बना एक मॉड्यूल द्वारा अपने दालों एक चश्मे आधारित GVD मुआवजा मॉड्यूल में precompressed कर रहे हैं और अंत में विभाजित 2, 4, 8, 16, 32, या 64 मुस्कराते हुए,एक beamlet लाइन बनाने. रेखा के भीतर लगातार दो beamlets (beamlet लाइन में लाल और हरे रंग का लेबल) सीधा polarizations है और हस्तक्षेप से बचने के लिए समय में स्थानांतरित कर रहे हैं. लगातार दो beamlets के बीच समय पाली 3 psec के बराबर है. एक अच्छी तरह से परिभाषित आवधिक पैटर्न उत्पन्न होता है कि इतना छवि अधिग्रहण के लिए, beamlet लाइन, एक उद्देश्य लेंस (20x पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस, एनए 0.95, WD 2 मिमी) द्वारा नमूना में केंद्रित है और लंब के रूप में स्कैन किया जाता है. यह पैटर्न beamlet रेखा के साथ अनुवाद किया है. छवियों की श्रृंखला में इस तरह से अंत में एक न्यूनतम अधिकतम एल्गोरिथ्म द्वारा मूल्यांकन एक EM सीसीडी कैमरा और से एक फिल्टर पहिया पर घुड़सवार हस्तक्षेप फिल्टर के माध्यम से पता चला रहे हैं उत्पन्न. पीएमटी का पता लगाने पर आधारित एकल बीम TPLSM एक ही माइक्रोस्कोप के साथ प्रदर्शन किया गया था. इस मामले में, हम नमूना स्कैन करने के लिए केवल एक लेजर बीम का इस्तेमाल किया, और हम प्रेतसंबंधी इसी dichroic दर्पण और हस्तक्षेप फिल्टर से पहले का पता लगाने के साथ प्रतिदीप्ति संकेत संकल्प लियाphotomultiplier ट्यूब के साथ यह आईएनजी. वैकल्पिक रूप से, बजाय तिवारी की. सा लेजर बीम, एक ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला की किरण लंबी तरंग दैर्ध्य MB-सी-TPLSM प्रदर्शन करने के लिए खुर्दबीन के लिए युग्मित किया जा सकता है इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
मानक पीएमटी आधारित और Multifocal सीसीडी आधारित TPLSM की तुलना में बहु - किरण धारीदार रोशनी TPLSM की चित्रा 2. स्थानिक संकल्प. (एक) प्रतिनिधि अक्षीय प्रोफाइल के रूप में अच्छी तरह से XY और लसीका के भीतर 100 मीटर गहराई में कोलेजन फाइबर में स्वयं सहायता समूह की xz अनुमानों नोड. lexc = 900 एनएम, पता लगाने के तरंग दैर्ध्य 447 ± 30 एनएम, फोटॉन प्रवाह Φ = 4.75 x 10 के लिए रेंज 2 सेमी · सेकंड. (ख) MB-सी-TPLSM और पारंपरिक TPLSM (एस.बी. पी एम टी) द्वारा दर्ज की गई के रूप में agarose में एम्बेडेड पीले, हरे fluorescing मोती. λ exc = 850 एनएम, पता लगाने के तरंग दैर्ध्य 525 ± 25 एनएम, फोटॉन प्रवाह Φ = 2.08 x 10 29 फोटोन / 2 सेमी · सेकंड, जाल इकाई = रेंज 3.7 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3 MB-सी-TPLSM से कीटाणु केन्द्रों की intravital इमेजिंग haptene साथ प्रतिरक्षित एक माउस में CD21/35-Fab-ATTO590 (लाल) द्वारा लेबल एक कीटाणु केंद्र के प्रकाश क्षेत्र के (एक) 3 डी प्रतिदीप्ति छवि -.. चिकन γ जीएलobulin (एनपी CGG) बी 1-8 EGFP + बी कोशिकाओं (हरा) के दत्तक हस्तांतरण के बाद. कूपिक वृक्ष के समान कोशिकाओं (एफडीसी) पर प्रतिरक्षा जटिल जमा (CD21/35 लेबलिंग) ज़ूम में (बी) छवि (क) में मनाया के रूप में, व्यक्तिगत रूप से कल्पना की है, और में (पार्श्व और अक्षीय दोनों) आयाम किया जा सकता है अप करने के लिए 120 मीटर गहराई में 400-800 एनएम की सीमा होती है. प्रतिरक्षित बी 1-8 EGFP + माउस में कीटाणु केंद्र बी कोशिकाओं (सी), प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की परिपक्वता के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार संपर्कों (डी), whilst अब भी देखे जा सकते हैं पता चला रहे हैं. λ exc = 850 एनएम, पता लगाने के तरंग दैर्ध्य 605 ± 20 एनएम (ATTO590) और 525 ± 25 एनएम (EGFP), फोटॉन प्रवाह Φ = 7.05 x 10 28 फोटोन / 2 सेमी · सेकंड लेकर. स्केल बार (एक) 20 माइक्रोन, (ख) 10 माइक्रोन, (ग) 30 माइक्रोन, (घ) 10 माइक्रोन. भीतर ही क्षेत्र की 3 डी प्रतिदीप्ति छवियोंMB-सी-TPLSM (ई) और पारंपरिक (पीएमटी आधारित) TPLSM द्वारा दर्ज CD21/35-Fab-ATTO590 द्वारा लेबल एक कीटाणु केंद्र के प्रकाश क्षेत्र (एफ), क्रमशः. इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें चित्रा.

