Summary
ويتجلى PCR جنبا إلى جنب مع تحليل ذوبان عالية الدقة (HRMA) كوسيلة سريعة وفعالة إلى التركيب الوراثي الزرد.
Abstract
الزرد هو نظام نموذجي الفقاريات قوية لدراسة التنمية، والنمذجة المرض، وإجراء فحص المخدرات. وقد تم مؤخرا عرض مجموعة متنوعة من الأدوات الجينية، بما في ذلك استراتيجيات متعددة لإحداث طفرات وتوليد خطوط المعدلة وراثيا. ومع ذلك، وفحص واسعة النطاق محدودة بسبب أساليب التنميط الجيني التقليدية، والتي هي مضيعة للوقت وكثيفة العمالة. نحن هنا وصف تقنية لتحليل الأنماط الجينية الزرد بواسطة PCR جنبا إلى جنب مع تحليل عالية الدقة ذوبان (HRMA). هذا النهج هو سريعة وحساسة، وغير مكلفة، مع خطر أقل من التحف التلوث. التنميط الجيني بواسطة PCR مع HRMA يمكن استخدامها لأجنة الأسماك أو الكبار، بما في ذلك بروتوكولات الفرز الفائق الإنتاجية.
Introduction
الزرد (دانيو rerio) هو نظام نموذجي الفقارية المستخدمة على نطاق واسع لدراسات التنمية والنمذجة المرض. مؤخرا، تم تطوير العديد من التقنيات المعدلة وراثيا وتحور لالزرد. تقنيات نقل الجينات السريع، وعادة ما يعتمد على نظام ينقول Tol2 1، وقد تم جنبا إلى جنب مع تحسين خيارات متعددة لاستنساخ الحمض النووي التجمع جزء 2. وقد استخدمت nucleases الزنك الاصبع (ZFNs) والنسخ مثل المنشط nucleases المستجيب (TALENs) لاستهداف مواضع في كل من الخلايا الجسمية وسلالة الجرثومية في الزرد 3،4. ويمكن لهذه التقنيات بكفاءة توليد الحيوانات المعدلة وراثيا، مع خلق طفرة عالية التردد، ونقل خط الجرثومية 3،4.
على الرغم من هذه التطورات، وتقنيات التنميط التقليدي في الزرد لحد من القوة الكاملة للالطفرات ونقل الجينات الأدوات. يتبع PCR بواسطة الكهربائي للهلام، جنبا إلى جنب في بعض الأحيان مع restrictioن انزيم الهضم، ويستخدم على نطاق واسع للكشف عن تعديل الجينوم، ولكن هو مضيعة للوقت وأقل حساسية لتحديد الإدراج أو الحذف صغيرة. المقايسات TaqMan التحقيق ديك التكاليف الأولية عالية وتتطلب حذرا الأمثل. تسلسل المنتجات PCR يمكن أن يستغرق عدة أيام وليس عملية لفحص واسعة النطاق. تقييد جزء طول تعدد الأشكال (RFLP) التحليل يمكن أن تميز فقط تعدد الأشكال التي تؤثر على مجموعة محدودة من المواقع الاعتراف انزيم التقييد.
تحليل عالية الدقة ذوبان (HRMA)، مغلقة أنبوب آخر-PCR تحليل الأسلوب، هو طريقة تم تطويرها مؤخرا أن يكون سريعا وحساسة، وغير مكلفة، وقابلة للفحص عدد كبير من العينات. HRMA يمكن استخدامها للكشف عن تعدد الأشكال، والطفرات، والجينات المحورة 5-7. ويستند HRMA على تمسخ الحرارية للسلطات الوطنية المعينة المزدوج تقطعت بهم السبل، ولكل AMPLICON PCR لديه تفارق فريد (تذوب) مميزة 5. عينات يمكن تمييز بسبب رس بهم تكوين مختلف النوكليوتيدات، والمحتوى GC، أو طول، وعادة في تركيبة مع صبغة الفلورسنت التي تربط فقط المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي 8. وبالتالي، يمكن التمييز بين الأنماط الجينية HRMA المختلفة استنادا إلى خصائص مختلفة تذوب منحنى. لأن HRMA يستخدم الكواشف منخفضة التكلفة ويبعد خطوة واحدة بعد PCR العملية، فإنه يمكن استخدامها لاستراتيجيات عالية الإنتاجية. HRMA هو غير تدميري، لذلك بعد تحليل يمكن استخدام amplicons PCR لتطبيقات أخرى. وقد تم تطبيق HRMA في العديد من الكائنات الحية والنظم، بما في ذلك خطوط الخلايا والفئران والبشر 9-11. وقد تم مؤخرا وصفت استخدامه في الزرد للكشف عن الطفرات المستحثة بواسطة nucleases إصبع الزنك (ZFNs) وTALENs 6،12،13.
