Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Высоко Решено Прижизненные Полосатый-подсветка микроскопия зародышевых центров

doi: 10.3791/51135 Published: April 9, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Высокое разрешение прижизненной визуализации с повышенной контрастности до 120 мкм глубины в лимфатических узлах взрослых мышей достигается пространственно модуляции шаблон возбуждения мульти-координационного двухфотонного микроскопа. В 100 глубиной мкм мы измерили резолюции 487 нм (боковые) и 551 нм (осевой), в обход рассеяния и дифракции пределы.

Abstract

Мониторинг сотовой связи по прижизненной глубокие ткани многофотонной микроскопии является ключевым для понимания судьбы иммунных клеток в образцах толщиной ткани и органы в норме и патологии. Управляя шаблон сканирования в многофотонной микроскопии и применения соответствующих численных алгоритмов, мы разработали полосатый-подсветки подход, который позволил нам добиться в 3 раза лучше, осевое разрешение и улучшенную отношение сигнал-шум, то есть контраст, в более чем глубина 100 мкм ткани в сильно рассеивающих ткани лимфоидных органов по сравнению с стандартной многофотонной микроскопии. Скорость сбора, а также Фотообесцвечивания и фотоповреждения эффекты были подобны стандартным методом фотоумножителем основе, тогда как глубина визуализации была несколько ниже в связи с использованием полевых датчиков. Используя подход полосатый-освещения, мы можем наблюдать динамику иммунного комплекса отложений на вторичных фолликулов дендритных клеток ̵1; на уровне нескольких белковых молекул в зародышевых центров.

Introduction

Двухфотонное лазерной сканирующей микроскопии (TPLSM), со своими преимуществами для глубокие ткани визуализации, связанной с инфракрасным ультра-короткого импульсного возбуждения 1, произвела революцию наш взгляд на жизненные процессы на уровне одноклеточного, раскрывая моторику и взаимодействия моделей различных сотовые подмножества в живых животных 2-5. Тем не менее, современные технологии по-прежнему недостаточно для выяснения механизмов функции органа и дисфункции в качестве предпосылки для разработки новых терапевтических стратегий, так как он оказывает только недостаточной информации о молекулярной основе клеточного ответа в тканях в норме и патологии. Современная технология позволяет только пространственное окно несколько сотен микрон из-за рассеяния и волновые фронты эффекты искажения на пространственное разрешение и отношение сигнал-шум 6, которые особенно очевидны в очень компактной ткани взрослых животных. Эти рассеяния и волновые эффекты передние искажения обусловлены весьма неоднородной апг анизотропной распределение показателя преломления в ткани, приводит в качестве первого шага на глубину зависимого ухудшения 3D пространственным разрешением и, наконец, к полной потере сигнала, приходящего из баллистических фотонов возбуждения, то есть потери отношением сигнал-шум. С точки зрения bioscientific и приложений биомедицинских глубокой ткани, это означает, что в настоящее время технологии не в состоянии однозначно выявить сотовой связи, потому что плохое разрешение приведет к ложно положительных взаимодействий в то время как снижение отношения сигнал-шум вызовет система выйти на некоторые взаимодействия между тусклыми структур.

Для того, чтобы однозначно обнаружить клеточные взаимодействия в динамике, значительно улучшены пространственное разрешение необходимо глубоко в ткани. В настоящее время введены мощные методы Наноскопия на основе специальных алгоритмов численного, например подходов структура-освещения, на истощение первого возбужденного состояния, например например dSTORM, PALM, нашли множество применений в основной клеток, а также в культурах живых клеток 7. Тем не менее, для того чтобы расширить эти приложения, чтобы срезах тканей, живой ткани и организмов мы все еще должны преодолеть серьезные технические трудности. Двухфотонное возбуждение STED с различными длинами волн, а также с одной длине волны (sw2PE-STED) возбуждения и стимулированное излучение было применено для улучшения пространственного разрешения в срезах мозга 8 или в искусственных матриц с внедренными клеток 9, соответственно, в то же осевое разрешение в качестве стандартного TPLSM. Использование одного фотона STED, динамика дендритных шипиков могли быть отображены на поверхности коры головного мозга (до 10-15 глубины мкм) в живом Thy1 EGFP мыши с разрешением 67 нм 10. Универсальный инструмент для биологии развития обеспечивается мультифокальной структурированной подсветки микроскопии, которая обеспечивает двукратное улучшение 2Dразрешение. Однако этот метод может быть использован только в организмах с низкой склонностью рассеяния света, таких как рыба-зебра эмбрионов 11. Тем не менее, ни один из этих методов не может быть применен в высококвалифицированных рассеяния ткани взрослых животных в несколько сотен микрометров, которые имеют решающее значение модели для биомедицинских и клинических исследованиях заболеваний с начала после рождения.

Независимо от используемого приближения для расчета дифракционной волны форму передней части, то есть функции размытия точки (PSF), после фокусировки через объектив, ширина PSF вдоль оптической оси (резолюция осевая), по крайней мере в три раза больше, чем ширина PSF, перпендикулярной к оптической оси (пространственным разрешением) 12. Волнового фронта искажения различных порядков количественно коэффициентов Цернике в значительно изменить волнового фронта форму целенаправленной электромагнитной волны в визуализации глубокие ткани, ведущие к гораздо более крупных PSFs, особенно вдоль оптическойаль оси 13-15. Таким образом, оба законы дифракции и эффекты волнового фронта искажения указывают на разрешение вдоль оптической оси, что и ограничивающим фактором в области обработки изображений глубокие ткани. В то время как Наноскопия методы сосредоточиться на противодействии пределы дифракции только, технология, которая улучшает осевой разрешение и контрастность по противодействию как дифракцию и волнового фронта эффекты искажения необходим для прижизненной визуализации с высоким разрешением. В идеале, эта методика должна быть также достаточно быстро, чтобы позволить контролировать клеточной динамики.

