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Immunology and Infection

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

doi: 10.3791/51135 Published: April 9, 2014
* These authors contributed equally

Summary

De alta resolución de imagen intravital con mejor contraste de hasta 120 m de profundidad en los ganglios linfáticos de ratones adultos se consigue modular espacialmente el patrón de excitación de un multi-focal del microscopio de dos fotones. En 100 m de profundidad se midió resoluciones de 487 nm (laterales) y 551 nm (axial), eludiendo así los límites de dispersión y difracción.

Abstract

Control de la comunicación celular por intravital de tejido profundo de múltiples fotones microscopía es la clave para entender el destino de las células inmunes dentro de muestras de tejido de espesor y órganos en la salud y la enfermedad. Al controlar el patrón de exploración en microscopía de múltiples fotones y la aplicación de algoritmos numéricos apropiados, hemos desarrollado un enfoque de rayas-iluminación, lo que nos permitió lograr 3 veces mejor resolución axial y la mejora de la relación señal a ruido, es decir el contrario, en más de 100 profundidad del tejido micras dentro altamente dispersante tejido de los órganos linfoides en comparación con la microscopía de multi-estándar de fotón. La velocidad de adquisición, así como photobleaching y fotolesiones efectos fueron similares a la técnica basada en la foto-multiplicador estándar, mientras que la profundidad de formación de imágenes era ligeramente inferior debido a la utilización de detectores de campo. Utilizando el enfoque de la iluminación de rayas, somos capaces de observar la dinámica de los depósitos de complejos inmunes en las células dendríticas foliculares secundarias ̵1; en el nivel de un par de moléculas de proteína en los centros germinales.

Introduction

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Dos fotones de láser microscopía de barrido (TPLSM), con sus ventajas para la formación de imágenes de los tejidos profundos relacionados con infrarrojos ultracorto excitación pulsada 1, ha revolucionado nuestra visión sobre los procesos vitales a nivel de células individuales mediante la revelación de la motilidad y la interacción de los diversos patrones subconjuntos de células en animales vivos 2-5. Sin embargo, la tecnología actual sigue siendo insuficiente para esclarecer los mecanismos de la función del órgano y la disfunción, como requisito previo para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, ya que hace sólo escasa información acerca de las bases moleculares de la respuesta celular en los tejidos en la salud y la enfermedad. La tecnología actual permite sólo una ventana espacial de unos pocos cientos de micras debido a la dispersión y la onda efectos de distorsión del frente sobre la resolución espacial y la relación señal-ruido 6, que son particularmente evidentes en el tejido altamente compacta de animales adultos. Estos dispersión y oleaje efectos de distorsión del frente se deben a una una gran heterogeneidadd distribución anisotrópica del índice de refracción en el tejido, lo que en un primer paso a un deterioro dependiente de la profundidad de la resolución espacial en 3D y finalmente a la pérdida total de la señal procedente de los fotones de excitación balísticos, es decir, la pérdida de la relación señal-ruido. En términos de biocientífico y aplicaciones de tejido profundo biomédicas, esto significa que la tecnología actual no puede revelar de manera inequívoca la comunicación celular causa una pobre resolución daría lugar a interacciones falsamente positivos, mientras que la disminución de la relación señal-ruido podría provocar que el sistema pasa por alto algunos interacciones entre estructuras tenues.

Con el fin de detectar inequívocamente las interacciones celulares en una forma dinámica, se necesita una resolución espacial muy mejorada profunda dentro del tejido. Las técnicas Nanoscopia potentes introducidos actualmente basándose en algoritmos numéricos especiales, por ejemplo, enfoques estructura de iluminación, en el agotamiento del primer estado excitado, por ejemplo, por ejemplo dSTORM, PALM, han encontrado muchas aplicaciones en las células fijadas, así como en cultivos de células en vivo 7. Sin embargo, con el fin de extender estas aplicaciones para secciones de tejidos, los tejidos vivos y organismos que todavía tenemos que superar las dificultades técnicas severas. Excitación de dos fotones Sted con diferentes longitudes de onda, así como con una sola longitud de onda (sw2PE-STED) para la excitación y la emisión estimulada se ha aplicado para mejorar la resolución lateral en rodajas de cerebro de 8 o en matrices artificiales con células embebidas 9, respectivamente, en la misma resolución axial como TPLSM estándar. Uso de un fotón STED, la dinámica de las espinas dendríticas podrían ser reflejados en la superficie de la corteza cerebral (hasta 10-15 m de profundidad) en un ratón vivo Thy1 EGFP a una resolución de 67 nm 10. Una herramienta versátil para la biología del desarrollo es proporcionada por el multifocal microscopía estructurada-iluminación, que proporciona doble mejorado 2Dresolución. Sin embargo, esta técnica sólo se puede utilizar en organismos con una baja propensión de dispersión de la luz, tales como embriones de pez cebra 11. Sin embargo, ninguna de estas técnicas se puede aplicar en el tejido altamente dispersión de animales adultos en varios cientos de micrómetros, que son modelos importantes para la investigación biomédica y clínica de las enfermedades con inicio después del nacimiento.