في هذه الورقة، ونحن تصف كيفية تنفيذ HRMA PCR القائم في الزرد الجنينية والكبار (الشكل 1). هذا البروتوكول هو مناسبة للكشف عن تعدد الأشكال، الجينات المحورة، والطفرات، بما في ذلك الاشتراكيةngle التغييرات قاعدة الزوج، والإدراج، أو حذف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الحمض النووي
- إعداد العازلة تحلل الحمض النووي: 50 ملي بوكل، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.3، 0.3٪ توين 20، 0.3٪ NP40. إضافة جديدة بروتين K إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل في اليوم من استخدام 12.
- جمع الأنسجة:
- للبالغين كليب زعنفة السمك:
- تخدير الأسماك: ضع السمك في 0.004٪ MS-222 (تريكين) حل. الانتظار حتى يبطئ حركة الخيشومية.
- وضع السمك على كومة من 5-10 Kimwipes وقطع قطعة صغيرة من زعنفة الذيل، حوالي 2-3 مم، مع شفرة حلاقة معقمة.
- وضع بسرعة الأسماك في خزان المسمى مع المياه العذبة للانتعاش؛ تسمية بعناية كل من خزان وأنبوب المقابلة التي سوف تحتوي على مقطع الزعنفة. تغيير الماء وإطعام الأسماك كل يوم.
- التقاط مقطع زعنفة مع طرف ماصة معقمة وتحويلها في أنبوب مملوء 100 ميكرولتر العازلة تحلل الحمض النووي.
- تجاهل غيض ماصة، وتجاهل شفرة حلاقة في وعاء الحادة.
- لمقطع ذيل الجنين:
- وضع الأجنة في 0.004٪ MS-222 (تريكين) حل. الانتظار 2 دقيقة.
- قطع قطعة من الذيل مع ملقط تشريح تحت المجهر.
- وضع الذيل في أنبوب المسمى مليئة 30 ميكرولتر العازلة تحلل الحمض النووي.
- وضع الجنين بسرعة في أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪.
- أنابيب التسمية مع الأجنة وأنابيب ذيل يناظرها.
- تخزين الأنابيب مع الأجنة في 4 درجات مئوية خلال الليل لتثبيت.
- تنظيف ملقط باستخدام المياه الملة، س وKimwipes بين كل جنين للحد من التلوث.
- للأجنة كاملة:
- وضع الأجنة في 0.004٪ MS-222 (تريكين) حل. الانتظار 2 دقيقة.
- وضع الأجنة 1-5 في أنبوب مملوء 100 ميكرولتر العازلة تحلل الحمض النووي. Dechorionation ليست ضرورية.
- للبالغين كليب زعنفة السمك:
- الهضم الحمض النووي
احتضان الأنابيب مع الأنسجة (زعنفة الذيل أو مقاطع أو الأجنة) في 55 ° Cلمدة 4 ساعة تصل إلى 12 ليلة وضحاها. - إبطال نشاط بروتين K
أنابيب الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة 12. وينبغي استخدام الحمض النووي لPCR على الفور، أو تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
2. PCR
- الاشعال تصميم إما يدويا أو عن طريق التمهيدي تصميم البرمجيات (مثل Lightscanner التمهيدي تصميم البرمجيات Biofire). المنتجات PCR لHRMA وعادة ما تكون 50-200 سنة مضت ومنتجات PCR للكشف SNP يجب أن تكون أصغر حجما، وعادة 50-80 سنة مضت.
- PCR
- أداء تفاعل PCR في 96 جيدا أو جيدا 384 لوحة.
- استخدام 10 ميكرولتر اجمالى حجم: 4 ميكرولتر مزيج الرئيسي LightScanner (0.1 U الساخنة بدء طق-AB البلمرة، العازلة، 0.2 ملي dNTPs، 2 مم كلوريد المغنيسيوم، و 1X الفلورسنت صبغة ملزمة الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل)؛ 5 بمول كل التمهيدي، و1 ميكرولتر قالب الحمض النووي الجيني المستخرجة من زعنفة الذيل الكبار أو 3 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني الذيل الجنينية 13.