В режиме реального времени коррекция ФСФ аберраций и потери контраста с помощью адаптивной оптики в TPLSM была тщательно изучена и улучшение в последнее десятилетие 13,14,16-18 и поэтому лучшими в настоящее время выбор ведет к более эффективному управлению баллистической возбуждения фотоны 14. Тем не менее, в связи с тем, что большинство волнового фронта коррекции подходов, используемых в адаптивной оптики носят итеративный и что они гаве повторить для небольших участков (несколько 10 х 10 мкм 2) в связи с высокой неоднородностью показателя преломления в ткани, скорость приобретения значительно ниже, чем необходимо для визуализации клеточной подвижности и связи. Кроме того, физический предел в адаптивной оптической улучшилось TPLSM по-прежнему определяется дифракции.

Пространственная модуляция освещения (SPIN) и временной модуляции на стороне обнаружения (плоские) были теоретически предлагается применять к лазерной сканирующей микроскопии, чтобы улучшить качество изображения. Их практическое применение в прижизненной визуализации еще предстоит продемонстрировали 19.

Взятые вместе, существует высокая потребность в разработке технологий, которые улучшают разрешение для глубокие ткани визуализации в живых взрослых животных. В этой работе, мы достигаем пространственной модуляции картины возбуждения контролируя процесс сканирования в многолучевой полосатый-подсветка многофотонное лазер-хконсервирование микроскопии (MB-СИ-MPLSM) 20. Вопреки структурированных подходов освещения, в которых раздел возбуждения крест луч пространственно-модулированных, мы используем только процесс сканирования для достижения пространственной модуляции возбуждения. Расширяя возбуждение в большей длиной волны, мы можем улучшить и пространственное разрешение и отношение сигнал-шум в глубокой ткани сильно рассеивающих тканей (например, лимфатический узел, путь свободного рассеяния 47 мкм 6), независимо от оптических нелинейный сигнал мы обнаруживаем, например флуоресценция, генерация второй гармоники или другой частоты смешивания явление. Используя этот подход на длинах волн возбуждения до 900 нм мы можем динамически изображения сотовой белковые структуры в масштабе нескольких молекул в зародышевых центрах мыши лимфатических узлов. Таким образом, мы можем лучше представить себе взаимодействие между антиген проведения единиц на поверхности фолликулярных дендритных клеток и В-клеток в процессе зондирования антиGen в течение иммунного ответа в вторичных лимфоидных органах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Настройка многолучевой для Полосатая-освещения TPLSM

Установка используется здесь является специализированным многолучевой двухфотонного лазерного сканирующего микроскопа, как описано выше 6,20. Система показано на рисунке 1. Подход может быть применен к другим двухфотонных лазерного сканирования микроскопов, которые способны синхронизировать приобретение камеры с движением galvoscanner зеркал, даже если они способны только выполнять сканирования однолучевой . В этом случае недостатком будет ниже скорость сбора, однако подобна скорости сбора в стандартном PMT основе TPLSM. Для достижения оптимального качества, насколько разрешение и контраст обеспокоены, на самом низком фотообесцвечивания и фотостарения и быстрого обнаружения, рекомендуется рассмотреть следующие шаги регулировка установки:

  1. Проверьте мощность лазера лазера Тиса: проверить на 100%, сравнить с заводских значений и Previoнам владеть показания и использовать его, как это, если длина волны возбуждения в диапазоне 700-1000 нм необходимо.
  2. Проверьте индикацию дистанционного управления для Ti: Sa расщепитель лучей, т.е. проверить 0% и настройки 100%. Если остальные Тиса пучка на 100%, а затем проверить и сбросить шаговый положение двигателя нулевой. Ti: Sa делитель луча состоит из низкого порядка λ / 2 пластины и поляризатор, который расщепляет перпендикулярно поляризованные лазерные лучи на перпендикулярных траекторий лучей: один направлен в микроскоп для возбуждения, другая используется для перекачки оптических параметрических генератор (ОПГ). По автоматически поворачивать λ / 2 пластины, непрерывный регулировку Ti: Sa и OPO власть, соответственно, достигается.
  3. Регулировка OPO до желаемой длины волны и измеряют выходную мощность. Если питание слишком низкое (с 4 W Ti: Sa лазер на 800 нм, нужно быть в состоянии получить 0,8-1 Вт ПГС луча в пределах 1050-1100 нм) оптимизировать волны накачки и проверьте настройки гоэ зеркало и из раздули кристалла. Выберите их рекомендуемые оптимальные значения, часто доступные как диаграмм и графиков, а затем точно настроить их, пока ОПГ не резонирует на желаемый результат волны а мощность возрастает.
    1. Если питание все еще остается низким, настроить два доступных зеркал ОПГ с четырьмя доступных зеркальных регулировки ручек. Сделать этот шаг очень медленно и в очень небольших движений, чередуя между передними и конечных зеркал.
  4. Убедитесь, что Ti: Sa и / или ПГС балки ударил входа зеркала на должном, центральное положение.
    1. Используйте кусок белой бумаги (не очень блестящей или отражающей!) И инфракрасная просмотра для наблюдения ОПГ луч и выше длины волны Ti: Sa балки.
      1. Носите защитные очки при работе с NIR Ti: Sa балки (обычно до 720-750 нм видна для среднего человека).
    2. Установите мощность лазера (ы) как можно ниже для процедуры выравнивания так, М.И.nimize потенциального повреждения глаз.
    3. Всегда держать номер в окружающей свет, так что зрачке сжимается.
    4. Имейте в виду, что мощность лазера прекрасно контролируемых аттенюаторами состоящих из λ / 2 пластины и поляризаторов, которые не являются в действительности же, когда Ti: Sa луч входит в скан-голову!
  5. Убедитесь, что точка входа диафрагма ударил в середине по Ti: Sa и / или ОПГ пучка; если нет, то отрегулируйте последние два зеркала перед лазерный луч попадает в голову сканирования.
    1. Используйте зрителя ИК и небольшой лист белой бумаги (но не блестящий / отражающей!).
    2. Всегда закрыть диафрагму при вступлении в микроскоп, так что положение лазерного луча можно судить более точно. Важно: Не забывайте, чтобы вновь открыть диафрагму прежде чем перейти к шагу 6!
  6. Отрегулируйте путь луча света отраженный лазерный в микроскоп соответственно. Сделайте это на небольшие сегменты и выполнять повторяющийся луча-ваlking.
    1. Проверьте всю оптического пути, если световой поток от объектива не является адекватным.
    2. Всегда проверяйте путь света при использовании системы в первый раз после долгого периода простоя, капитального ремонта, любой замены оптических элементов, или если проблемы подозреваются существовать с выходом.
  7. Убедитесь в том, что все активные оптические поверхности чистые, тем более, что они свободны от пыли! Если поверхности покрыты слоем пыли, фронт волны искажается даже перед входом в объектив, и полученный лазерный луч никогда не обеспечивает резкое изображение образца!
    1. При необходимости, чистить зеркала с сложенный лист для объективов, смоченной этанол или изопропанол.
  8. Убедитесь, что луч поступает обратно к зеркалу, который расположен непосредственно над зеркалом входа в конце компрессора импульсов на основе призм, после путь света установлен. Отсюда, луч отражается яНТО мультиплексора пучка (БМ).
  9. Убедитесь, что лазерный луч попадает на мембрану, которая находится у входа мультиплексора луча, непосредственно перед λ / 2 пластины, изменение поляризации лазерного луча, чтобы соответствовать требованиям, предъявляемым к широкополосным 50% передачи и 50% отражения в БМ.
    1. Во-первых, закрыть диафрагму так, что положение луча можно судить более точно и выполнять луча ходьбу между двумя мембранами, т.е. одна на входе в микроскоп, а другой на входе BM. Для других сканирующих микроскопов однолучевой диафрагма должна быть расположена на входе в ху-сканера.
    2. Если луч не попал в центр закрытое место апертуры, отрегулируйте вышеупомянутое зеркало, расположенное непосредственно перед входной диафрагмы BM. Важно: Не забывайте, чтобы вновь открыть диафрагму прежде чем перейти к шагу 10.
  10. С вновь диафрагма, проверить, если лазерный луч попадает на зеркала BM вих среднего точка. Используйте узкую полоску бумаги, чтобы не блокировать другую часть сложных световых путей БМ в!
  11. Проверьте, если луч попадает в середину между выходными зеркалами: сверху зеркало для параллельной поляризации "P", нижнее зеркало для перпендикулярной поляризации "S". Если нет, отрегулируйте зеркало входа перед BM.
  12. Убедитесь, что "S" и "Р" поляризованный пучок позволяет группы введите поляризатор куб и перекрываются соответственно при вступлении в ху-сканера. Перейти следующие действия в случае однолучевой сканирующий микроскоп используется.
  13. Убедитесь, что лазерный свет проходит централизованно сканирование и линзы трубки и получает через середину объектива 'задней фокальной плоскости. Важно: этот шаг должно быть сделано с лазерным лучом в центральном положении, не в состоянии парковки!
    1. Замените объектив с прицельной инструмента ("глаз быка") и проверить, если лазерный луч попадает в цель в середине, и является лиосвещение даже.
    2. Если это, кажется, так, закрыть диафрагму до BM и проверить, если появляется круглый интерференционная картина, с черным кругом в середине (вмешательство минимум).
      1. Отрегулируйте зеркало входа, если есть значительный сдвиг по отношению к центру яблочко.
  14. Теперь замените в яблочко с объективом, например с глубоководное погружение линзы 20X.
    1. Проверьте выходной световой поле с лист белой бумаги. Это должно быть ярким, однородным и по центру.