मूवी कैप्शन

मूवी -1 और -2

प्रतिरक्षा जटिल माध्यमिक कूपिक वृक्ष के समान कोशिकाओं पर जमा (एफडीसी) और कीटाणु केंद्र बी कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत MB-सी-TPLSM द्वारा दर्ज की गतिशीलता. - / - EGFP + कोशिकाओं (हरा) कीटाणु केंद्र बी कोशिकाओं बी 1-8 जे हैं जबकि प्रतिरक्षा जटिल जमा CD21/35-Fab-ATTO590 (लाल) द्वारा चिह्नित कर रहे हैं.

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Discussion

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intravital ऑप्टिकल इमेजिंग के उद्देश्य को गतिशील और कार्यात्मक ऊतक और स्वास्थ्य और रोग 5 में अंग समारोह को समझने के क्रम में सेलुलर गतिशीलता और बातचीत करने के लिए कल्पना है. यह बहु फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी प्राप्त करने के लिए सबसे शक्तिशाली प्रौद्योगिकी, अभी भी अपने स्थानिक संकल्प सीमा जो सामने विकृतियों, बिखरने, धीमी अधिग्रहण, photobleaching और photodamage, लहर से संबंधित सीमाओं को पार विपरीत के रूप में अच्छी तरह से अपने समय के संकल्प करने के लिए है .

दो सफल एक बेहतर उत्तेजना को प्राप्त करने के लिए समाधान (और उत्सर्जन) गहरे ऊतक बेहतर स्थानिक संकल्प के लिए अग्रणी, विपरीत वृद्धि (वृद्धि की वजह से संकेत के लिए बढ़ा संकेत करने वाली शोर अनुपात,) और, इस प्रकार, कम photobleaching और photodamage में फोटोन प्रबंधन कर रहे हैं : अनुकूली प्रकाशिकी दृष्टिकोण और लंबे समय तक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग - ट्यून करने योग्य अवरक्त उत्तेजना 6. पिछले दशक में, लहर सामने Corre की अवधारणाअनुकूली प्रकाशिकी द्वारा ction बहु photon माइक्रोस्कोपी को भी जैव ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए खगोल विज्ञान से स्थानांतरित कर दिया गया है. पहले अनुकूली प्रकाशिकी लहर सामने संवेदन पर भरोसा किया और खगोल विज्ञान के लिए इसी तरह की एक subdiffraction संदर्भ, यानी एक 'गाइड स्टार' की जरूरत है, दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए दृष्टिकोण, वहीं मौजूदा सिस्टम गहरे ऊतक इमेजिंग 12 के लिए बेहतर हैं. उदाहरण के लिए, वे 13,15 संवेदन लहर सामने के लिए उत्तेजना विकिरण का जुटना-gating का उपयोग करें, या एक छात्र 17 विभाजन या बाद वे सब पर किसी भी बाहरी लहर सामने संवेदन उपयोग करें, लेकिन या तो छवियों के पार से संबंध पर आधारित रूपांतरण एल्गोरिदम का विकास नहीं IMPACT 16, या वे लहर सामने विकृतियों और बिखरने प्रभाव 20 चिह्नित करने के लिए तस्वीर ध्वनिकी उपयोग - आदर्श मानकों और uncorrected छवि के साथ बाद में हस्तक्षेप पिछले चलना कदम से प्राप्त के रूप में की पुनरावृत्ति स्टोकेस्टिक खोज. फिर भी, एक बेहद अलग refr के कारणसुधार कदम अपेक्षाकृत छोटे क्षेत्रों के लिए दोहराया जाना है के बाद से ऊतक में सक्रिय सूचकांक, अनुकूली प्रकाशिकी दृष्टिकोण, (लगभग 10 x 10 माइक्रोन 2) 16 के बजाय धीमी गति से कर रहे हैं. साथ ही, या तो लहर सामने या बिखरने प्रभाव सुधार करके, अधिकतम प्राप्त स्थानिक संकल्प अभी भी विवर्तन द्वारा सीमित है.