Independiente de la aproximación utilizada para calcular la forma de onda frontal de difracción limitada, es decir, la función de dispersión de punto (PSF), después de enfocar a través de una lente, la anchura de la PSF a lo largo del eje óptico (resolución axial) es al menos tres veces más grande que la anchura de fibras discontinuas de poliéster perpendicular al eje óptico (resolución lateral) 12. Ola distorsiones del frente de diferentes órdenes cuantificados por los coeficientes de Zernike modificar considerablemente la forma del frente de onda de la onda electromagnética enfocada en imágenes de tejido profundo que conduce a mucho más grandes PSF, en especial a lo largo de la ópticaal eje 13-15. Por lo tanto, tanto las leyes de difracción y los efectos de distorsión del frente de onda apuntan a la resolución a lo largo del eje óptico tal como el factor limitante en la formación de imágenes de tejido profundo. Considerando que las técnicas de Nanoscopia se centran en contrarrestar los límites de difracción sólo, se necesita una tecnología que mejora la resolución y el contraste al contrarrestar tanto la difracción y los efectos de distorsión de la onda frontal axial para intravital de imágenes de alta resolución. Lo ideal sería que esta técnica debe ser también lo suficientemente rápido como para permitir el seguimiento de la dinámica celular.

La corrección en tiempo real de las aberraciones de PSF y pérdida de contraste usando óptica adaptativa en TPLSM ha sido ampliamente estudiado y mejorado en la última década 13,14,16-18 y por lo tanto es la mejor opción disponible en la actualidad conduce a una mejor gestión de la excitación balístico aquellos fotones 14. Sin embargo, debido al hecho de que la mayor ola de corrección frente a los enfoques utilizados en óptica adaptativa es iterativo y que HÃve que ser repetido para áreas pequeñas (unos pocos 10 x 10 m 2) debido a la alta heterogeneidad del índice de refracción en el tejido, la velocidad de adquisición es significativamente menor que la necesaria para la motilidad celular de formación de imágenes y la comunicación. Por otra parte, el límite físico de adaptación óptica mejorada TPLSM todavía está determinado por difracción.

La modulación espacial de la iluminación (SPIN) y modulación temporal en el lado de detección (PALA) se han propuesto teóricamente para ser aplicado a la microscopía de escaneo láser para mejorar la resolución. Su aplicación práctica en intravital de imágenes aún queda por demostrar 19.

En conjunto, hay una gran demanda para el desarrollo de las tecnologías, que mejoran la resolución de imágenes de tejido profundo en vivir los animales adultos. En este trabajo, logramos modulación espacial del patrón de excitación mediante el control del proceso de digitalización en la multi-haz-iluminación rayas multi-fotón láser-smicroscopía enlatado (MB-SI-MPLSM) 20. Contrariamente a los enfoques iluminación estructurada, en la que la sección transversal del haz de excitación se modula espacialmente, utilizamos solamente el proceso de exploración para lograr la modulación espacial de la excitación. Con la ampliación de la excitación a una longitud de onda más larga, que son capaces de mejorar la resolución espacial y la relación señal-ruido en profundidad de los tejidos de alta dispersión de tejido (por ejemplo, los ganglios linfáticos, el camino libre dispersión de 47 m 6), independientemente de la óptica señal no lineal que detectamos, por ejemplo, fluorescencia, segunda generación armónica u otra frecuencia de mezcla fenómeno. El uso de este enfoque en longitudes de onda de excitación de hasta 900 nm podemos imagen dinámicamente las estructuras de proteínas celulares en la escala de pocas moléculas en los centros germinales de los ganglios linfáticos de ratón. Por lo tanto, podemos visualizar mejor la interacción entre unidades de antígeno llevar en la superficie de las células dendríticas foliculares y células B en el proceso de sondeo de la lucha contraGen durante la respuesta inmune en los órganos linfoides secundarios.

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Protocol

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Configuración multihaz para TPLSM rayas-iluminación

La configuración se utiliza aquí es un multi-haz de dos fotones microscopio especializado de escaneo láser, como se describió previamente 6,20. El sistema se ilustra en la Figura 1. El enfoque se puede aplicar a otros microscopios de barrido láser de dos fotones, que son capaces de sincronizar la adquisición de la cámara con el movimiento de los espejos galvoscanner, incluso si sólo son capaces de realizar el escaneo de un solo haz . En este caso, la desventaja será una velocidad de adquisición menor, sin embargo similar a la velocidad de adquisición en TPLSM basado en PMT estándar. Con el fin de conseguir una calidad óptima la medida en que la resolución y el contraste se refiere, en el fotoblanqueo más bajo y el daño solar y la adquisición más rápida, es recomendable tener en cuenta los siguientes pasos de ajuste de la configuración:

  1. Compruebe la potencia del láser del láser Tisa: controlar al 100%, comparar con los valores originales de fábrica y Previonosotros poseemos lecturas y lo usamos como es si una longitud de onda de excitación en el rango de 700-1.000 nm es necesario.
  2. Pruebe la indicación de control remoto para el Ti: Sa divisor de haz, es decir, comprobar el 0% y 100% de los ajustes. Si hay una viga TISA restante al 100%, a continuación, comprobar y restablecer la posición nula motor paso a paso. El Ti: Sa divisor de haz se compone de una placa λ / 2 de orden inferior y un polarizador, que divide los rayos láser perpendicularmente polarizados sobre trayectorias de rayos perpendiculares: uno se dirige a través del microscopio para la excitación, el otro se utiliza para bombear el paramétrico óptico oscilador (OPO). Por rotación automática de la placa λ / 2, un ajuste continuo de la Ti: Sa y el poder OPO, respectivamente, se consigue.
  3. Ajuste el OPO a la longitud de onda deseada y medir la potencia de salida. Si la potencia es demasiado baja (con un 4 W Ti: Sa láser a 800 nm, uno debe ser capaz de obtener 0.8-1 W de haz OPO alrededor de 1,050-1,100 nm) optimizar la longitud de onda de bombeo y compruebe la configuración de the espejo y el cristal de avivado. Elija sus valores recomendados óptimas, a menudo disponibles como gráficos o tablas, y luego afinar ellos hasta el OPO resuena en la salida de longitud de onda deseada y la potencia aumenta.
    1. Si el poder es todavía bajo, ajuste los dos espejos accesibles del OPO con los cuatro botones de espejo de ajuste accesibles. Haga este paso muy lentamente y con movimientos muy pequeños, alternando entre los espejos laterales y frontales.
  4. Compruebe que el Ti: Sa y / o OPO vigas golpeó los espejos de entrada en la posición adecuada, central.
    1. Use un pedazo de papel blanco (no muy brillante o reflectante!) Y un visor de infrarrojos para observar el haz OPO y el de mayor longitud de onda Ti: Sa vigas.
      1. Use gafas protectoras cuando se trabaja con NIR Ti: Sa vigas (por lo general hasta 720 a 750 nm es visible para la persona promedio).
    2. Ajuste la potencia (s) láser lo más bajo posible para el proceso de alineación con el fin de MIsignifica quitar importancia a los daños potenciales de los ojos.
    3. Siempre mantenga las luces del ambiente de la sala en adelante, de manera que se estrecha la pupila del ojo.
    4. Tenga en cuenta que la potencia del láser es bien controlado por atenuadores consisten de una placa y polarizadores λ / 2, que aún no están en vigor cuando el Ti: Sa rayo entra en la exploración de la cabeza!
  5. Compruebe que el diafragma de punto de entrada es golpeado en el medio por el Ti: Sa y / o OPO haz; si no es así, ajuste los dos últimos espejos antes de que el rayo láser entra en la cabeza de la exploración.
    1. Utilice el visor de infrarrojos y un pequeño trozo de papel blanco (pero no brillante / reflexiva!).
    2. Siempre cerrar el diafragma, en la entrada en el microscopio, de manera que la posición del haz láser se puede juzgar con más precisión. Importante: No se olvide de volver a abrir el diafragma antes de proceder al paso 6!
  6. Ajustar el recorrido de la luz del haz láser reflejado en el microscopio en consecuencia. Haga esto en pequeños segmentos y realizar iterativo viga-walking.
    1. Revise toda la trayectoria de la luz, si la salida de luz de la lente del objetivo no es la adecuada.
    2. Compruebe siempre la trayectoria de la luz cuando se utiliza el sistema por primera vez después de un largo período de inactividad, una reparación mayor, la sustitución de los elementos de óptica, o si se sospecha de la existencia de problemas con la salida.
  7. Asegúrese de que todas las superficies ópticas activas están limpios, en especial de que están libres de polvo! Si las superficies están cubiertas con una capa de polvo, el frente de onda se distorsiona incluso antes de entrar en la lente del objetivo y el haz de láser resultante nunca entregará una imagen nítida de la muestra!
    1. Si es necesario, limpie los espejos con un trozo de papel doblado de la lente, humedecido con etanol o isopropanol.
  8. Compruebe que el haz llega de vuelta al espejo que se encuentra directamente por encima del espejo de entrada en el extremo del compresor de impulsos basado en prisma, después de la trayectoria de la luz se establece. Desde aquí, el haz se refleja into multiplexor viga (BM).
  9. Compruebe si el haz de láser incide en el diafragma que se encuentra en la entrada del multiplexor de haz, directamente antes de la placa λ / 2, el cambio de la polarización del haz de láser para adaptarse a los requisitos para una amplia banda de transmisión 50% y 50% de reflexión dentro del BM.
    1. En primer lugar, cerrar el diafragma de manera que la posición del haz se puede juzgar con más precisión y realizar haz de pie entre los dos diafragmas, es decir, el uno en la entrada en el microscopio y el otro a la entrada BM. Para otros microscopios de barrido de un solo haz el diafragma debe estar ubicado en la entrada en el xy-scanner.
    2. Si el haz no golpeó el centro de la abertura cerrada hacia abajo, ajustar el espejo antes mencionado, colocado directamente antes de la entrada de diafragma BM. Importante: No se olvide de volver a abrir el diafragma antes de proceder al paso 10.
  10. Con el diafragma abierto de nuevo, compruebe si el haz láser incide en los espejos en BMsu medio punto. Utilice una tira estrecha de papel para que no se bloquee otra parte del complejo-luz de los caminos del BM!
  11. Compruebe si el rayo golpea el centro de los espejos de salida: top Espejo para la polarización paralela "P", espejo de la parte inferior para la polarización perpendicular "S". Si no es así, ajuste el espejo de entrada antes de que el BM.
  12. Compruebe si la "S" y "P" haz polarizado permite a los grupos entran en el cubo polarizador y se solapan adecuadamente a la entrada en el xy-scanner. Saltar estos pasos en caso de que se utilizó un microscopio de barrido de un solo haz.
  13. Compruebe si la luz láser pasa centralmente la exploración y las lentes de tubo y se pone por el centro de la lente del objetivo "plano focal posterior. Importante: este paso se tiene que hacer con el rayo láser en la posición central, y no en una posición de estacionamiento!
    1. Vuelva a colocar la lente objetivo con una herramienta con el objetivo ("ojo de buey") y compruebe si el haz láser en el objetivo en el medio, y si ella iluminación es uniforme.
    2. Si esto parece ser el caso, cerrar la abertura antes de que el BM y compruebe si aparece un patrón de interferencia circular, con un círculo negro en el medio (mínimo de interferencia).
      1. Ajuste el espejo de entrada si hay un cambio significativo en relación con el centro de la diana.
  14. Ahora reemplace el ojo del toro con una lente de objetivo, por ejemplo, con un objetivo de inmersión en agua de 20X.
    1. Compruebe el campo de luz de salida con un trozo de papel blanco. Esto debe ser brillante, uniforme y en posición central.