    2. Измерьте выходную мощность: при 100% ОПГ с 100% насосных Ti: Sa (4 Вт), человек должен получать примерно. 100-150 мВт после линзы в 1100 нм (в микроскоп используется здесь). Более низкие лазерные полномочия не хватит для выполнения многолучевой SI-TPLSM. Для сканирования однолучевой SI-TPLSM, 5-10 мВт достаточны. Лазерный луч должен оставаться в центральном положении, не будучи Scanneд!
  15. При выполнении MB-SI-TPLSM, совместите зеркала в BM следующим образом:
    1. Поставьте равномерно флуоресцирующий образец, например красный флуоресценции слайд, на сцене и фокусировки лазерного луча внутри образца, но рядом с верхней поверхности (т.е. близко к объективной линзы "спереди).
    2. Установите микроскоп в режим многолучевой и выбрать количество лучей, в начале, предпочтительно только один луч, и поляризацию, например, "P".
      1. Найти лазерный луч с помощью получения изображения флуоресцентного слайд: установить "P" затвор открытым и запустить ПЗС-камеры непрерывно в то время фокусировки пучка.
      2. Убедитесь, что луч находится в центральном положении, и что сканер выключен. Убедитесь, что луч не проверяется!
      3. Найти луч, глядя на яркое пятно вблизи центра чипа камеры.
      4. Сфокусировать луч, пока пятно не является самым ярким и острым, т.е. плоскости изображениямикроскоп соответствует положению чипа камеры; уменьшить мощность лазера так, что пятно не насыщен. С хорошо ориентированную систему это означает, что мощность лазера должна быть рядом с минимум при работе в режиме один-луча (около 0,6 мВт мощность лазера должна работать).
      5. Если пятно значительно ушла из центра, переместить его ближе к центру, регулируя зеркало перед БМ (или сканера для сканирования однолучевой).
      6. Когда же совместив другой поляризации, т.е. "S" луч, теперь переключиться в режим 2-лучевой, откройте "S" затвор и проверить положение луча (только один луч можно увидеть, если только "S" затвор открыт ).
      7. Когда это сделано, переключиться в режим 4-лучевой и использовать "P" режим поляризации ("P" затвора открытым). Теперь появится два бимлеты.
      8. Устройте два бимлеты быть совершенно параллельно нижнему краю зрения камеры, и установить для них составит 2,8 мкм друг от друга.
          Если они не выровнены, корректировать первый зеркало BM.
        1. Никогда не выровнять винт в середине, а не использовать две периферийные винты для перемещения зеркало, пока два луча не 2,8 мкм друг от друга и совершенно горизонтально.
      9. Теперь переключитесь в режим 8-лучевой в "P" поляризации, а также настроить второй BM зеркало (также без красной точкой), пока 4 бимлеты не равноудалены на 2,8 мкм, и расположены параллельно нижнему краю изображения.
      10. Повторите в 16 - и режим 32-луч, регулируя 3 и 4 BS зеркала, соответственно. Это важно для бимлеты быть на одинаковом расстоянии, потому что СИ-алгоритмы, самый простой являясь мин-макс (Хило) алгоритм, основаны на этом предположении.
  16. Замените равномерно флуоресцентного образца с гетерогенным структурированной одном, например кросс-окрашенных корней Convallaria.
    1. Перейти в парковочное положение пучка возбуждения, шHICH обычно располагаются на больших значений координат сканера, например, (10000; 10000).
    2. Сканирование (многолучевой) изображение с ПЗС-камерой. Убедитесь, что изображение станет четким, обмундирование, и прямой.
    3. Настройка камеры Если изображение поворачивается: крутить корпус камеры в осевом направлении вокруг вертикальной оси вручную (быть нежным!), Пока изображение не выпрямляется.
  17. Запуск XY-сканер, чтобы контролировать процесс сканирования для генерации шаблона возбуждения, т.е. полосатый изображения.
    1. В случае сканирования многолучевой, переместить зеркало Y-сканера, то есть. перпендикулярно к линии, бимлет таким образом, чтобы генерировать квадратичный полосатый изображения.
    2. Если поле зрения генерируются как описано на стадии 17.1. слишком мал, продлить процедуру сканирования, перемещая зеркало X-сканера в положение, обеспечивая, чтобы луч-LET линии удваивается и бимлеты равноудалены по всей линии. Повторите точное движениезеркала у-сканера после зеркало х-сканер перемещается генерировать большую полосатую изображение.
    3. В случае сканирования однолучевой, чередовать Y-сканер зеркало движение с х-сканера зеркало движения неоднократно на равном расстоянии позиций - определенных ученого - сформировать желаемый полосатый изображения.
    4. Убедитесь в том, чтобы использовать для движения у-сканера зеркало команд для постоянной скоростью (уменьшается разгон / торможение) и для х-сканера зеркала друг на максимальной скорости (максимальное ускорение / замедление).
  18. Автоматически приобрести и сохранить полосатый изображение с камеры (поле-детектор). Поэтому, синхронизировать камеру со сканером и использовать сканер в качестве главного триггера.
  19. Повторите приобретения полосатые изображения (протокол сканирования описаны в Протоколе 17), перемещая зеркало х-сканера в разных положениях следующим образом:
    1. Выберите достаточно шаги повторения и соответствующую длину шага междудва последующих полосатые изображения, чтобы покрыть расстояние между двумя последовательными бимлетов (в данном случае 2,8 мкм и один шаг из сканера зеркал равна 25 нм); может быть целесообразным, чтобы позволить немного перекрываются, т.е. дополнительный 0,3-0,4 мкм.
    2. Установите х сдвиг на значение, которое соответствует предел пространственным разрешением на данной длине волны. В качестве примера, используя 10 шагов зеркало X-сканера в смену и 12 или 13 сдвигов приводит к лучшим оба осевых и боковых результаты разрешением в этой системе. Проверьте со структурированной слайда, например Convallaria корней горкой, которая насчитывает работать лучше в системе используется.
    3. Оптимизация эти два значения, пока изображение Convallaria не станет самым резким: использовать инструмент профиля линии на расчетных изображений СИ и сравнить ширину профилей линий (которая является сигнал флуоресценции от клеточных стенок Convallaria).
    4. Приобретать каждый полосатый изображение синхронизированы с движением сканера и сохранить ее в отдельном, например
  20. Откройте полный набор полосатых изображений в качестве матриц, то есть 3D матрицы, в рутине оценки и использовать либо мин-макс алгоритм или алгоритм Фурье-преобразования для создания 2D матрицу высокого разрешения SI-изображения. Алгоритмы были ранее описаны подробно 20.