हमारा दृष्टिकोण आंशिक रूप से लहर सामने विपथन और बिखरने के बोझ से उबरने में सक्षम है, लेकिन यह भी विवर्तन सीमा से परे संकल्प धक्का. उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ उद्देश्य लेंस का प्रयोग, अक्षीय संकल्प के लिए निरपेक्ष मूल्यों के आसपास 400 एनएम 20 को सुधार हो सकता है. पारंपरिक TPLSM की तुलना में सुधार के प्रस्ताव के लिए मूल्य गहरे ऊतकों में संकेत करने वाली शोर अनुपात के एक steeper क्षय है. इस MB-सी-TPLSM में क्षेत्र का पता लगाने का उपयोग करने के लिए आवश्यकता के कारण है. 15 से पहले दिखाया गया है, बजाय बिंदु का पता लगाने के क्षेत्र का पता लगाने का उपयोग SNR डीयू के इस steeper क्षय के साथ जुड़ा हुआ हैकेवल क्षेत्र का पता लगाने के लिए प्रासंगिक है जो उत्सर्जित प्रकाश की मजबूत बिखरने के लिए ई. इस प्रकार, क्षेत्र का पता लगाने TPLSM तरीकों के लिए अधिकतम इमेजिंग गहराई लगभग है. पारंपरिक (आधारित यानी पहचान बिंदु) TPLSM की तुलना में 25% कम कर दिया. एक सीधा व्यावहारिक समाधान अब उत्तेजना तरंग दैर्ध्य लागू करने के लिए और लंबे समय तक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पता लगाने के लिए है. जाहिर है, इस MB-सी-TPLSM में के रूप में उसी हद तक पारंपरिक TPLSM में गहराई पर निर्भर SNR में सुधार.

जहां तक ​​अधिग्रहण की गति का संबंध है, MB-सी-TPLSM केवल galvanometric स्कैनर और / या 32 लेजर बीम की मदद से करने के लिए किरण बंटवारे का कैमरा और मुनाफे के पढ़ने के लिए बाहर से की गति द्वारा सीमित है. मानक बहु किरण कैमरा आधारित TPLSM की तुलना में, MB-सी-TPLSM वजह से स्कैन करने के लिए, लेकिन यह भी synchronously लगभग प्रत्येक प्राप्त करने के लिए न केवल जरूरत के लिए थोड़ा धीमी है. 10 धारीदार अंतिम उच्च संकल्प छवि उत्पन्न करने के लिए छवियों प्रबुद्ध. हालांकि, हमारी तकनीक एक सीएल बरकरार रखती है(एकल बीम स्कैनिंग और बिंदु का पता लगाने के आधार पर) पारंपरिक TPLSM से अधिक कान गति लाभ. इसलिए, एक 150 x 150 माइक्रोन 2 (512 x 512 पिक्सेल) के अधिग्रहण के समय MB-सी-TPLSM का उपयोग पारंपरिक TPLSM (स्कैनर आवृत्ति 800 हर्ट्ज) और 109 मिसे का उपयोग कर 841 मिसे है. संकेत दोनों की व्यवस्था के लिए तुलनीय है कि ताकि इस प्रकार, किरण प्रति उत्तेजना शक्ति और पिक्सेल प्रति ध्यान केन्द्रित करना समय, पारंपरिक और MB-एसआई TPLSM दोनों के लिए ही कर रहे हैं. पहले से photobleaching, 20 का प्रदर्शन किया और MB-सी-TPLSM प्रयोगों में photodamage प्रभाव कम और अच्छा प्रदर्शन पारंपरिक TPLSM लिए तुलना कर रहे हैं.

भविष्य में यह आगे संरचित रोशनी 21 के लिए अनुकूली प्रकाशिकी के क्षेत्र में उपलब्धियों के लिए इसी तरह intravital TPLSM, सुधार करने के लिए अवरक्त रेंज में अनुकूली प्रकाशिकी और धारीदार रोशनी के पूरक दृष्टिकोण गठबंधन करने के लिए वांछनीय होगा. हालांकि, इन लक्ष्यों को हासिल करने के लिए काफी तेजी से अनुकूली प्रकाशिकी दृष्टिकोणविकसित किया जाना चाहिए.