    2. Medir la potencia de salida: 100% OPO con un 100% de bombeo Ti: Sa (4 W), se debe obtener aprox. 100-150 mW después de la lente a 1.100 nm (en el microscopio usado aquí). Potencias de láser más bajos no serán suficientes para la realización de múltiples haces SI-TPLSM. Para el escaneo de un solo haz SI-TPLSM, 5-10 mW son suficientes. El haz de láser debe permanecer en la posición central sin ser scanned!
  15. Si se realiza la MB-SI-TPLSM, alinear los espejos en el BM de la siguiente manera:
    1. Coloque una muestra homogénea fluorescente, por ejemplo, una diapositiva fluorescencia roja, en el escenario y enfocar el haz de láser dentro de la muestra, pero cerca de la superficie superior (es decir, cerca de la parte frontal de la lente objetiva ').
    2. Ajuste el microscopio para el modo multi-haz y elegir el número de vigas, al comienzo, preferiblemente sólo un haz, y la polarización, por ejemplo "P".
      1. Encuentra el rayo láser formando la imagen de la diapositiva fluorescente: ajuste el obturador "P" abrir y ejecutar la cámara CCD continuamente mientras enfocar el haz.
      2. Asegúrese de que la viga está en la posición central, y que el escáner está apagado. Asegúrese de que el haz no es escaneada!
      3. Encuentra la viga mediante la búsqueda de un punto brillante cerca del centro de la viruta de la cámara.
      4. Enfoque el haz hasta que el punto es el más brillante y más aguda, es decir, el plano de la imagen deel microscopio corresponde a la posición del chip de la cámara; disminuir la potencia del láser de manera que el punto no está saturado. Con un sistema bien alineados, esto significa que la potencia del láser tiene que estar cerca del mínimo cuando se trabaja en el modo de un solo haz (alrededor de 0,6 mW de potencia láser debería funcionar).
      5. Si la mancha es significativamente fuera del centro, moverlo más cerca del centro, ajustando el espejo frente al BM (o del escáner para la digitalización de un solo haz).
      6. Cuando también la alineación de la otra polarización, es decir, "S" viga, ahora cambiar al modo de 2 haces, abra el obturador "S" y marque la posición del haz (sólo un haz de luz puede ser visto si sólo el obturador "S" está abierto ).
      7. Cuando haya terminado, cambie al modo de 4 haces y utilice el modo "P" de polarización (shutter "P" abierta). Ahora aparecerán dos beamlets.
      8. Organizar los dos beamlets sean perfectamente paralelos al borde inferior de la vista de la cámara, y los puso a un 2,8 micras de separación.
          Si no están alineados correctamente, ajuste el primer espejo del BM.
        1. Nunca alinear el tornillo en el medio, en lugar de utilizar los dos tornillos periféricos para mover el espejo hasta que los dos haces son 2,8 um aparte y perfectamente dispuestos horizontalmente.
      9. Ahora cambiar al modo de 8-haz en la polarización "P", y ajustar el segundo espejo BM (también sin el punto rojo) hasta los 4 haces elementales son equidistantes a 2,8 um, y están dispuestos en paralelo al borde inferior de la imagen.
      10. Repita en 16 - y el modo de 32 haces, el ajuste de las tercera y cuarta espejos BS, respectivamente. Es importante que los haces elementales sean equidistantes porque SI-algoritmos, el más simple es el algoritmo de mín-máx (Hilo), se basan en este supuesto.
  16. Vuelva a colocar la muestra de manera uniforme fluorescente con una heterogénea estructurado, por ejemplo, las raíces cruzadas manchadas Convallaria.
    1. Vaya a la posición de aparcamiento del haz de excitación, which se coloca generalmente en los grandes valores de las coordenadas del escáner, por ejemplo (10,000; 10,000).
    2. Escanear una imagen (multihaz) con la cámara CCD. Compruebe que la imagen aparece nítida, uniforme y recta.
    3. Ajuste la cámara si la imagen aparece rotada: torcer el cuerpo de la cámara axial alrededor del eje vertical con la mano (¡con cuidado!) Hasta que se endereza la imagen.
  17. Iniciar la XY-escáner con el fin de controlar el proceso de exploración para generar el patrón de excitación, es decir, la imagen de rayas.
    1. En el caso de escaneado de haces múltiples, mover el espejo y-escáner, es decir. perpendicular a la línea del haz elemental, de tal modo para generar una imagen de rayas cuadrática.
    2. Si el campo de vista generado como se describe en el paso 17.1. es demasiado pequeño, se extiende la rutina de análisis moviendo el espejo x-scanner a una posición asegurando que la línea de haz-let se duplica y los rayitos son equidistantes a lo largo de toda la línea. Repita el movimiento exactodel espejo y-escáner después de que el espejo x-escáner se mueve para generar la imagen de rayas más grande.
    3. En el caso de escaneo de un solo haz, alternar el movimiento del espejo y-escáner con x-escáner de movimiento del espejo repetidamente en posiciones equidistantes - definidas por el científico - para generar la imagen de rayas deseada.
    4. Asegúrese de utilizar para el movimiento del espejo y-scanner un comando de velocidad constante (reducción de la aceleración / deceleración) y para el espejo un x-scanner a la velocidad máxima (máxima aceleración / deceleración).
  18. Adquirir automáticamente y guardar la imagen de rayas con la cámara (campo-detector). Por lo tanto, sincronizar la cámara con el escáner y utilizar el escáner como el detonante principal.
  19. Repita la adquisición de imágenes de rayas (protocolo de escaneo se describe en el Protocolo 17) moviendo el espejo x-escáner en diferentes posiciones de la siguiente manera:
    1. Elija suficientes pasos de repetición y la longitud del paso adecuado entredos imágenes de rayas posteriores para cubrir la distancia entre dos beamlets consecutivos (en este caso 2,8 micras y un paso de los espejos del escáner es igual a 25 nm); puede ser aconsejable para permitir un poco de solapamiento, es decir, un adicional de 0,3-0,4 micras.
    2. Ajuste el x-cambio a un valor que coincide con el límite lateral de resolución en la longitud de onda dada. Como un ejemplo, el uso de 10 pasos del espejo x-escáner por turno y 12 o 13 cambios conducen a mejores resultados tanto axial y laterales de resolución en este sistema. Consulte con un tobogán estructurado, por ejemplo Convallaria raíces diapositiva, que los números funcionan mejor en el sistema que se utilice.
    3. Optimizar estos dos valores hasta que la imagen Convallaria se convierte en la más aguda: utilizar la herramienta de perfil de la línea en las imágenes calculadas por chispa, y comparar el ancho de los perfiles de línea (que es la señal de fluorescencia de las paredes celulares Convallaria).
    4. Adquirir cada imagen rayada sincronizado con el movimiento del escáner y guardarlo por separado, por ejemplo,
  20. Abra un conjunto completo de imágenes de rayas como matrices, es decir, la matriz 3D, en la rutina de evaluación y utilizar el algoritmo min-max o un algoritmo de transformación de Fourier para generar una matriz 2D de SI-imagen de alta resolución. Los algoritmos se han descrito anteriormente en detalle 20.

Ratones Inmunización y preparación para intravital Imaging

Los experimentos con animales fueron aprobadas por los comités estatales apropiadas para el bienestar animal (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlín) y se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones (animales experimento licencia G0153/08) actuales.

  1. La inducción de una respuesta del centro germinal en el ganglio linfático poplíteo y la preparación del campo de la imagen se realizó como se ha descrito antes 4. Purificar células B immunomagnetically a partir de bazos de B1-8 + / +- / -y células B de B1-8 + / +- / - GFP + ratones.
  2. Inyectar por vía intravenosa 3 x 10 6 células B NP-específicos con una pureza de> 95% utilizando ⅛ B1-8 + / +- / - GFP + y ⅞ no fluorescente B1-8 + / +- / - en ratones C57BL / 6 destinatarios .
  3. Un día después de la transferencia de células a inmunizar a los beneficiarios con 10 mg de NP-CGG (nitrofenil-pollo ɣ globulina) emulsionado en adyuvante completo de Freund (CFA) en la almohadilla de la comida posterior derecha.
  4. Fragmentos Fab de anticuerpos Etiqueta anti-CD21/CD35 con éster ATTO590-succinimidilo.
    1. Para destacar la red de células dendríticas foliculares (FDC) en el centro germinal in vivo, inyectar 10 mg de fragmentos Fab marcados con fluorocromos en la pata trasera derecha de los ratones de 12-24 horas antes de realizar el análisis intravital.

Los siguientes pasos deben ser consirojo para la preparación del nodo linfático poplíteo para intravital de imágenes (8-10 días después de la inmunización):

  1. Anestesie ratón mediante inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina, la cantidad en función de su peso.
  2. Prueba de reflejos para controlar la profundidad de la anestesia durante todo el período de formación de imágenes.
  3. Afeitarse las piernas, la espalda y el flanco derecho del ratón riguroso y usar crema depilatoria para eliminar el vello residual por completo.
  4. Fijar trocánter mayor derecho: localizar el chip ósea con los dedos, ponga una pequeña incisión en la piel con unas tijeras hasta que aparezca una pequeña faja en forma de triángulo blanco.
  5. Sujete la viruta ósea por debajo de esta fascia con unas pinzas de punta de la inmovilización.
  6. Fijar la columna vertebral en la zona lumbar con unas pinzas dentadas.
  7. Fijar la pata trasera derecha en la inmovilización y apriete el tornillo.
  8. La cola de la cinta para mantener la pierna en la posición correcta.
  9. En el lado caudal del muslo, crear una incisión en la piel, en la zona donde la prominente Ente vena poplíteaRS el tejido, separar la piel del tejido subyacente con pinzas romas y siga la vena poplítea de proximal a distal.
  10. Exponer el ganglio linfático con unas pinzas romas, trate de evitar el corte con el fin de proteger a los vasos linfáticos finas (mantener el ganglio linfático en PBS durante la exposición).
  11. Crear un círculo de grasa de vacío alrededor del ganglio linfático, rellene este charco con PBS.
  12. Ponga hoja de la cubierta en su posición y coloque la sonda del termómetro (mantener la temperatura a 37 ° C, de lo contrario la velocidad de células variará drásticamente).
  13. A lo largo del borde superior de la hoja de la cubierta agrega un círculo de grasa de vacío.
  14. Coloque la bobina de calentamiento en su posición en la grasa de vacío, crear un sello de una manera similar al anterior y añadir agua / PBS sobre la cubierta de vidrio antideslizante para mojar el objetivo en.
  15. Después de proyección de imagen, el ratón se mantiene en la anestesia, mientras que el aumento de las dosis de ketamina / xilazina a una dosis letal, seguido por dislocación cervical.

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Representative Results

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La resolución espacial en los ganglios linfáticos

Las dimensiones de la función de dispersión de punto efectiva (epsf) corresponden a la resolución espacial de un microscopio 12. Medimos esta función triple dimensión mediante la adquisición de la señal de la segunda generación de armónicos de las fibras de colágeno en los ganglios linfáticos por nuestro MB-SI-TPLSM en comparación con las técnicas establecidas de dos fotones microscopía de escaneo láser, es decir TPLSM detección de campos (por medio de cámaras CCD) y TPLSM detección de puntos (por medio de la PMT).

A partir de estas mediciones se hace evidente que en la superficie de la muestra, tanto las resoluciones laterales y axiales corresponden a los valores esperados predichos por la teoría de la difracción 20. Sin embargo, al aumentar la profundidad de imagen y por lo tanto con el aumento de trayectoria óptica de la excitación y la emisión de radiación a través de los medios de comunicación con gran variación de índice de refracción, la resolución espacial se deteriora considerablemente, indedientemente de la configuración propia (Figura 2). Por MB-SI-TPLSM llegamos, independientemente de la profundidad de la imagen, un aprox. 20% mejor resolución lateral y un 220% mejor resolución axial en comparación con los enfoques estándar TPLSM.

Dinámica de complejos inmunes en las células dendríticas foliculares en los centros germinales

La selección clonal de células B durante la respuesta inmune, dentro de los órganos linfoides secundarios de ratones adultos es el primer paso en su camino a diferenciarse en células B de memoria o células plasmáticas 4. En este proceso, se cree que la interacción muy dinámica entre las células dendríticas foliculares (FDC) y las células B a nivel de las estructuras de complejos inmunes (grupos de pocas moléculas de proteínas) dentro de los centros germinales de jugar un papel central. Sólo mediante el uso de una tecnología de microscopía intravital altamente resolver es posible diseccionar esta comunicación celular y sus implicaciones para la respuesta inmune. Nuestro enfoque de MB-Si-TPLSM ofrece por primera vez la posibilidad de intravitally visualizar y cuantificar las dimensiones de los grupos de depósitos de complejos inmunes como etiquetado por anti-CD21/35-Fab-ATTO590 en las células dendríticas foliculares, en hasta 120 micras de profundidad en centros germinales de los ganglios linfáticos poplíteos (Figuras 3a y 3b). Mientras que tales estructuras no son visibles por los enfoques TPLSM estándar, podríamos identificar de forma individual e incluso visualizar su dinámica utilizando nuestro enfoque. Figuras 3e y 3f apoyamos esta idea, que muestra la comparación directa entre la imagen de fluorescencia 3D de los depósitos de células inmunes en un centro germinal como adquiridos por TPLSM convencional (basados ​​PMT) y MB-SI-TPLSM. Por otra parte, las interacciones de los depósitos de complejos inmunes con centro germinal de células B podrían ser altamente resueltas (Figuras 3c y 3d; Películas 1 y 2) y ahora pueden ser investigated en combinación con sondas funcionales intravital para la proliferación, diferenciación o apoptosis. En un siguiente paso, vamos a utilizar nuestro enfoque para investigar también la comunicación dinámica de las células B germinales con células T ayudantes, que se cree que constituye otro fenómeno decisivo para las células B de la selección clonal en los órganos linfoides secundarios.

Figura 1
.. Figura 1 Principio y configuración del multi-haz de iluminación a rayas de dos fotones microscopio de escaneo láser El haz de un sintonizable Ti pulsada fs: Sa láser (longitud de onda entre 690-1,080 nm, 140 fs, 80 MHz) se atenúa por un módulo de hecho de una placa λ / 2 y un polarizador de película delgada, sus impulsos se precomprimido en un módulo GVD-compensación basada en el prisma y, finalmente, se dividieron en 2, 4, 8, 16, 32, 64 o vigas,formando una línea de haces pequeños. Dos beamlets consecutivos dentro de la línea tienen polarizaciones perpendiculares (marcadas en rojo y verde en la línea del haz elemental) y se desplazan en el tiempo con el fin de evitar interferencias. El tiempo de desplazamiento entre dos beamlets consecutivos equivale a 3 psec. Para la adquisición de la imagen, la línea de haz elemental se centra en la muestra por una lente de objetivo (20X de inmersión en agua de la lente objetivo, NA 0,95, WD 2 mm) y perpendicularmente escaneado, de manera que se genera un patrón periódico bien definida. Este patrón se traslada a lo largo de la línea del haz elemental. La serie de imágenes generadas de esta manera se detectan a través de filtros de interferencia montados en una rueda de filtros por una cámara EM-CCD y finalmente evaluados por un algoritmo de mínimo-máximo. TPLSM de haz único basado en PMT-detección se realizó con el mismo microscopio. En este caso, se utilizó sólo un rayo láser para escanear la muestra, y nosotros resolvimos espectralmente la señal de fluorescencia con espejos dicroicos correspondientes y filtros de interferencia antes de detectarción con tubos fotomultiplicadores. Como alternativa, en lugar de la Ti:. Rayo láser Sa, el haz de un oscilador paramétrico óptico puede ser acoplado a un microscopio para realizar longitud de onda larga MB-SI-TPLSM Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Resolución espacial de multi-haz de iluminación rayas TPLSM comparación con TPLSM basados ​​en CCD estándar PMT-basado y multifocal. (A) perfiles axiales representativas, así como xy y xz proyecciones de SHG en fibras de colágeno en profundidad 100 micras dentro de la linfa nodo. lexc = 900 nm, longitud de onda de detección oscilan 447 ± 30 nm, flujo de fotones Φ = 4,75 x 10 2 • s. (B) las perlas fluorescentes de color verde amarillento incrustado en agarosa según lo registrado por MB-SI-TPLSM y TPLSM convencional (SB-PMT). λ exc = 850 nm, longitud de onda de detección oscilan 525 ± 25 nm, flujo de fotones Φ = 2,08 x 10 29 fotones / cm 2 • s, la unidad de malla = 3,7 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3 intravital de imágenes de centros germinales de MB-SI-TPLSM (a) Imagen de fluorescencia 3D de la zona de luz de un centro germinal etiquetado por CD21/35-Fab-ATTO590 (rojo) en un ratón inmunizado con hapteno -.. Γ pollo -globulin (NP-CgG) después de la transferencia adoptiva de B1-8 EGFP + células B (verde). Los depósitos de complejos inmunes (etiquetado CD21/35) sobre las células dendríticas foliculares (FDC) se pueden visualizar individualmente, como se observa en el zoom-en (b) de la imagen (A), y tienen dimensiones (tanto laterales y axiales) en el gama de 400-800 nm en un máximo de 120 m de profundidad. Las células B del centro germinal en el inmunizados B1-8 EGFP + ratón se detectan (c), mientras que los contactos (d) parcialmente responsables de la maduración de la respuesta inmune puede ahora también ser visualizadas. λ exc = 850 nm, longitud de onda de detección oscilan 605 ± 20 nm (ATTO590) y 525 ± 25 nm (EGFP), flujo de fotones Φ = 7,05 x 10 28 fotones / cm 2 • s. La barra de escala (a) 20 micras, (b) 10 micras, (c) 30 micras, (d) 10 micras. Imágenes de fluorescencia 3D de la misma zona dentro de lazona de luz de un centro germinal etiquetado por CD21/35-Fab-ATTO590 según lo registrado por MB-SI-TPLSM (e) y convencional (basados ​​en la PMT) TPLSM (f), respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subtítulos de películas

Película-1 y -2

Dinámica de depósitos inmunes complejas en las células dendríticas foliculares secundarias (FDC) y su interacción con los centros germinales Las células B según lo registrado por MB-SI-TPLSM. Los depósitos de complejos inmunes son etiquetados por CD21/35-Fab-ATTO590 (rojo), mientras que las células B del centro germinal son B1-8 Jk - / - células EGFP + (verde).

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Discussion

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El objetivo de formación de imágenes ópticas intravital es visualizar de forma dinámica y funcionalmente la motilidad celular y las interacciones con el fin de comprender la función del órgano en la salud y la enfermedad del tejido y 5. La tecnología más potente para lograr esto, de múltiples fotones láser microscopía de barrido, todavía tiene que superar las limitaciones relacionadas con las distorsiones de onda frontal, la dispersión, la adquisición lenta, photobleaching y fotodaño, que limitan su resolución espacial, contraste, así como su tiempo de resolución .

Hay dos soluciones de éxito para alcanzar una mejor excitación (y de emisión) de gestión de fotones en tejido profundo que conduce a mejores resoluciones espaciales, el aumento de contraste (aumento de la relación señal-ruido, debido al aumento de la señal) y, por lo tanto, la reducción de fotoblanqueo y fotodaño : los enfoques de óptica adaptativa y la utilización de longitudes de onda de excitación más largos - excitación infrarroja ajustable 6. En la última década, el concepto de frente de onda correscción de óptica adaptativa ha sido trasladado desde la astronomía a la imagen de bio-óptica y también para microscopía multi-fotón. Mientras que el primero de óptica adaptativa se acerca para microscopía de dos fotones confiado en detección frente de onda y necesitaba una referencia subdiffraction, es decir, una "estrella guía", similar a la astronomía, los sistemas actuales son más adecuados a las imágenes de tejido profundo 12. Por ejemplo, utilizan la coherencia de compuerta de la radiación de excitación de frente de onda de detección 13,15, o no utilizan ningún sensor de frente de onda externa en absoluto, sino que se desarrollan algoritmos de adaptación basado respectivamente en la correlación cruzada de las imágenes después de la pupila Segmentación 17 o en la búsqueda estocástica iterativo de los parámetros ideales y posterior interferencia con la imagen sin corregir como obtuvieron del paso de la iteración anterior - IMPACT 16, o que utilizan la foto-acústica para caracterizar las distorsiones del frente de onda y los efectos de dispersión 20. Sin embargo, debido a un refr altamente variablesíndice activo en el tejido, los enfoques de óptica adaptativa son bastante lento, ya que el paso de corrección tiene que ser repetido para áreas relativamente pequeñas (aprox. 10 x 10 m 2) 16. Por otra parte, ya sea por frente de onda o corrección efecto de dispersión, la resolución espacial máxima alcanzable es aún limitado por la difracción.

Nuestro enfoque es capaz de superar parcialmente las cargas de la aberración de frente de onda y de la dispersión sino que también empuja la resolución más allá del límite de difracción. El uso de lentes de objetivo con una mayor apertura numérica, los valores absolutos para la resolución axial pueden mejorar a alrededor de 400 nm 20. El precio para la mejor resolución es una decadencia más empinada de la relación señal-ruido en el tejido profundo en comparación con TPLSM convencional. Esto es debido a la necesidad de utilizar la detección de campo en MB-SI-TPLSM. Como se muestra antes del 15, el uso de detectores de campo en lugar de detectores puntuales se asocia a este deterioro más pronunciado de SNR ducorreo a la dispersión más fuerte de la luz emitida, que es relevante sólo para la detección de campo. Por lo tanto, la profundidad máxima de imagen para la detección de los métodos TPLSM campo es de aprox. 25% reducida en comparación con TPLSM convencional (es decir, la detección de puntos basado). Una solución práctica es sencillo de aplicar longitudes de onda de excitación más largos y para detectar longitudes de onda de emisión más largos. Naturalmente, esto mejora la relación señal ruido dependiente de la profundidad en TPLSM convencional para la misma medida que en MB-SI-TPLSM.

En lo que se refiere a la velocidad de adquisición, MB-SI-TPLSM sólo está limitado por la velocidad del escáner galvanométrico y / o por la lectura de salida de la cámara y los beneficios de la división de haz de rayo láser 32 permite. En comparación con el estándar TPLSM basado en cámaras multi-haz, MB-SI-TPLSM es ligeramente más lento debido a la necesidad no sólo para escanear sino también para adquirir sincrónicamente cada uno de aprox. 10 rayas iluminados imágenes para generar la imagen final de alta resolución. Sin embargo, nuestra técnica conserva un cloído ventaja de velocidad sobre la TPLSM convencional (basado en el escaneo de un solo haz y la detección de punto). Por lo tanto, el tiempo de adquisición de un (píxel 512 x 512) 150 x 150 micras 2 es 841 ms utilizando TPLSM convencional (frecuencia escáner 800 Hz) y 109 mseg usando MB-SI-TPLSM. De este modo, la potencia de excitación por haz y el tiempo de permanencia por píxel son los mismos para ambos convencional y MB-SI TPLSM, de modo que la señal es comparable para ambas configuraciones. Como se ha demostrado anteriormente 20, photobleaching y efectos fotolesiones en experimentos MB-SI-TPLSM son bajos y comparables a TPLSM convencional bien realizado.

En el futuro sería deseable combinar los enfoques complementarios de óptica adaptativa y la iluminación de rayas en el rango infrarrojo para mejorar aún más TPLSM intravital, similar a los logros en la óptica adaptativa con fines de iluminación estructurada 21. Sin embargo, con el fin de alcanzar estos objetivos, enfoques considerablemente más rápido de óptica adaptativadeben ser desarrollados.

El alto impacto esperado del enfoque de la iluminación de rayas de las biociencias y la biomedicina radica en su capacidad para mejorar la resolución y mejorar el contraste en el tejido profundo, para contrarrestar la distorsión del frente de onda y los efectos de dispersión, sino también ir más allá de los límites de difracción en los microscopios de escaneo láser, por simplemente controlar el proceso de digitalización y la elección de un detector de campo adecuadamente sensible.

El alto impacto esperado del enfoque de la iluminación de rayas de las biociencias y la biomedicina radica en su capacidad para mejorar la resolución y mejorar el contraste en el tejido profundo, para contrarrestar la distorsión del frente de onda y los efectos de dispersión, sino también ir más allá de los límites de difracción en los microscopios de escaneo láser, por simplemente controlar el proceso de digitalización y la elección de un detector de campo adecuadamente sensible.

El enfoque de la iluminación rayas puede ser aplicado para intravital im-tejido profundoenvejecimiento en todos los de dos fotones microscopio de escaneo láser que son capaces de sincronizar la detección de la cámara con el movimiento galvoscanner en el escaneo de un solo haz. En este caso, las franjas individuales dentro del patrón de excitación se generan posteriormente y no simultáneamente como en MB-SI-TPLSM. Utilizando el escaneo de un solo haz en SI-TPLSM naturalmente esperamos una tasa de adquisición de un poco más lento de las imágenes de fluorescencia en comparación con TPLSM convencional (barrido de haz único punto TPLSM basado en el detector), pero la misma mejora en la resolución y el contraste espacial como se ha demostrado para MB- SI-TPLSM. La velocidad de adquisición más bajo, junto con la limitación en la profundidad de imagen reduce considerablemente el rango de aplicación de un solo haz SI-TPLSM en comparación con MB-SI-TPLSM.

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Disclosures

Volker Andresen es accionista de LaVision Biotec GmbH, Bielefeld, Alemania. Los otros autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos a R. Heintzmann para un debate fructífero en el desarrollo del enfoque de la iluminación a rayas, K. y A. Rajewsky Haberman para proporcionar ratones transgénicos C57BL / 6 B1-8 GFP. Reconocemos la Deutsche Forschungsgemeinschaft en virtud de concesión NI1167/3-1 (RN), HA5354/4-1 y SFB633, A15 proyecto (AEH), la Charité en virtud de concesión Rahel-Hirsch comunión (RN) por el apoyo financiero. Reconocemos en particular la red de JIMI para un debate fructífero y apoyo de infraestructura

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATTO590 – NSH for coupling ATTO Tec, Germany AD-590-35
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 DRFZ, Berlin The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+ Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment  StemmCell Technologies, Germany 19854
Polystyren beads (605), 0.2 µm Life Technologies, Germany F8803
Equipment
TriMScope I LaVision Biotec, Bielefeld, Germany
OPO (manual version) APE, Berlin, Germany
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II Coherent, Duisburg, Germany
Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm Olympus Germany, Hamburg, Germany

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References

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Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales
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Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).More

Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).

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