Мыши Иммунизация и подготовка к прижизненной визуализации

Эксперименты на животных были утверждены соответствующими государственными комитетами защиты животных (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit унд Soziales, Берлин) и были выполнены в соответствии с действующими принципами и правилами (животное эксперимент лицензия G0153/08).

  1. Индукция зародышевого центра в ответ подколенного лимфатического узла и подготовки области формирования изображения был выполнен, как описано выше 4. Очищают В-клетки immunomagnetically от селезенки В1-8 + / +- / -и В-клетки B1-8 + / +- / - GFP + мышей.
  2. Введите внутривенно 3 х 10 6 NP-специфических В-клеток с чистотой> 95% с использованием ⅛ B1-8 + / +- / - GFP + и ⅞ нефлуоресцентный B1-8 + / +- / - в C57BL / 6 получателей .
  3. На следующий день после клеточного переноса получателей иммунизации 10 мкг NP-CGG (нитрофенил-курица ɣ глобулин), эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (CFA) в правую заднюю пищевой площадку.
  4. Этикетка Fab фрагменты anti-CD21/CD35 антител с ATTO590-сукцинимидиловым эфиром.
    1. Чтобы подчеркнуть сеть фолликулярных дендритных клеток (FDC) в течение зародышевого центра в естественных условиях, вводят 10 мкг меченное флуорохромом Fab фрагментов в правую заднюю лапу из мышей 12-24 ч перед прижизненной анализ.

Следующие шаги должны быть Рассмотритекрасный для приготовления подколенного лимфатического узла для прижизненной визуализации (8-10 день после иммунизации):

  1. Обезболить мышь, внутрибрюшинной инъекции кетамина / ксилазина, количество в зависимости от их веса.
  2. Проверьте рефлексы контролировать глубину анестезии в течение всего периода обработки изображений.
  3. Бритье ног, спины и правый фланг мыши строгой и использовать для удаления волос, крем для удаления остатков волосы полностью.
  4. Fix правильный большого вертела: найти костлявую чип с пальцами, установите небольшой разрез кожи с ножницами, пока не появится маленький белый треугольный фасции.
  5. Зажмите костлявую чип под этой фасции с заостренными пинцетом этого фиксатор.
  6. Fix позвоночник в поясничной области с помощью зубчатых пинцет.
  7. Fix правую заднюю ногу на фиксатор и затяните винт.
  8. Лента хвост держать ногу в правильном положении.
  9. В хвостовой части бедра, создать разрез в коже, в области, где выдающийся подколенной вены и хоRS ткань, отделить кожу от подлежащих тканей с тупыми пинцетом и следовать подколенную вену от проксимальных к дистальным.
  10. Expose лимфатического узла с использованием тупых пинцет, старайтесь избегать резки, чтобы защитить мелкие лимфатические сосуды (держать лимфатический узел в PBS в течение подвергая).
  11. Создайте круг вакуумной смазки вокруг лимфатического узла, заполнить эту лужу с PBS.
  12. Положите покровное в своей позиции и поместите термометр-щуп (поддерживать температуру при 37 ° С, в противном случае скорость ячейка будет значительно варьироваться).
  13. Вдоль верхнего края покровным добавить круг вакуумной смазки.
  14. Поместите нагревательной катушки в своем положении на вакуумной смазки, создания уплотнения таким же образом, как и раньше, и добавить воды / PBS на покровным стеклом, чтобы опустить цели в.
  15. После обработки изображений, мышь хранится в анестезии, а при увеличении дозы кетамина / ксилазина к летальной дозой, а затем путем смещени шейных позвонков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Пространственное разрешение в лимфатических узлах

Размеры эффективной функции рассеяния точки (EPSF) соответствуют пространственным разрешением микроскопом 12. Мы измерили эту трехмерную функцию путем приобретения второго поколения гармоники сигнала коллагеновых волокон в лимфатических узлах нашей MB-SI-TPLSM по сравнению с установленными двухфотонными методов лазерной сканирующей микроскопии, т.е. TPLSM обнаружения поле (с помощью ПЗС-камеры) и TPLSM обнаружения точки (с помощью ФЭУ).

Из этих измерений становится очевидным, что на поверхности образца, оба боковые и осевые резолюции соответствуют ожидаемым значений, предсказываемых теорией дифракции 20. Тем не менее, с увеличением глубины обработки изображений и таким образом с увеличением оптический путь как возбуждения и излучения излучения через средства массовой информации с высоко изменяющимся показателем преломления, пространственное разрешение значительно ухудшается, независимо занятого установки (рис. 2). По MB-SI-TPLSM мы достигли, независимо от глубины изображения, ок. 20% лучше, латеральное разрешение и 220% лучше разрешение осевое по сравнению со стандартными подходами TPLSM.