- عينات الغطاء مع 30 ميكرولتر الزيوت المعدنية. تغطية لوحة مع ختم لاصقة شفافة بصريا.
- تحسين PCR الدراجات ظروف نموذجية الشروط هي 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 30 دورات من 10 ثانية في 95 درجة مئوية، 25 ثانية في 60 درجة مئوية، و 30 ثانية في 72 درجة مئوية، وتنتهي مع 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية وتبريده ل 15 ° C.
- متجر PCR لوحات في 4 درجة مئوية أو متابعة مباشرة إلى HRMA.
- تأكيد المنتج PCR لدينا من خلال تحليل حجمه باستخدام الاغاروز الكهربائي للهلام الأولي من خلال التحسين PCR، وإذا أشار، من خلال التسلسل للمنتج PCR.
3. HRMA
- لوحات الحرارة
- وضع لوحة في نظام تحليل تذوب.
- فتح البرنامج (LightScanner البرامج اتصل-IT 2.0).
- لوحات الحرارة 60-95 درجة مئوية.
- إنشاء ملف تخزين البيانات الجديدة.
- تحليل البيانات HRMA (الشكل 2).
خطوات متعددة للتحليل ممكنة. نعرض مجموعة الأكثر استخداما من البيانات مanipulations.- إعداد فرعية
انقر فوق علامة التبويب مجموعة فرعية. حدد الآبار مع العينات. - تطبيع
- حدد علامة التبويب تطبيع في اللوحة اليمنى. للقضاء على التباين مضان، ضع يدويا خط مزدوج موازية في مرحلة ما قبل (الأولي) ومناطق ما بعد (النهائي) تذوب كما هو موضح (الشكل 2C، النصال) وتطبيع premelt ومضان بعد ذوبان الإشارات من جميع العينات إلى 1 و 0 ، على التوالي 14.
- ضبط المواقع من خطوط بحيث المنطقة تذوب في المنطقة بين قبل وبعد ذوبان خطوط، ولكن لم يتم تحديد. بشكل عام، والحد الأدنى والحد الأقصى السفلى السفلى (وأعالي الحد الأدنى والأعلى ماكس) يجب وضع خطوط درجة الحرارة حوالي 1 درجة مئوية عن بعضها البعض.
- اختيار المناصب درجة الحرارة لتطبيع مثل أن جميع العينات يكون الحد الأقصى أو كاملة (100٪) مضان للمنطقة premelt والحد الأدنى أو لا (0٪) مضان للمنطقة بعد ذوبان (بأفضل ما نقاط البيعإيصال خدمات الإيداع). التطبيع يجب أن يؤدي في خط شبه أفقي في مضان أقصى 1 الذي يمتد حتى تذوب نقطة ثم خط أفقي بالقرب من نقطة ذوبان في الحد الأدنى من مضان 0؛ لا ينبغي أن يكون هناك مستويات مضان (1) أعلاه أو أدناه 0 . على سبيل المثال، في الشكل 2C، وتطبيع منحنيات premelting باستخدام تتراوح درجة الحرارة من 79-80 درجة مئوية.
- تجمع / تجميع
تمييز الأنماط الجينية على أساس درجة حرارة انصهارها (الشكل 2C، المربع الأخضر). حدد التجمع.- حدد Autogroup من القائمة اختيار المعايير تحت قسم التجمع.
- حدد عادي أو مرتفع للذوبان الشخصية مع التحولات واحدة أو متعددة التحولات على التوالي من قائمة اختيار حساسية تحت قسم التجمع.
- حدد حسابمجموعات تحت قسم التجمع.
- انتقل إلى القائمة ملف وانقر فوق حفظ لحفظ النتائج.
- إعداد فرعية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بروتوكول لا يمكن أن يؤديها خلال يوم واحد أو فصل في خطوات على مدى عدة أيام (ويظهر الرسم البياني تدفق العمل في الشكل 1). ويتبع استخراج الحمض النووي من قبل ذوبان وتحليل amplicons PCR. درجات الحرارة للذوبان من AMPLICON تعتمد على حجم وGC-المحتوى، ولكن عموما تبدأ درجات الحرارة ونهاية 50 ˚ C و 95 ˚ م هي (2B 2A أرقام و) المناسبة. مرة واحدة يتم تنفيذ ذوبان، وتحليل منحنيات مضان تذوب عادة ما يتطلب تطبيع اختلاف منحنيات عينة مختلفة، وذلك باستخدام ما قبل وبعد ذوبان المناطق عن المعايير (الشكل 2C). هذا يحسن المقارنة بين نتائج من العينات المختلفة التي يرتبط الاختلاف من مضان الاختلافات الطفيفة التجريبية. يجب وضع كل زوج من خطوط درجة الحرارة لتطبيع حوالي 1 ˚ C بصرف النظر (الشكل 2C، النصال).؛ تجميع نتائج البيانات تتمثل بطريقتين مختلفتين: على الرسم البياني العلوي الذي يظهر ملامح منحنى ذوبان، والرسم البياني السفلي تظهر لمؤامرة الفرق مطروح بالمقارنة مع عينة مرجعية (الشكل 2D).
ويمكن استخدام تحليل للكشف عن الطفرات HRMA (أرقام 3A 3B و) أو الجينات المحورة (الشكل 3C). في الشكل 3A، يتم عرض اثنين من طفرات مختلفة في الجينات eif2b5 (المنحنيات الحمراء والزرقاء في الشكل 3A) من خلال طرح البيانات مضان تطبيع من العينة من النوع البري. لا يهم الذي يتم اختياره النمط الجيني للإشارة. ويمكن تمييز الاختلافات أكثر دهاء أو مربكة في ذوبان منحنيات باستخدام مؤامرة الفرق الاختزالي. في الشكل 3B، يظهر مثال على أربعة أنماط جينية مختلفة في مجموعة واحدة من الأجنة.
الشكل 1. الخطوط العريضة لبروتوكول لHRMA PCR القائم من الحمض النووي الجيني الزرد. ويتبع استخراج الحمض النووي من الأنسجة كله (زعنفة كليب أو الجنين) بواسطة PCR التضخيم في وجود صبغة ملزمة الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل الفلورسنت. وAMPLICON PCR هو التشويه والتحريف ويتم تسجيل إشارة مضان، تليها تذوب تحليل منحنى، للكشف عن AMPLICON و / أو للتمييز الأنماط الجينية.
الشكل 2. الشاشة لقطات من البرنامج لأداء HRMA وتحليل النتائج. A. لقطة من الشاشة من البرامج LightScanner؛ ويضاعف المربع الأصفر في "ب" B. تضخيم بالنظر المنطقة محاصر في "A". تحديد البداية والنهاية درجة الحرارة وتظهر (السهام). C. ضع premelt وخطوط متوازية بعد ذوبان للتطبيع (السهام). لاحظ الفرق في مضان وقبل ذوبان مناطق ما بعد (مربع أحمر). الرسم البياني السفلي (الصندوق الأخضر) يبين منحنيات ذوبان المستمدة من المؤامرات البيانات الخام التالية التطبيع. د. يظهر الرسم البياني العلوي تذوب ملامح منحنى بعد التجمع التلقائي؛ ويوضح المورثات مختلفة في ألوان مختلفة (مربع أحمر). الرسم البياني السفلي (الصندوق الأخضر) يظهر منحنى الفرق مضان. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. باستخدام الموارد البشرية. MA لتحديد الطفرات والجينات المحورة وتظهر منحنيات الفرق الإسفار؛ التغيير في مضان (المحور الصادي) إلى درجة حرارة (محور س) ويرد. كان يستخدم للكشف عن الأسماك HRMA تحمل طفرات في الجين eif2b5. ويظهر النوع البري في الرمادي (السهم). تمثل الألوان الأحمر والأزرق اثنين من الطفرات eif2b5 مختلفة، والتي أكدتها التسلسل للمنتج PCR. B. وحددت أربعة مختلفة الأليلات الطافرة FOXP2 مع HRMA. الحمراء: zc82 / + (8 غليان الحذف)، والأخضر: zc83 / + (17 سنة مضت الحذف)، الزرقاء: zc82/zc83 (8BP deletion/17bp الحذف)، والرمادي: zc83/zc83 (أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل 17bp الحذف) C. الأسماك المعدلة وراثيا GAL4 (منحنيات الرمادي) يمكن تمييزها عن نوع البرية (منحنى البني، والسهم). لاحظ أن للكشف عن التحوير، لا ينبغي أن يؤديها التطبيع. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PCR جنبا إلى جنب مع HRMA هي تقنية قوية لالتنميط الجيني الزرد. مزايا هذا النهج هي سرعته، متانة، وحساسية للكشف عن الطفرات حتى النقطة. بروتوكول بأكمله، من زعنفة كليب التحليل لتذوب منحنى، لا يمكن أن يؤديها في أقل من ثماني ساعات من قبل فرد واحد. بالإضافة إلى ذلك، والتقنية هي قابلة للفحص عالية الإنتاجية؛ لا تتطلب استخدام بروميد إيثيديوم؛ ومختومة لجميع PCR والخطوات التي تساعد على التقليل من تحليل قضايا التلوث.
خطوة حاسمة لهذه التقنية هو PCR AMPLICON والتصميم التمهيدي. طول نموذجي للمنتجات PCR في HRMA هو 50-200 سنة مضت. amplicons قصيرة زيادة حساسية وتعتبر مثالية للكشف عن التغيرات النوكليوتيدات واحد. إذا منحنيات تذوب الأنواع المنتج PCR ترتبط ارتباطا وثيقا لا يمكن تمييزها بسهولة، وهو قليل النوكليوتيد صغيرة مكملة لSNP وسدت في نهاية 3 'يمكن تضمينها في رد فعل PCR (Lunaprobes؛ التحقيقق). يتم إنشاء تحقيقات من قبل غير المتماثلة باستخدام PCR تركيز مختلفة من الأمام وعكس الاشعال، مع 3 'مانع C3 لمنع تمديد التحقيق في احقة HRMA PCR. ثم يتم تضمين التحقيق في رد فعل HRMA PCR. HRMA ثم يحدث مع لجنة التحقيق، التي المسبار غير المتماثلة بربط المنتج PCR ويولد الدوبلكس التحقيق المستهدفة مع مختلف منحنيات ذوبان التي يمكن استخدامها للتمييز بين الأليلات.
العديد من الشركات تقدم نظم تحليل منحنى ذوبان. وتشمل هذه Biofire Lightscanner، وروش LightcyclerVR 480 والدوار في Qiagen الجينات Q. هي عدة، والأصباغ الحمض النووي ملزم فلوري المتاحة، بما في ذلك LC الأخضر PLUS وSYT09 EvaGreen. هناك بعض التباين في الحساسية في الكشف عن الطفرات على أساس الأصباغ الفلورية مختلفة وآلات تذوب منحنى 8،15. Nonsaturating الأصباغ، على سبيل المثال، SYBR الأخضر الأول، لم تعد ملائمة لمعظم التطبيقات HRMA: بتركيزات عالية، SYBR أخضر الطول مثبطاتTS نشاط البلمرة DNA، وبتركيزات أقل من ذلك، SYBR الأخضر لا أستطيع قياس بدقة السلوك ذوبان نظرا لإعادة توزيع لها من مناطق ذابت مرة أخرى إلى مناطق dsDNA و16. في العام منصات في الوقت الحقيقي PCR معظم الحالية قادرة على preforming HRMA باستخدام مجموعة من البرامج الإضافية والجيل الثاني من الحمض النووي الفلورسنت صبغة ملزمة. في حين التفاصيل الفنية للبرنامج وسلسلة من الخطوات التجريبية تختلف قليلا بين المنصات، والمفاهيم العلمية الشاملة متطابقة في جوهرها.
وقد أظهرت مختبرنا وغيرها من الجهات التي HRMA يمكن أن تستخدم في كل الزرد الجنينية والكبار للكشف عن الجينات المحورة، والطفرات المستحثة بواسطة ZFNs وTALENs 6،12،13. وقد استخدم HRMA لاكتشاف الأشكال في الزرد 6،12. يستخدم مختبرنا HRMA سواء بالنسبة للفحص الأولي من الطفرات المستحثة TALEN وكذلك للفرز خطوط الثابتة (TSQ وJLB، غير منشورة). تطبيق و أخرى محتملةوتشمل الأيونات التي يمكن تطبيقها على الزرد الحساسة للمثيلة HRMA (MS-HRMA) 17، الكمي لعدد النسخ المتغيرات 5، وكشف الممرض في الحظيرة 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر أعضاء Blaschke، جرونوالد، وتوير مختبرات للحصول على المشورة والمساعدة التقنية. ويدعم هذا العمل من قبل مؤسسة PCMC، المعاهد الوطنية للصحة R01 MH092256 وDP2 MH100008، ومارس من الدايمات مؤسسة منحة بحثية # 1-FY13-425، لJLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96-well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| High-resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldehyde |
References
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
- Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
- Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
- Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
- Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
- Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
- Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
- Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
- Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
- Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).