बायोसाइंसेज और बायोमेडिसिन के लिए धारीदार रोशनी दृष्टिकोण की उम्मीद उच्च प्रभाव संकल्प में सुधार लाने और गहरी ऊतक में विपरीत बढ़ाने, लहर सामने विरूपण का प्रतिकार और प्रभाव बिखरने, लेकिन यह भी लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में विवर्तन सीमा से परे जा रहे हैं, के द्वारा करने के लिए अपनी क्षमता में निहित है बस स्कैनिंग की प्रक्रिया को नियंत्रित करने और एक उचित संवेदनशील क्षेत्र डिटेक्टर चुनने.

बायोसाइंसेज और बायोमेडिसिन के लिए धारीदार रोशनी दृष्टिकोण की उम्मीद उच्च प्रभाव संकल्प में सुधार लाने और गहरी ऊतक में विपरीत बढ़ाने, लहर सामने विरूपण का प्रतिकार और प्रभाव बिखरने, लेकिन यह भी लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में विवर्तन सीमा से परे जा रहे हैं, के द्वारा करने के लिए अपनी क्षमता में निहित है बस स्कैनिंग की प्रक्रिया को नियंत्रित करने और एक उचित संवेदनशील क्षेत्र डिटेक्टर चुनने.

धारीदार रोशनी दृष्टिकोण intravital गहरे ऊतक IM के लिए लागू किया जा सकता हैएकल बीम स्कैनिंग में galvoscanner आंदोलन के साथ कैमरे का पता लगाने सिंक्रनाइज़ करने में सक्षम हैं सभी दो photon लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में उम्र बढ़ने. इस मामले में, उत्तेजना पैटर्न के भीतर ही धारियों बाद में और नहीं एक साथ MB-सी-TPLSM में के रूप में उत्पन्न कर रहे हैं. हम स्वाभाविक रूप से पारंपरिक TPLSM (एकल बीम स्कैनिंग, बिंदु डिटेक्टर आधारित TPLSM), लेकिन के लिए प्रदर्शन के रूप में स्थानिक संकल्प और इसके विपरीत एक ही सुधार की तुलना में प्रतिदीप्ति छवियों का एक थोड़ा धीमी अधिग्रहण दर की उम्मीद एसआई TPLSM में एक बीम स्कैनिंग का प्रयोग MB- एसआई TPLSM. एक साथ इमेजिंग गहराई में सीमा के साथ कम अधिग्रहण की गति काफी MB-सी-TPLSM की तुलना में एक किरण सी-TPLSM के आवेदन सीमा कम कर देता है.

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Disclosures

वोल्कर Andresen जर्मनी LaVision बायोटेक GmbH, Bielefeld, के एक शेयरधारक है. अन्य लेखक ब्याज की कोई संघर्ष नहीं है.

Acknowledgments

हम C57BL 6 / बी 1-8 GFP ट्रांसजेनिक चूहों को उपलब्ध कराने के लिए धारीदार रोशनी दृष्टिकोण, लालकृष्ण Rajewsky और ए Haberman के विकास के दौरान उपयोगी विचार विमर्श के लिए आर Heintzmann धन्यवाद. हम वित्तीय समर्थन के लिए ड्यूश अनुदान NI1167/3-1 तहत Forschungsgemeinschaft (आर एन के लिए), HA5354/4-1 और SFB633, परियोजना A15 (AEH के लिए), अनुदान Rahel-Hirsch फैलोशिप के तहत चरित (आर एन) के लिए स्वीकार करते हैं. हम विशेष रूप से उपयोगी बातचीत और ढांचागत सहायता के लिए नेटवर्क जिमी स्वीकार

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATTO590 – NSH for coupling ATTO Tec, Germany AD-590-35
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 DRFZ, Berlin The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+ Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment  StemmCell Technologies, Germany 19854
Polystyren beads (605), 0.2 µm Life Technologies, Germany F8803
Equipment
TriMScope I LaVision Biotec, Bielefeld, Germany
OPO (manual version) APE, Berlin, Germany
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II Coherent, Duisburg, Germany
Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm Olympus Germany, Hamburg, Germany

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References

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कीटाणु केन्द्रों की अत्यधिक हल intravital धारीदार रोशनी माइक्रोस्कोपी
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Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).More

Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).

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