Динамика иммунных комплексов на фолликулярных дендритных клеток в зародышевых центров

Клональная выбор В-клеток во время иммунного ответа, в течение вторичных лимфоидных органов взрослых мышей является первым шагом на пути к дифференцироваться в В-клеток памяти или клеток плазмы 4. В этом процессе, весьма динамическое взаимодействие между фолликулярной дендритных клеток (FDC) и В-клеток на уровне иммунной сложных структур (кластеров из нескольких белковых молекул) в пределах зародышевых центров, как полагают, играют центральную роль. Только с помощью высоко разрешающей технологию микроскопии прижизненный можно препарировать эту сотовую связь и его последствия для иммунной реакции. Наш подход МB-СИ-TPLSM предоставляет впервые возможность прижизненно визуализации и количественной оценки размеров кластеров иммунных сложных месторождений, помечены anti-CD21/35-Fab-ATTO590 на фолликулярных дендритных клеток, в до 120 глубиной мкм зародышевые центры из подколенных лимфатических узлов (фиг.3А и 3В). В то время как такие структуры не видны стандартными подходами TPLSM, мы могли идентифицировать их по отдельности и даже визуализировать их динамику, используя наш подход. Цифры 3e и 3f поддерживает эту мысль, показывая прямое сравнение между 3D-флуоресценции изображение депозитов иммунных клеток в зародышевом центре как приобретена обычной TPLSM (ФЭУ основе) и MB-СИ-TPLSM. Кроме того, взаимодействие иммунных сложных месторождений с зародышевого центра В-клеток может быть весьма решены (рис. 3С и 3D; Фильмы 1 и 2), и теперь может быть яnvestigated в сочетании с прижизненных функциональных проб для пролиферации, дифференцировки или апоптоза. На следующем этапе мы будем использовать наш подход также исследовать динамический связь зародышевых В-клеток с Т-хелперов, как полагают, составляют другой решающую явление для В-клеток клонального отбора в вторичных лимфоидных органах.

Рисунок 1
.. Рисунок 1 Принцип и настройка на многолучевой полосатый-освещения двухфотонного лазерного сканирующего микроскопа Луч перестраиваемой фс-импульсного Ti: Sa лазера (диапазон длин волн 690-1,080 нм, 140 фс, 80 МГц), ослабляется модулем, выполненной из λ / 2 пластины и тонкопленочного поляризатора, его импульсы предварительно сжатый в модуле GVD-компенсации на основе призмы и, наконец, разделена на 2, 4, 8, 16, 32, 64 или балки,образуя бимлет линию. Два последовательных бимлеты в пределах линии имеют перпендикулярные поляризации (обозначенный красным и зеленым в бимлет линия) и смещены во времени, чтобы избежать помех. Время сдвига между двумя последовательными бимлетов составляет 3 пс. Для получения изображений, бимлет линия ориентирована в образец линзой объектива (20X погружением в воду линзы объектива, Н. А. 0.95, WD 2 мм) и перпендикулярно сканирования, так что четко определенный журнал шаблон генерируется. Эта модель переводится вдоль бимлет линии. Серия изображений генерируется таким образом обнаруживаются через интерференционных фильтров, установленных на диск фильтров с помощью ЭМ-ПЗС-камеры и, наконец, оценены Minimum-Maximum алгоритма. Однолучевая TPLSM на основе ФЭУ-обнаружения проводили с тем же микроскопом. В этом случае, мы использовали только один лазерный луч для сканирования образца, и мы спектрально решен сигнала флуоресценции с соответствующими дихроичных зеркал и интерференционных фильтров, прежде чем обнаружитьING его с фотоумножителями. Кроме того, вместо Ti:. Sa лазерного луча, луч оптического параметрического генератора может быть соединен с микроскопом, чтобы выполнить длинноволновую MB-SI-TPLSM Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Пространственное разрешение многолучевой полосатый-освещения TPLSM по сравнению со стандартным ПМТ-основе и мультифокальной CCD основе TPLSM. (А) Характерные профили осевые а также ху и XZ проекции ГВГ в коллагеновых волокон в 100 глубиной мкм в лимфе узел. lexc = 900 нм, длина волны Дальность обнаружения 447 ± 30 нм, поток фотонов Φ = 4,75 х 10 2 · сек. (Б) желто-зеленый бисер флуоресцентных встроенные в агарозы как записано MB-SI-TPLSM и обычной TPLSM (SB-PMT). λ отл = 850 нм, длина волны Дальность обнаружения 525 ± 25 нм, поток фотонов Φ = 2,08 х 10 29 фотонов / см 2 · сек, блок сетки = 3,7 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3 прижизненной визуализации зародышевых центров по MB-SI-TPLSM (а) 3D флуоресценции образ света зоне зародышевого центра, помеченного CD21/35-Fab-ATTO590 (красный) в мышей, иммунизированных haptene -.. Куриных γ -GLobulin (NP-CGG) после приемной передачи В1-8 EGFP + B клеток (зеленый). Иммунные комплексные месторождения (CD21/35 маркировки) на фолликулярных дендритных клеток (FDC) могут быть визуализированы в отдельности, как это наблюдается в детальном (а) (б) изображения, и есть (как боковые и осевые) размеры в диапазон 400-800 нм до 120 глубиной мкм. Зародышевых центров В-клеток в иммунизированного B1-8 EGFP + мышь обнаружены (с), в то время как контакты (D) частично ответственными за созревании иммунной реакции могут теперь также быть визуализированы. λ отл = 850 нм, длина волны Дальность обнаружения 605 ± 20 нм (ATTO590) и 525 ± 25 нм (EGFP), поток фотонов Φ = 7.05 х 10 28 фотонов / см 2 · сек. Шкала бар (а) 20 мкм, (б) 10 мкм, (в) 30 мкм, (г) 10 мкм. 3D флуоресцентные изображения одного и того же района вСветлая зона из зародышевого центра, помеченного CD21/35-Fab-ATTO590 как записано MB-SI-TPLSM (е) и обычной (ПМТ-основе) TPLSM (е), соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура.

