Summary
成体マウスのリンパ節における120μmの深さまでの造影による高解像度の生体内イメージングは、空間的に多重焦点二光子顕微鏡の励磁パターンを調節することによって達成される。 100μmの深さでは、このように散乱や回折限界を回避し、（横）487 nmおよび551 nmの（軸方向）の解像度を測定した。
Abstract
生体深部組織の多光子顕微鏡による細胞の通信を監視することは、健康と病気の太い組織サンプルや臓器内の免疫細胞の運命を理解するための鍵となります。多光子顕微鏡の走査パターンを制御し、適切な数値計算アルゴリズムを適用することによって、我々は、3倍より良い軸方向分解能及び改善された信号対雑音比を達成することを可能にする、ストライプ状照明アプローチを開発し、 すなわちコントラスト、以上で標準の多光子顕微鏡法と比較して、非常にリンパ器官の組織の散乱内100μmの組織の深さ。撮像深度による磁界検出器の使用にわずかに低かったのに対し、取得速度、ならびに光退色および光損傷効果は、標準的な光電子増倍管ベースの手法と同様であった。ストライプ照明アプローチを使用することにより、我々は、二次濾胞樹状細胞上の免疫複合体沈着物の動態を観察することができる̵1;胚中心のいくつかのタンパク質分子のレベルで。
Introduction
二光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）、赤外線、超短パルス励起1に関連の深い組織のイメージングのための利点で、様々の運動性との相互作用のパターンを明らかにすることによって、単一細胞レベルでの生命過程に関する我々の見解に革命をもたらしました動物の2-5を生きた細胞サブセット。しかし、現在の技術は、それが健康と病気における組織内の細胞応答の分子基盤に関する唯一のまばらな情報をレンダリングするので、新たな治療戦略を開発するための前提条件として臓器機能と機能障害のメカニズムを解明するために、まだ不十分である。現在の技術は、散乱による数百ミクロンの唯一の空間的な窓を可能にし、空間分解能と成体動物の非常にコンパクトな組織で特に明白である信号対雑音比6、フロント歪みの影響を振る。これらの散乱や波面歪みの影響は非常に異質ANによるものである3D空間分解能の深さに依存する劣化への第一歩でも有数の組織における屈折率のD異方性分布し、最終的に弾道励起光子、信号対雑音比、すなわち喪失に起因する信号の全損失に。生命科学や生物医学深部組織用途の観点では、これは現在の技術は、信号対雑音比の低下は、システムがいくつかを見落とす原因となるのに対して乏しい分解能は偽陽性の相互作用をもたらすので一概にセルラー通信を明らかにすることができないことを意味する薄暗い構造間の相互作用。
明白に動的な方法で細胞間相互作用を検出するために、非常に改善された空間分解能が深部組織内で必要とされる。第一励起状態の枯渇で現在導入された強力な特殊な数値計算アルゴリズムに基づいてナノスコピー技術、 例えば構造照明のアプローチ、 例えば 、 例えば dSTORM、Palmは、固定された細胞にだけでなく、生きた細胞培養7で多くのアプリケーションを発見した。しかし、組織切片、生体組織や生物にこれらのアプリケーションを拡張するために、我々はまだ深刻な技術的な問題を克服する必要があります。二光子励起は、異なる波長で、並びに励起用の単一波長（sw2PE-STED）でSTEDおよび発光が同じで、それぞれ埋め込 まれた細胞9を用いて脳切片8または人工マトリックス中に横方向の解像度を向上させるために適用された刺激標準TPLSMとして距離分解能。 1光子STEDを使用して、樹状突起棘のダイナミクスは、67〜10nm程度の分解能で生きTHY1 EGFPマウスの脳皮質（最大10から15ミクロンの深さ）の表面に画像化することができた。発生生物学のための多目的なツールは2倍に改善された2Dを提供し、多焦点構造化照明顕微鏡によって提供されている解像度。しかしながら、この技術は、例えば、ゼブラフィッシュ胚11と光散乱の低い傾向を有する生物において使用することができる。それでも、これらの技術はいずれも、出産後発症を伴う疾患の生物医学および臨床研究のための重要なモデルであり、数百μm、大人の動物の高度に散乱組織に適用することはできません。
点広がり関数（PSF）、すなわち 、回折限界の波面形状を計算するために使用される近似の独立したが、レンズを通して集束した後、光軸（距離分解能）に沿ったPSFの幅よりも少なくとも3倍大きい光軸（横方向の解像度）12に垂直PSF幅。ゼルニケの係数によって定量化異なる次数の前歪みはかなり、特に視神経に沿って、はるかに大きいのPSFにつながる深部組織イメージングに集中電磁波の波面形状を変更し、波13〜15軸A1。したがって、回折法および波面歪み効果の両方が深い組織イメージングの制限要因としての光軸に沿って解像度を指しています。ナノスの技術は、回折限界を打ち消す一方のみに焦点を当て、軸方向分解能と回折波面歪みの影響の両方に対抗してコントラストを向上させる技術は、高解像度の生体内イメージングのために必要とされる。理想的には、この技術は十分な速さで、携帯動態のモニタリングを可能にするためにもである必要があります。
PSF異常とTPLSMにおける補償光学を用いたコントラスト損失のリアルタイム補正が盛んに研究され、過去十13,14,16-18に改善され、したがって、弾道励起のより良い管理につながる現時点で得られる最善の選択であるされています光子は14。まだ、原因ほとんどはフロント補正を振ることに補償光学で使用されるアプローチ反復的であり、彼らは、HA、その小領域ごとに繰り返さなければVEの（数10×10〜2）は、組織における屈折率の高い不均一性のために、取得速度は、細胞運動性および通信を画像化するために必要なよりも著しく低い。また、適応光学における物理的限界はTPLSMはまだ回折によって決定され改善された。
illumination（SPIN）及び検出側（SPADE）上の時間変調の空間変調は、理論的に解像度を向上させるレーザ走査顕微鏡法に適用することが提案されている。生体内イメージングでの実用化はまだ19を実証されていない。
一緒になって、生きている成体動物における深部組織の画像化の解像度を向上させる技術の開発のための高い需要が存在する。本研究では、マルチビームストライプ照明多光子レーザーの走査プロセスを制御することにより、励磁パターンの空間変調を実現缶詰顕微鏡（MB-SI-MPLSM）20。励起ビーム断面が空間的に変調された構造化照明のアプローチに反して、我々は、励起の空間変調を実現するためにのみスキャン処理を用いる。より長い波長に励起を拡張することによって、我々は独立して、光の、高散乱組織（ 例えばリンパ節、自由散乱路47ミクロン6）の深部組織における空間分解能と信号対雑音比の両方を改善することができる我々は検出非線形の信号、 例えば蛍光、第二高調波発生や他の周波数ミキシング現象。 900 nmの最大励起波長でこのアプローチを用いて、我々は、マウスのリンパ節の胚中心における少数の分子の規模で動的に画像細胞タンパク質構造にできる。従って、我々は良好な抗プロービングの過程で濾胞樹状細胞およびB細胞の表面上の抗原搬送ユニット間の相互作用を視覚化することができ二次リンパ器官における免疫応答の間GEN。
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Protocol
ストライプ照明TPLSM用マルチビームのセットアップ
ここで使用される設定は、先に説明したように6,20、特殊なマルチビーム二光子レーザー走査型顕微鏡である。システムは、 図1に示されているアプローチは、ガルボミラーの動きとカメラの取得を同期化することができる他の二光子レーザー走査型顕微鏡に適用することができる、それらが単一のビーム走査を実行することのみが可能であっても。この場合は、不利な点は、標準のPMTベースTPLSMにおける取得速度にしかし類似の下側捕捉速度になります。これまでの分解能及びコントラストに関する限り最適な品質を達成するために、最も低い光退色および光損傷と最速の取得時には、セットアップの次の調整ステップを考慮することが推奨される。
- TISAレーザーのレーザーパワーをチェックします。、100％を確認し、元の工場出荷時の値と比較し、previo私たち自身の測定値の範囲700〜1,000 nmの励起波長が必要な場合は、そのままそれを使用する。
- Tiの遠隔制御指示をテスト：Saはビームスプリッタ、 すなわち 0％を確認し、100％設定。 100パーセントであり、残りのTISAビーム場合は、ステッピングモータ零位置をチェックし、リセットします。 Tiは：サビームスプリッタは、垂直ビーム経路に垂直偏光のレーザビームを分割し、下位λ/ 2板と偏光子、から構成されています。1が励起用顕微鏡に向けられているが、他は、光パラメトリックポンプに使用されます発振器（OPO）。自動的にλ/ 2板、Tiを無段階調節回転させることにより：SaとOPO力を、それぞれ達成される。
- 所望の波長にOPOを調整し、出力パワーを測定します。パワーが低すぎる場合：励起波長を最適化し、目の設定を確認してチタン（Ti、W 4でSaはレーザーは800 nmで、1は約1,050-1,100 nmのOPOビームのW 0.8-1を得ることができる必要があります）Eミラーと煽ら結晶。 OPOは、所望の波長の出力で共振し、電力が増加するまでは、推奨される最適なチャートやグラフなどの頻繁に使用可能な値、、その後、微調整して選択します。
- 電力がまだ低い場合は、4にアクセス可能ミラー調整ノブで、OPOの2にアクセス可能ミラーを調整します。非常にゆっくりと、非常に小さな動きでは、フロントエンドとミラーの間に交互にこの手順を実行する。
- Sa及び/またはOPOビームが適切、中央位置にエントリのミラーをヒット：Tiがあることを確認してください。
- 白い紙（！非常に光沢のあるか反映していない）とOPOビームと高波長のTiを観察するための赤外線ビューアを使用します。Saは梁。
- 近赤外チタンを扱うときは保護メガネを使用してください：サビームが（通常は720から750ナノメートルまでの平均的な人のために表示されている）。
- を、miするように位置合わせ手順のために、可能な限り低いレーザパワー（s）を設定する潜在的な眼の損傷nimize。
- 目の瞳孔が収縮しているように、常に、上の部屋のアンビエントライトを保つ。
- サビームはスキャンヘッドに入る：レーザーパワーを微制御Tiをするとき、まだ有効ではありませんλ/ 2板と偏光板、外から減衰器であることを覚えておいてください！
- 白い紙（！非常に光沢のあるか反映していない）とOPOビームと高波長のTiを観察するための赤外線ビューアを使用します。Saは梁。
- エントリ·ポイント·ダイアフラムは、Tiにより途中でヒットしていることを確認します。Sa及び/またはOPOビーム;いない場合は、レーザビームがスキャンヘッドに入る前に、最後の2のミラーを調整します。
- IRビューアと白（反射/しかしピカピカではない！）紙の小片を使用してください。
- レーザービーム位置をより正確に判定することができるように、常に、顕微鏡への参入で、絞りを閉じる。重要：手順6に進む前に、振動板を再オープンすることを忘れないでください！
- したがって顕微鏡に反射されたレーザ光の光路を調整します。小さなセグメントでこれを行うと反復ビーム-WAを実行lking。
- 対物レンズからの光出力が十分でない場合、全体の光路を確認してください。
- 長いアイドル期間、大修理、光学素子のいずれかの交換後初めてシステムを使用する際には、必ず光路を確認するかの問題は、出力に存在することが疑われている場合。
- 彼らはほこりが付着して、特にあることを、すべてのアクティブな光学面が汚れていないことを確認してください！表面がほこりの層で覆われている場合、波面があっても、対物レンズに入射する前に歪んでいる、得られたレーザビームは、試料の鮮明な画像を配信することはありません！
- 必要に応じて、エタノールまたはイソプロパノールで湿らせたレンズペーパーの折り返し枚とミラーを清掃してください。
- ビームは光路が設定された後、プリズムベースのパルス圧縮器の最後に直接エントリーミラーの上方に位置しているミラーに戻ってくることを確認してください。ここからは、光が反射してIビーム·マルチプレクサ（BM）NTO。
- レーザビームは広帯域50％の透過と50％の反射のための要件に合わせてレーザ光の偏光を変化させる、直接λ/ 2板の前に、光合波器の入口に位置する振動板に当たったかどうかをチェックしBM中。
- 最初のビーム位置をより正確に判定することができるように、ダイヤフラムを閉じて、BMエントリで顕微鏡や他への入口で1 すなわち 、2つの振動板との間のビームウォーキングを行う。他のシングルビーム走査型顕微鏡用の振動板は、XYスキャナへのエントリに配置する必要があります。
- ビームがクローズダウン開口の中心にヒットしない場合、BMエントリ絞りの直前に配置され、前記ミラーを調整する。重要：ステップ10に進む前に、振動板を再オープンすることを忘れないでください。
- ダイヤフラムがリニューアルオープンして、レーザビームがBMミラー内に当たるかどうかをチェックその中間地点。 BMの複雑な光の経路の別の部分をブロックしないように紙の狭いストリップを使用してください！
- 平行偏光のトップミラー「P」、垂直偏光の「S」の下部ミラー：ビームは、出口ミラーの真ん中に当たるかどうかを確認します。そうでなければ、BMの前にエントリーミラーを調整します。
- 「S」と「P」偏光はグループが、偏光子キューブを入力して、XYスキャナへのエントリで適切にオーバーラップすることができますかどうかを確認してください。シングルビーム走査顕微鏡を用いた場合にこれらのステップをスキップします。
- レーザ光を集中的にスキャンし、チューブレンズを通過して、対物レンズ「後焦点面の中央を取得するかどうかを確認してください。重要：このステップではなく、駐車位置に、中心位置にレーザビームを行わなければならない！
- 目指しツール（「牛の目」）とは、対物レンズを交換し、レーザ光が途中でターゲットに当たったかどうかをチェックし、か照明は偶数である。
- これが事実であると思われる場合は、BMの前に開口部を閉鎖し、円形の干渉パターンが表示された場合は真ん中（干渉最小）の黒い円で、確認してください。
- 牛の目の中心を基準に大きな変化があった場合、エントリのミラーを調整します。
- 今20X水浸レンズを例えば 、対物レンズと牛の目を交換してください。
- 白い紙に出力光フィールドを確認してください。これは、明るく均一かつ集中的に配置する必要があります。
- 出力パワーを測定します。チタンをポンプ100パーセントと100％のOPOで：SA（4 W）、1、約取得する必要があります。 （ここで使用顕微鏡）1,100 nmにおけるレンズ後100〜150ミリワット。 Lowerレーザー出力はマルチビームSI-TPLSMを実行するために十分ではありません。シングルビーム走査SI-TPLSMのため、5月10日mWのは十分です。レーザビームはscanneことなく中心位置に残す必要D！
- MB-SI-TPLSMを実行する場合は、次のようにBM中のミラーを揃える：
- ステージ上で均一に蛍光を発する試料、 例えば赤色蛍光スライドを配置し、試料内部のが、（対物レンズの前にすなわち近い）上面付近のレーザー光の焦点を合わせる。
- マルチビームモードに顕微鏡を設定し、ビームの数を選択し、開始時に、好ましくはただ1線、偏光、 例えば 「P」。
- 「P」、シャッターオープンを設定し、ビームを集束しながら継続的にCCDカメラを実行します。蛍光スライドを画像化することによりレーザ光を見つける。
- ビームは中心位置にあり、スキャナがオフになっていることいることを確認してください。ビームがスキャンされないことを確認してください！
- カメラチップの中央付近の明るいスポットを探すことによって、光を見つける。
- スポットが像面すなわち 、明るく鮮明になるまで、ビームを集束顕微鏡は、カメラチップの位置に対応する;スポットが飽和しないように、レーザパワーを減少させる。よく揃っているシステムでは、これは、レーザー電力が1ビームモード（約0.6 mWのレーザーパワーは動作するはずです）で作業するときに近い最小限でなければならないことを意味します。
- スポットが中心から外れ大幅にある場合は、前にBM（またはシングルビーム走査用スキャナのを）ミラーを調整することにより、中央寄りに移動します。
- また、 すなわち、「S」ビーム他の偏光を揃える際に、今、2ビームモードに切り替える"S"シャッターを開き、唯一の"S"シャッターが開いている場合（1つのビームのみを見ることができるビームの位置を確認する）。
- 完了したら、4ビームモードに切り替えて、「P」偏波モード（「P」シャッターオープン）を使用します。今2ビームレットが表示されます。
- カメラのビューの下端に完全に平行になるように2ビームレットを配置し、離れて2.8μmとするように設定。
- それらが適切に整列されていない場合は、BMの第1のミラーを調整します。
- 2つのビームがUM離れて、完全に水平に配置され2.8になるまで、代わりにミラーを移動するために二つの周辺のネジを使用し、中央にネジを合わせたことがない。
- 今や「P」偏光の8ビームモードに切り替え、4ビームレット2.8ウムで等距離であり、画像の下縁部に平行に配置されるまで、第2のBMミラー（赤色ドットなし）を調整する。
- それぞれ、32ビームモード、3番目と4番目のBSミラーの調整 - 16で繰り返します。 SI-アルゴリズムは、最も単純なミニマックス（ヒロ）アルゴリズムであり、この仮定に基づいているため、ビームレットが等距離であることが重要である。
- wは、励起ビームの駐車位置に行くHICHは、通常、スキャナの座標の値が大きい、 例えば、（; 10,000 10,000）に配置される。
- CCDカメラ（マルチビーム）の画像をスキャンします。イメージは、シャープで均一な、まっすぐ表示されていることを確認してください。
- 画像を回転表示された場合にカメラを調整：画像をまっすぐにされるまで（！優しくして）手で軸方向に垂直軸を中心にカメラ本体をねじる。
- マルチビーム走査の場合、 すなわち 、γ-スキャナミラーを移動させる。次のストライプ画像を生成するような方法で、ビームレット線に直交する。
- ステップ17.1で説明したように視野が生成されます。ビームレットの線が2倍とビームレットは、全体線に沿って等距離にされることを保証する位置にX線スキャナミラーを移動させることにより走査ルーチンを拡張し、小さすぎる。正確な動きを繰り返しますX線スキャナミラーの後のyスキャナミラーの縞模様は、より大きな画像を生成するように移動される。
- 所望のストライプ状の画像を生成する - 科学者によって定義 - 単一ビーム走査の場合には、等距離の位置に繰り返しのxスキャナミラーの動きを有するγ-スキャナミラーの動きを交互。
- 一定速度（還元加速/減速）するYスキャナミラーコマンドの移動のために、最高速度（最大加速/減速）のXスキャナミラーの1のために使用してください。
- 十分な繰り返しのステップとの間の適切なステップ長を選択してください二つの連続ビームレット間の距離をカバーするために二つの連続するストライプ状の画像（ここでは2.8μmで、スキャナミラーの1つのステップは、25ナノメートルに等しい）;それは、追加の0.3〜0.4ミクロン、つまり 、ほとんど重複を許可することが推奨される。
- 与えられた波長での横方向の解像度限界に一致する値にXシフトを設定します。一例として、シフトあたりのXスキャナミラーの10のステップと12または13のシフトを使用すると、このシステムでは最高の軸方向および横方向の分解能の両方の結果を招く。番号が使用されているシステム内で最適に動作構造化されたスライド、 例えばスズランの根スライド、確認してください。
- スズラン画像が最も鮮明になるまでこれら二つの値を最適化：計算されたSIの画像についてラインプロファイルツールを使用してラインプロファイル（スズラン細胞壁からの蛍光シグナルである）の幅を比較する。
- スキャナの動きと同期して、各ストライプ画像を取得し、別々に保存し、 例えば
生体内イメージングのためのマウス免疫と準備
動物実験は、動物福祉（LAGeSo、Landesamtエリーゼお大事にウントSoziales、ベルリン）に適した状態委員会により承認され、現在のガイドラインや規制（動物実験のライセンスG0153/08）に従って行われた。
- 4前に記載されるように、膝窩リンパ節および撮像視野の調製における胚中心反応の誘導を行った。免疫磁気の脾臓からB細胞を精製B1-8 + / +Jκ - / -とB1-8 + / +JκのB細胞- / - GFP +マウス。
- - / - + / +Jκ⅛B1-8を使用して> 95％の純度で、静脈内に3×10 6 NP特異的B細胞を注入し、GFP +と⅞非蛍光B1-8 + / +Jκ - / - C57BL / 6レシピエントにおける。
- 細胞移入後のある日は、NP-CGG右後肢食品パッドに完全フロイントアジュバント（CFA）中に乳化（ニトロフェニルチキンɣグロブリン）10μgの受信者を免疫する。
- ATTO590-スクシンイミジルエステルとanti-CD21/CD35抗体のラベルFab断片。
- 生体内での胚中心内の濾胞樹状細胞（FDC）のネットワークを強調するために、生体内分析の前に12から24時間が実行されたマウスの右後肢足蹠に蛍光色素標識Fab断片10μgのを注入する。
次の手順はconsideでなければなりません生体内画像化のための膝窩リンパ節（8〜10日目の免疫後）の調製のための赤：
- ケタミン/キシラジンの腹腔内注射、自分の体重に応じた量だけ、マウスを麻酔。
- 全体撮像期間にわたる麻酔深度を監視するために反射神経をテストします。
- 背中、脚、そして厳格なマウスの右脇腹を剃ると、完全に残留毛を除去するための除毛クリームを使用しています。
- 主要な権利転子を修正：小さな白い三角形の筋膜が表示されるまで、ハサミで小さな皮膚切開を設定し、指で骨のチップを探します。
- 制止の尖ったピンセットでこの筋膜の下の骨チップをクランプする。
- 歯付きピンセットを用いて腰椎領域で背骨を固定します。
- レストレーナーに右後肢を固定し、ネジを締めます。
- 正しい位置に足を保つために、テープの尾。
- 大腿部の尾側では、著名な膝窩動脈エンテエリアでは、皮膚の切開部を作成RS組織、鈍ピンセットで下部組織から皮膚を分離し、近位から遠位に膝窩動脈に従ってください。
- 鈍ピンセットを用いてリンパ節を公開（公開する時にPBSにリンパ節を保つ）細かいリンパ管を保護するために切断しないようにしてください。
- リンパ節の周囲に真空グリースの円を作成し、PBSでこの水たまりを埋める。
- その位置にカバーガラスを入れて、（そうでなければ、セル速度は劇的に変化し、37℃に温度を保つ）温度計プローブを配置します。
- カバースリップの上縁に沿って真空グリースのサークルに追加します。
- 、真空グリースでその位置に加熱コイルを入れる前と同じように、同様の方法でシールを作成し、目的をに手をつけるためにガラスカバースリップ上で水/ PBSを加えます。
- 致死量にケタミン/キシラジンの投与量を増加させながら画像化した後、マウスを頸椎脱臼に続いて、麻酔に保持されます。
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Representative Results
リンパ節における空間分解能
効果的な点広がり関数（EPSF）の寸法は、顕微鏡12の空間分解能に対応する。我々は、（CCDカメラを用いて）確立された二光子レーザー走査顕微鏡技術、 すなわち磁界検出TPLSMと比較して我々のMB-SI-TPLSMにより、リンパ節中のコラーゲン繊維の第二高調波発生信号を取得することにより、この3次元関数を測定し、 （光電子増倍管を用いて）点検出TPLSM。
これらの測定値から、試料の表面に、両側および軸方向の解像度が回折理論20によって予測された期待値に対応する明らかになる。しかしながら、増加する撮像深さ、したがって高度に変化する屈折率を有する媒体を介して励起及び放出放射線の両方の光学経路の増加に伴って、空間分解能が独立著しく劣化する懸垂採用セットアップします（ 図2）。 MB-SI-TPLSMによって、我々は、独立して撮像深度の、約に達した。横方向の解像度と標準TPLSMアプローチに比べて220パーセントより良い距離分解能20％優れています。
胚中心内の濾胞樹状細胞上の免疫複合体のダイナミクス
免疫応答中のB細胞のクローン選択は、成体マウスの二次リンパ器官内のメモリB細胞または形質細胞4に分化するそれらの方法の最初のステップである。このプロセスでは、胚中心内の免疫複合体の構造（いくつかのタンパク質分子のクラスター）のレベルでの濾胞樹状細胞（FDC）とB細胞との間の非常に動的な相互作用が重要な役割を果たしていると考えられている。唯一の高分解能生体顕微鏡技術を使用することにより、免疫応答は、このセルラー通信とその影響を分析することができる。 Mの私たちのアプローチ濾胞樹状細胞にanti-CD21/35-Fab-ATTO590によってラベルとして、B-SI-TPLSMは、最大120μmの深さで、初めてintravitally免疫複合体沈着のクラスターの大きさを可視化し、定量化する可能性を提供する膝窩リンパ節の胚中心（ 図3aおよび3b）。このような構造は、標準的なTPLSMのアプローチによっては表示されませんが、我々はそれらを個別に識別しても、我々のアプローチを使用してダイナミクスを可視化する。 図3Eおよびこの洞察をサポートする3階胚中心での免疫細胞の堆積物の3次元蛍光画像との直接比較を示すことができ従来TPLSM（PMTベース）とMB-SI-TPLSMによって取得した。また、胚中心B細胞との免疫複合体の堆積物との相互作用は非常に（ 図3Cおよび3D、ビデオが1および2）解決することができたし、今することができます増殖、分化やアポトーシスに生体機能のプローブと組み合わせてnvestigated。次のステップにおいて、我々はまた、二次リンパ器官におけるB細胞のクローン選択のための他の決定的な現象を構成すると考えられるTヘルパー細胞、胚を有するB細胞の動的通信を調査するために我々のアプローチを使用する。
図1原理とマルチビームストライプ照明二光子レーザー走査型顕微鏡の設定調整可能なフェムト秒パルスしたTiのビーム：サレーザ（波長範囲690-1,080 nmの、140フェムト秒、80メガヘルツ）が減衰する、λ/ 2板と薄膜偏光子からなるモジュールで、そのパルスは、プリズムベースGVD補償モジュールで予め圧縮され、最終的に2、4、8、16、32、または64のビームに分割ビームレットラインを形成する。ライン内の二つの連続するビームレットは、垂直偏光（ビームレット行に赤および緑標識）を有し、干渉を回避するために時間的にシフトされる。 2連続したビームレット間のタイムシフトは、3ピコ秒にのぼる。明確に定義された周期的なパターンが生成されるように、画像取得のために、ビームレットの線は、対物レンズ（20倍水浸対物レンズ、NA 0.95、WD 2mm）にすることにより、試料に集束及び垂直に走査される。このパターンは、小ビームラインに沿って平行移動される。 EM-CCDカメラでフィルタホイールに取り付けられた干渉フィルタを介して検出され、最終的に最小最大アルゴリズムによって評価される一連の画像はこのように生成される。 PMT検出に基づいて、単一ビームTPLSMは、同じ顕微鏡を用いて行った。このケースでは、試料を走査する唯一のレーザービームを用い、我々は、スペクトルの対応するダイクロイックミラーと干渉フィルタの前に検出して蛍光シグナルを解決光電子増倍管とそれをING。または、代わりにTiから：サレーザー光、光パラメトリック発振器のビームは、長波長MB-SI-TPLSMを実行するために顕微鏡に結合することができる。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
標準PMTベースおよび多発性のCCDベースのTPLSMに比べてマルチビームストライプ照明TPLSMの図2。空間分解能。（A）代表の軸プロファイルだけでなく、XYやリンパ内100μmの深さのコラーゲン線維のSHGのXZ予測ノード。 LEXC = 900 nmの検出波長は447±30nmで、光子束Φ= 4.75×10の範囲
図3 MB-SI-TPLSMによる胚中心の生体内画像化ハプテンで免疫したマウスでCD21/35-Fab-ATTO590（赤）でラベルされた胚中心の光ゾーン（A）3次元蛍光画像-チキンγ -GLB1-8 EGFP + B細胞（緑）の養子移入後obulin（NP-CGG）。画像のズーム·インで観察されるよう濾胞樹状細胞（FDC）上の免疫複合体沈着（CD21/35標識）は、個々に可視化することができる（b）工程（a）および（横方向及び軸方向の両方）を有する寸法最大120ミクロンの深さ400〜800ナノメートルの範囲。免疫されたB1-8 EGFP +マウスにおける胚中心B細胞は、（c）は、免疫応答の成熟のために部分的に関与接点（d）は 、一方今も可視化することができる検出される。 λ 販売 = 850nmで、検出波長は605±20nmの（ATTO590）および525±25 nmの（EGFP）、光子束Φ= 7.05×10 28フォトン/ cm 2で·秒の範囲である。スケールバー（A）が20μm、（B）が10μm、（C）は30μm、（d）は 10μmである。同じ領域内の3次元蛍光画像MB-SI-TPLSM（E）と従来（PMTベース）TPLSMによって記録さCD21/35-Fab-ATTO590によって標識され、胚中心の光ゾーン（F）であった。 これの拡大バージョンを表示するには、こちらをクリックしてください図。
映画のキャプション
映画1及び-2
免疫複合体の二次濾胞樹状細胞上の堆積物（FDC）及び胚中心B細胞との相互作用MB-SI-TPLSMによって記録されるのダイナミクス。 - / - EGFP +細胞（緑）胚中心B細胞は、B1-8 Jkのであるのに対し、免疫複合体の堆積物をCD21/35-Fab-ATTO590（赤）で標識されている。
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Discussion
生体内光学的イメージングの目的は、動的におよび機能的に健康と病気5における組織および器官の機能を理解するために、細胞運動性および相互作用を可視化することである。その空間分解能、コントラスト並びにその時間分解能を制限し、これを達成するための最も強力な技術、多光子レーザ走査顕微鏡法、依然として前方歪み波に関連する制限を克服しなければならず、散乱、遅い捕捉、光退色および光損傷、 。
成功を収めた2より良い励起を達成するためのソリューション（および放出）深部組織のより良好な空間分解能をもたらす、増加したコントラスト（増加による信号の増加信号対雑音比）、及び、従って、還元、光退色および光損傷における光子管理があります：アダプティブオプティクスアプローチや長い励起波長の使用-調整可能な赤外励起6。過去10年間で、波面対応の考え方適応光学素子によるctionバイオ光学イメージングにし、また、多光子顕微鏡法に天文学から転送された。最初の補償光学は、2光子顕微鏡波面センシングに依存していたとsubdiffraction参照を必要なためのアプローチが、天文学同様の「ガイド星を」、 すなわち 、現在のシステムは、深い組織画像12に適しています。例えば、それらは13,15センシング波面のための励起放射のコヒーレンス·ゲーティングを使用したり、瞳孔が17セグメンテーション以降、彼らはまったくの外部波面センシングを使用していますが、どちらの画像の相互相関に基づく適応アルゴリズムを開発しないでくださいインパクト16、またはそれらは、波面歪みや散乱効果20を特徴づけるために、光音響を使う-理想的なパラメータおよび補正前の画像とのその後の干渉前の反復ステップから得られた反復確率的探索に。それでも、非常に様々なREFRが原因組織内のアクティブなインデックス補正ステップが比較的小さい領域（約10×10μm2）と16について繰り返さなければならないため、補償光学のアプローチは、かなり遅い。さらに、いずれかの波面または散乱効果補正によって、達成可能な最大空間分解能は依然として、回折によって制限される。
我々のアプローチは、部分的に波面収差の散乱の負担を克服することであるが、回折限界を超える分解能を押す。高開口数の対物レンズを使用して、距離分解能の絶対値は約400〜20nmで改善されることがあります。改善された解像度が値下がりTPLSM従来と比較して深部組織における信号対雑音比のより急な減衰である。これはMB-SI-TPLSMに磁界検出を使用する必要性に起因している。 15の前に示されるように、場検出器の代わりに、ポイント検出器の使用は、SNRデュのこの急峻な減衰と関連している専用フィールドの検出に関連して放出される光の強い散乱E。従って、磁界検出TPLSM方法の最大撮像深度は約です。従来の（ベースすなわち点検出）TPLSMに比べて25％減少した。簡単な実用的な解決策は、より長い励起波長を適用し、より長い発光波長を検出することである。当然のことながら、これは、MB-SI-TPLSMと同程度に、従来のTPLSMにおける深さに依存するSNRを向上させます。
限り取得速度に関しては、MB-SI-TPLSMのみガルバノスキャナおよび/または32レーザビームができるように、ビーム分割のカメラと利益の読み出しによる速度によって制限される。標準的なマルチビームカメラベースTPLSMと比較して、MB-SI-TPLSMスキャンするだけでなく、同期約の各々を取得するだけでなく、わずかに遅いために必要である。 10縞模様は、最終的な高解像度画像を生成するために画像を照射した。しかし、私たちの技術は、CLを保持（シングルビーム走査点検出に基づく）は、従来のTPLSM上の耳速度の利点。したがって、150×150μmの2（512×512ピクセル）の取得時間はMB-SI-TPLSMを用いた従来のTPLSM（スキャナ周波数800ヘルツ）と109ミリ秒を使用して841ミリ秒である。信号が両方のセットアップに匹敵するように、これにより、ビーム当たりの励起パワー及び画素当たりの滞留時間は、従来のMB-SI TPLSMの両方で同じである。以前に20を示したように、MB-SI-TPLSM実験における光退色と光損傷の効果が十分に行われ、従来のTPLSMに低く、同程度である。
将来的にはさらに構造化照明21用の補償光学での成果と同様生体TPLSMを改善するために、赤外領域に適応光学系とストライプ照明の補完的なアプローチを組み合わせることが望ましいであろう。しかしながら、これらの目標を達成するために、かなり速く適応光学は、アプローチ開発されなければならない。
生命科学や生物医学用のストライプ照明アプローチの耐衝撃性が波面歪みや散乱効果に対抗する、分解能を向上させ、深部組織のコントラストを増強するその能力にあると予想するだけでなく、レーザ走査顕微鏡の回折限界を超えることにより単にスキャン処理を制御し、適切に敏感な磁場検出器を選択する。
生命科学や生物医学用のストライプ照明アプローチの耐衝撃性が波面歪みや散乱効果に対抗する、分解能を向上させ、深部組織のコントラストを増強するその能力にあると予想するだけでなく、レーザ走査顕微鏡の回折限界を超えることにより単にスキャン処理を制御し、適切に敏感な磁場検出器を選択する。
ストライプ照明手法は、生体深部組織筋肉内に適用することができるシングルビーム走査におけるガルボスキャナーの移動に伴ってカメラ検出を同期させることができる全ての二光子レーザー走査型顕微鏡で熟成。この場合、励起パターン内の単一のストライプは、その後ではなく、同時にMB-SI-TPLSMのように生成される。 MB-のために実証されたように、私たちは自然に、従来のTPLSM（シングルビーム走査、点検出に基づくTPLSM）が、空間分解能とは対照的に、同じの改善と比較して、蛍光画像のわずかに遅い取得速度を期待して、SI-TPLSMの単一ビーム走査を使用してSI-TPLSM。一緒に撮像深度の制限を有する下部取得速度が大幅にMB-SI-TPLSMと比較して、シングルビームSI-TPLSMの適用範囲を低減します。
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Disclosures
フォルカー·アンドレセンはLaVisionバイオテック社、ビーレフェルト、ドイツの株主である。他の著者は、利益相反を持っていない。
Acknowledgments
我々は、C57BL / 6、B1-8 GFPトランスジェニックマウスを提供するためのストライプ化照明手法、K. RajewskyとA.ハーバーマンの開発中に実りある議論をR. Heintzmannに感謝します。私たちは、経済的支援のために（RNに）助成金Rahel-ハーシュフェローシップの下シャリテ、（AEH）はHA5354/4-1とSFB633、プロジェクトA15、（RN）の助成金NI1167/3-1の下でドイツ学術振興を認める。私たちは、特に有益な議論やインフラをサポートするためにネットワークJIMIを認める
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATTO590 – NSH for coupling | ATTO Tec, Germany | AD-590-35 | |
| CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 | DRFZ, Berlin | The coupling reaction was performed in the central lab of our institution. | |
| B1-8 Jk-/- EGFP+ | Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US | Can be also found at Jackson Laboratories (JAX). | |
| EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment | StemmCell Technologies, Germany | 19854 | |
| Polystyren beads (605), 0.2 µm | Life Technologies, Germany | F8803 | |
| Equipment | |||
| TriMScope I | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| OPO (manual version) | APE, Berlin, Germany | ||
| Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II | Coherent, Duisburg, Germany | ||
| Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm | Olympus Germany, Hamburg, Germany |
References
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