Фильм подписи

Фильм-1 и -2

Динамика иммунных комплексных месторождений на вторичных фолликулов дендритных клеток (FDC) и их взаимодействие с зародышевого центра В-клетках, записанного MB-SI-TPLSM. Иммунные комплексные месторождения помечены CD21/35-Fab-ATTO590 (красный), тогда как зародышевых центр В-клетки В1-8 Jk - / - EGFP + клеток (зеленый).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Цель прижизненной оптических изображений является динамически и функционально визуализировать сотовой моторику и взаимодействия, чтобы понять ткани и функции органов в норме и при патологии 5. Наиболее мощная технология для достижения этой, многофотонной лазерной сканирующей микроскопии, еще предстоит преодолеть ограничения, связанные с волновые фронты искажения, рассеяние, медленное приобретение, фотообесцвечивания и фотоповреждения, которые ограничивают его пространственное разрешение, контрастность, а также его временным разрешением .

Есть два успешные решения для достижения лучшего возбуждение (и выбросов) управление фотона в глубоких тканей приводит к лучшим пространственным разрешением, увеличение контрастности (увеличение соотношения сигнал-шум, в связи с увеличением сигнала) и, таким образом, уменьшается фотообесцвечивание и фотоповреждение : подходы адаптивно-оптика и использование более длинных волн возбуждения - перестраиваемый ИК возбуждения 6. В последнее десятилетие, концепция волнового фронта соотводств по адаптивной оптики было передано от астрономии до био-оптических изображений, а также многофотонной микроскопии. В то время как первый Адаптивная оптика подходит для двухфотонного микроскопии опирался на волнового фронта зондирования и необходимой ссылку subdiffraction, т.е. "Руководство звезда", похожий на астрономии, современные системы лучше подходят для глубокие ткани визуализации 12. Например, они используют когерентности-стробирования возбуждающего излучения для волнового фронта зондирования 13,15, или они не используют никаких внешних волнового фронта зондирования на всех, но разработка алгоритмов адаптации основаны либо на взаимной корреляции изображений после ученик сегментации 17 или на итерационного стохастического поиска идеальных параметров и последующего вмешательства в нескорректированного изображения как, полученной из предыдущей итерации - IMPACT 16, или они используют фото-акустические характеристики волнового фронта искажения и эффекты рассеяния 20. Тем не менее, из-за весьма различной Refrактивный индекс в ткани, адаптивные подходы оптика довольно медленно, так как шаг коррекции должен быть повторен для относительно небольших участков (около 10 х 10 мкм 2) 16. Кроме того, либо волнового фронта или коррекции эффекта рассеяния, максимально достижимая пространственное разрешение по-прежнему ограничивается дифракции.

Наш подход способен частично преодолеть тяготы волнового фронта аберрации и рассеяния, но и толкает разрешение вне дифракционного предела. Использование объективы с более высокой числовой апертурой, абсолютные значения для осевого разрешением может улучшить до примерно 400 нм 20. Цена на улучшение резолюции является круче распад отношения сигнал-шум в глубокой ткани по сравнению с обычными TPLSM. Это связано с необходимостью использовать обнаружение поля в MB-SI-TPLSM. Как было показано выше 15, использование полевых детекторов вместо точечных детекторов связан с этой крутой распада SNR дюэ к более сильному рассеянию излучаемого света, которая имеет отношение только для обнаружения поля. Таким образом, максимальная глубина визуализации для методов TPLSM обнаружения полевых составляет ок. 25% снижена по сравнению с обычным (т.е. обнаружения точки основе) TPLSM. Прямое практическое решение заключается в применении более длинные волны возбуждения и обнаружить более длинные волны излучения. Естественно, это повышает глубину в зависимости от SNR в обычных TPLSM в той же степени, что и в MB-SI-TPLSM.

Насколько скорость сбора, то, MB-СИ-TPLSM ограничивается только скоростью гальванометрической сканера и / или по считывания камеры и прибыли расщепления луча до 32 лазерный луч позволяет. По сравнению со стандартной многолучевой камеры на основе TPLSM, MB-SI-TPLSM немного медленнее из-за необходимости не только для сканирования, но и синхронно приобрести каждый из прибл. 10 полосатый подсветкой изображения для создания окончательного изображения с высоким разрешением. Тем не менее, наша техника сохраняет клухо преимущество в скорости по сравнению с обычным TPLSM (на основе сканирования однолучевой и обнаружения точки). Таким образом, время приобретение 150 х 150 мкм 2 (512 х 512 пикселя) является 841 мс, используя обычные TPLSM (частота развертки 800 Гц) и 109 мс, используя MB-SI-TPLSM. Таким образом, энергия возбуждения в пучке и время выдержки на пиксель такие же, как для обычных и MB-Si TPLSM, так что сигнал сопоставима для обоих установок. Как было показано ранее 20, фотообесцвечивания и эффекты фотостарения в МБ-СИ-TPLSM экспериментов низки и сопоставимы с хорошо выполненной обычным TPLSM.

В будущем было бы желательно объединить взаимодополняющие подходы адаптивного оптики и полосатый-подсветкой в инфракрасном диапазоне для дальнейшего улучшения прижизненной TPLSM, похожие на достижения в адаптивной оптики для структурированного-подсветкой 21. Однако для того, чтобы достичь этих целей, значительно быстрее адаптивной оптики подходыдолжны быть разработаны.

Ожидаемая высокая ударная подхода полосатый-освещения для биологических наук и биомедицины заключается в его способности, чтобы улучшить разрешение и повышения контраста в глубокие ткани, противодействуя искажение волнового фронта и эффекты рассеяния, но и выйти за пределы дифракции в лазерных сканирующих микроскопов, по просто контролируя процесс сканирования и выборе соответствующего чувствительный детектор поля.

Ожидаемая высокая ударная подхода полосатый-освещения для биологических наук и биомедицины заключается в его способности, чтобы улучшить разрешение и повышения контраста в глубокие ткани, противодействуя искажение волнового фронта и эффекты рассеяния, но и выйти за пределы дифракции в лазерных сканирующих микроскопов, по просто контролируя процесс сканирования и выборе соответствующего чувствительный детектор поля.

Подход полосатый-подсветка может применяться для прижизненной глубокие ткани имстарения во всех двухфотонными лазерных сканирующих микроскопов, которые способны синхронизировать обнаружения камеры с движением galvoscanner в сканировании однолучевой. В этом случае отдельные полосы в шаблоне возбуждения генерируются последовательно, а не одновременно, как в MB-SI-TPLSM. Использование сканирования одного луча в SI-TPLSM мы, естественно, ожидаем немного меньшую скорость приобретения флуоресцентные изображения по сравнению с обычными TPLSM (сканирования один луч, точка детектора на основе TPLSM), но то же улучшения пространственного разрешения и контрастности, а демонстрировались MB- SI-TPLSM. Нижняя скорость сбора вместе с ограничением по глубине изображения значительно снижает диапазон применения однолучевой SI-TPLSM по сравнению с MB-SI-TPLSM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Фолькер Андресен является акционером LaVision Biotec GmbH, Билефельд, Германия. Другие авторы не имеют никаких конфликтов интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Р. Heintzmann за плодотворные обсуждения в ходе разработки подхода полосатый-освещения, К. Rajewsky и А. Хаберман для обеспечения C57BL / 6 В1-8 GFP трансгенных мышей. Мы признаем Deutsche Forschungsgemeinschaft по гранту NI1167/3-1 (РН), HA5354/4-1 и SFB633, проект A15 (к AEH), Шарите под гранта Рахель-Хирша общения (к RN) за финансовую поддержку. Мы особо отметить сетевой Jimi за плодотворные обсуждения и инфраструктурной поддержки

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATTO590 – NSH for coupling ATTO Tec, Germany AD-590-35
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 DRFZ, Berlin The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+ Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment  StemmCell Technologies, Germany 19854
Polystyren beads (605), 0.2 µm Life Technologies, Germany F8803
Equipment
TriMScope I LaVision Biotec, Bielefeld, Germany
OPO (manual version) APE, Berlin, Germany
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II Coherent, Duisburg, Germany
Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm Olympus Germany, Hamburg, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, (4951), 73-76 (1990).
  2. Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, (3), 424-436 (2010).
  3. Esplugues, E., et al. Control of Th17 cells occurs in the small intestine. Nature. 475, (7357), 514-518 (2011).
  4. Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, (5), 655-667 (2007).
  5. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
  6. Herz, J., et al. Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator. Biophys. J. 98, (4), 715-723 (2010).
  7. Hell, S. W., Rittweger, E. Microscopy: Light from the dark. Nature. 461, (7267), 1069-1070 (2009).
  8. Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy. Neuron. 63, (4), 429-437 (2009).
  9. Bianchini, P., et al. Single-wavelength two-photon excitation - stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, (17), 6390-6393 (2012).
  10. Berning, S., et al. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335, (6068), 551 (2012).
  11. York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).
  12. Gu, M. Advanced optical imaging. Springer Verlag. Berlin. (2001).
  13. Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy. J. Biomed. Opt. 15, (4), (2010).
  14. Booth, M. J. Adaptive optics in microscopy. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).
  15. Niesner, R., et al. The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging. Biophys. J. 93, (7), 2519-2529 (2007).
  16. Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).
  17. Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, (22), 8434-8439 (2012).
  18. Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues. Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).
  19. Lu, J., et al. Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation. Nano Lett. 9, (11), 3883-3889 (2009).
  20. Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS ONE. 7, (12), (2012).
  21. Debarre, D., et al. Adaptive optics for structured-illumination. Opt. Exp. 16, (13), 9290-9305 (2008).
Высоко Решено Прижизненные Полосатый-подсветка микроскопия зародышевых центров
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).More

Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter