Summary
PCR combinada con el análisis de fusión de alta resolución (HRMA) se demuestra como un método rápido y eficiente para determinar el genotipo de pez cebra.
Abstract
El pez cebra es un modelo de sistema de vertebrados de gran alcance para el estudio del desarrollo, modelado de la enfermedad, y la realización de la detección de drogas. Recientemente se ha introducido una variedad de herramientas genéticas, incluyendo las múltiples estrategias para inducir mutaciones y la generación de líneas transgénicas. Sin embargo, el cribado a gran escala está limitada por los métodos de genotipificación tradicionales, que consumen mucho tiempo y mano de obra intensiva. Aquí se describe una técnica para analizar los genotipos de pez cebra mediante PCR en combinación con el análisis de alta resolución de fusión (HRMA). Este enfoque es rápido, sensible y de bajo costo, con menor riesgo de artefactos de contaminación. La genotipificación por PCR con HRMA se puede utilizar para los embriones o los peces adultos, incluidos en los protocolos de selección de alto rendimiento.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio) es un sistema modelo de vertebrados ampliamente utilizada para estudios de desarrollo y modelado de la enfermedad. Recientemente, numerosas tecnologías transgénicas y de mutación se han desarrollado para el pez cebra. Técnicas de transgénesis rápida, generalmente basados en un sistema transposón Tol2 1, se han combinado con mejores opciones de clonación para el montaje fragmento de ADN múltiple 2. Nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y de transcripción nucleasas efectoras del tipo activador (Talens) se han utilizado para dirigir los loci tanto en las células somáticas y de línea germinal en el pez cebra 3,4. Estas técnicas pueden generar eficientemente animales modificados genéticamente, con la creación de mutación de alta frecuencia y la transmisión de la línea germinal 3,4.
A pesar de estos avances, las técnicas de genotipado tradicionales en el pez cebra limitando la plena potencia de las herramientas de mutagénesis y transgénesis. PCR seguida de electroforesis en gel, a veces combinada con restriccioneN enzima de digestión, se utiliza ampliamente para detectar la modificación del genoma, pero consume tiempo y menos sensible para identificar pequeñas inserciones o deleciones. Ensayos con sondas TaqMan tienen altos costos iniciales y requieren una cuidadosa optimización. La secuenciación de los productos de la PCR puede tomar varios días y no es práctico para el cribado a gran escala. Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) sólo puede discriminar SNPs que afectan a una gama limitada de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción.
Análisis de alta resolución de fusión (HRMA), un método de análisis post-PCR en tubo cerrado, es un método recientemente desarrollado que es rápido, sensible, de bajo costo, y es susceptible de análisis de gran número de muestras. HRMA se puede utilizar para detectar los SNPs, mutaciones, y los transgenes 5-7. HRMA está basado en la desnaturalización térmica de los ADN de doble cadena, y cada uno de amplificación de PCR tiene un único disociación (fundir) característica 5. Las muestras pueden ser discriminados por to su composición de nucleótidos diferente, contenido de GC, o longitud, típicamente en combinación con un colorante fluorescente que sólo se une de doble cadena de ADN 8. Por lo tanto, HRMA puede distinguir diferentes genotipos en base a las diferentes características en estado fundido de la curva. Debido a HRMA utiliza reactivos de bajo costo y es un proceso de post-PCR de un solo paso, que puede ser utilizado para las estrategias de alto rendimiento. HRMA es no destructivo, por lo siguiente análisis de los amplicones de PCR se pueden utilizar para otras aplicaciones. HRMA se ha aplicado en muchos organismos y sistemas, incluyendo líneas celulares, ratones y seres humanos 9-11. Su uso ha sido recientemente descrito en el pez cebra para detectar mutaciones inducidas por las nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y talens 6,12,13.
En este trabajo se describe la forma de realizar HRMA PCR basada en el pez cebra embrionarias y adultas (Figura 1). Este protocolo es adecuado para la detección de SNPs, los transgenes, y mutaciones, incluyendo SINGLE cambios de pares de bases, inserciones o deleciones.
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Protocol
1. Preparación de ADN
- Preparar ADN tampón de lisis: 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 0,3% de Tween 20, 0,3% de NP40. Añadir fresco proteinasa K a una concentración final de 1 mg / ml en el día de uso 12.
- Colección de tejidos:
- Para el adulto clip de aleta de los pescados:
- Anestesie peces: Coloque el pescado en un 0,004% de MS-222 solución (tricaína). Espere hasta que el movimiento de enmalle se desacelera.
- Coloque el pescado en una pila de 5-10 Kimwipes y cortar un pequeño trozo de la aleta de la cola, de unos 2-3 mm, con una hoja de afeitar estéril.
- Coloque rápidamente a los peces en un tanque de la etiqueta con agua dulce para la recuperación; etiquetar cuidadosamente tanto el depósito y el tubo correspondiente que contendrá el clip de la aleta. Cambie el agua y alimentar a los peces todos los días.
- Levante el clip de la aleta con una punta de pipeta estéril y la transfiere en un tubo relleno con 100 l de tampón de lisis de ADN.
- Desechar la punta de la pipeta, y deseche la hoja de afeitar en un recipiente para objetos filosos.
- Para clip de la cola del embrión:
- Coloque embriones en 0,004% MS-222 solución (tricaína). Espere 2 min.
- Corte un pedazo de cola con pinzas bajo un microscopio de disección.
- Ponga la cola en un tubo etiquetado lleno de 30 l de tampón de lisis de ADN.
- Poner rápidamente el embrión en un tubo que contiene 100 l 4% de paraformaldehído.
- Marque los tubos con los embriones y sus tubos de cola correspondientes.
- Guarde los tubos con los embriones a 4 ° C durante la noche para la fijación.
- Limpie la pinza usando agua Milli-Q y Kimwipes entre cada embrión para minimizar la contaminación.
- Para los embriones enteros:
- Coloque embriones en 0,004% MS-222 solución (tricaína). Espere 2 min.
- Ponga 1-5 embriones en un tubo relleno con 100 l de tampón de lisis de ADN. Dechorionation no es necesario.
- Para el adulto clip de aleta de los pescados:
- La digestión de ADN
Incubar los tubos con tejido (o de aleta de cola clips o embriones) a 55 ° Cdurante 4 horas o hasta el día 12. - Inactivar la proteinasa K
Tubos de calor a 95 ° C durante 15 min 12. ADN se debe utilizar para PCR inmediatamente o se almacenó a -20 ° C durante un máximo de 3 meses.
2. PCR
- Primers diseño ya sea manualmente o mediante imprimación de software de diseño (por ejemplo Lightscanner Primer Software de Diseño-Biofire). Productos de la PCR para HRMA son generalmente 50-200 pb; productos de PCR para la detección de SNP deben ser más pequeñas, típicamente 50-80 pb.
- PCR
- Realizar reacción de PCR en una placa de 96 pocillos o 384 pocillos.
- Utilice 10 l volumen total: 4 l mezcla maestra LightScanner (0,1 U hot-start Taq polimerasa-AB, tampón, dNTPs 0,2 mM, cloruro de magnesio 2 mM, y 1x colorante fluorescente de unión a ADN de doble cadena), 5 pmol de cada cebador, y 1 l de plantilla de ADN genómico extraído de aleta de la cola adulto o 3 l de ADN genómico de la cola embrionaria 13.
- Muestras de cubierta con 30 l de aceite mineral. Cubra la placa con un sello adhesivo ópticamente transparente.
- Optimizar PCR ciclismo condiciones típicas de condiciones son de 95 ° C durante 5 min y 30 ciclos de 10 segundos a 95 ° C, 25 seg a 60 ° C, 30 seg a 72 ° C, terminando con 95 ° C durante 30 segundos y se enfrió a 15 ° C.
- Tienda placas PCR a 4 ° C o siguen directamente a HRMA.
- Confirmar nuestro producto de PCR mediante el análisis de su tamaño utilizando electroforesis en gel de agarosa durante la optimización inicial de la PCR, y si está indicado, por secuenciación del producto de PCR.
3. HRMA
- Placas de calor
- Coloque la placa en un sistema de análisis de fusión.
- Abra el software (Software LightScanner Call-IT 2.0).
- Placas de calor de 60-95 º C.
- Crear un nuevo archivo de almacenamiento de datos.
- Analizar los datos HRMA (Figura 2).
Son posibles varias etapas de análisis. Mostramos el conjunto de datos m más utilizadoanipulations.- Ajuste de subconjuntos
Haga clic en la pestaña de subconjuntos. Seleccione los pocillos con muestras. - Normalización
- Seleccione la pestaña Normalizar en el panel izquierdo. Para eliminar la varianza de fluorescencia, coloque manualmente la doble línea paralela en pre-(inicial) y las regiones posteriores (final) de fusión, como se ilustra (Figura 2 C, puntas de flecha) y normalizar Premelt y fluorescencia después de la fusión en las señales de todas las muestras a 1 y 0 , respectivamente 14.
- Ajuste la posición de las líneas de modo que la región de fusión es en la región entre los pre-y post-fusión en las líneas, pero no se selecciona. En general, el Min Baja y el Bajo Max (y Superior y Superior Min Max) líneas de temperatura se deben colocar aproximadamente 1 ° C de diferencia.
- Elija posiciones de temperatura para la normalización de tal manera que todas las muestras tienen (100%) de fluorescencia máxima o total de la región Premelt y mínima o ninguna (0%) de fluorescencia para la región de post-fusión (como mejor como POSble). La normalización debería dar lugar a una línea casi horizontal en la fluorescencia máxima de 1 que se extiende hasta el punto de fusión y luego una línea casi horizontal desde el punto de fusión a la fluorescencia mínima de 0, no debería haber niveles de fluorescencia por encima o por debajo de 1 0 . Por ejemplo, en la Figura 2C, normalizar las curvas de fusión previa usando los rangos de temperatura de 79-80 ° C.
- Agrupación / Clustering
Distinguir los genotipos en función de su temperatura de fusión (Figura 2 C, caja de color verde). Seleccione Agrupación.- Seleccione Autogroup de la lista de selección de Normas en la sección Agrupación.
- Seleccione Normal o Alta para la fusión de perfiles con transiciones individuales o múltiples transiciones, respectivamente, desde la lista de selección de sensibilidad en la sección Agrupación.
- Seleccionar ComputeGrupos menores de la sección Agrupación.
- Vaya al menú Archivo y haga clic en Guardar para guardar los resultados.
- Ajuste de subconjuntos
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Representative Results
El protocolo se puede realizar durante un solo día o separado en pasos lo largo de varios días (diagrama de flujo de trabajo se muestra en la Figura 1). La extracción de ADN es seguido por la masa fundida y el análisis de los amplicones de PCR. Las temperaturas de la masa fundida del amplicón dependen del tamaño y contenido de GC, pero generalmente comienzan y las temperaturas extremas de 50 ˚ C y 95 ˚ C son apropiadas (Figuras 2A y 2B). Una vez que se realiza la masa fundida, el análisis de las curvas de fluorescencia de fusión típicamente requiere la normalización de la variación de las diferentes curvas de ejemplo, el uso de pre-y post-fusión en regiones como estándares (Figura 2C). Esto mejora la comparación de los resultados de diferentes muestras en las que la variación de la fluorescencia está relacionada con las variaciones experimentales menores. Cada par de líneas de temperatura para la normalización debe estar colocada aproximadamente a 1 ˚ C aparte (Figura 2 C, puntas de flecha).; Agrupación de los resultados de datos está representado de dos maneras diferentes: una gráfica superior que muestra los perfiles de la curva de fusión, y un gráfico de un menor que muestra un gráfico de la diferencia de sustracción en comparación con una muestra de referencia (Figura 2D).
HRMA análisis puede ser utilizado para detectar mutaciones (Figuras 3A y 3B) o transgenes (Figura 3C). En la Figura 3A, dos mutaciones diferentes en el gen EIF2B5 se muestran (curvas rojas y azules en la Figura 3A) restando los datos de fluorescencia normalizada de la muestra de tipo salvaje. No importa lo que se elige el genotipo como referencia. Diferencias más sutiles o confusas en estado fundido curvas se pueden distinguir por el uso de la trama diferencia sustractiva. En la Figura 3B, se muestra un ejemplo de cuatro genotipos diferentes en una única colección de embriones.
Figura 1. Esquema de protocolo para HRMA basado en la PCR de ADN genómico de pez cebra. Extracción de ADN de todo el tejido (FIN-clip o embrión) es seguida por la amplificación por PCR en presencia de un colorante de unión a ADN de doble cadena fluorescente. La amplificación de PCR se desnaturaliza y señal de fluorescencia se registra, seguido por análisis de fusión de la curva, para detectar el amplicón y / o para diferenciar los genotipos.
Figura 2. Las instantáneas de pantallas de software para realizar HRMA y analizar los resultados. A. Captura de pantalla del software LightScanner; cuadro amarillo se magnifica en "B" B.. Vista de la región en caja ampliada en "A". Configuración de Inicio y Fin de temperatura se muestran (flechas). C. Coloque el prefusión y líneas paralelas post-melt para la normalización (puntas de flecha). Nótese la variación de fluorescencia en pre-y post-fusión regiones (recuadro rojo). Bajo el gráfico (caja verde) muestra de fusión curvas derivadas de las parcelas de datos en bruto tras la normalización. D. Muestra el gráfico superior se derriten los perfiles de la curva después de agrupación automática; diferentes genotipos se ilustran en diferentes colores (caja roja). Bajo el gráfico (caja verde) muestra la curva de diferencia de fluorescencia. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. El uso de HR. MA para identificar las mutaciones y los transgenes se muestran las curvas de diferencia de fluorescencia, el cambio en la fluorescencia (eje y) a la temperatura (eje x) se muestra una.. HRMA se utilizó para detectar los peces que llevan mutaciones en el gen EIF2B5. Tipo salvaje se muestra en gris (flecha). Los colores rojos y azules representan dos mutaciones EIF2B5 diferentes, confirmados por secuenciación del producto de PCR. B. Cuatro diferentes alelos mutantes FOXP2 se identifican con HRMA. Rojo: zc82 / + (8 pb supresión), verde: zc83 / + (17 pb supresión), azul: zc82/zc83 (8 pb deletion/17bp supresión), gris:. Zc83/zc83 (homocigotos supresión 17pb) C. Peces transgénicos Gal4 (curvas grises) puede distinguirse de la de tipo salvaje (curva de color marrón, flecha). Tenga en cuenta que para la detección de transgenes, no se debe realizar la normalización. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
PCR combinada con HRMA es una tecnología de gran alcance para el genotipado de pez cebra. Las ventajas de este enfoque son su velocidad, robustez, y la sensibilidad para detectar incluso mutaciones puntuales. El protocolo de todo, desde el análisis hasta derretir curva fin-clip, se puede realizar en menos de ocho horas por un solo individuo. Además, la técnica es susceptible de cribado de alto rendimiento; no requiere el uso de bromuro de etidio, y se sella para todos PCR y pasos de análisis que ayuda a minimizar los problemas de contaminación.
Un paso crítico para esta técnica es amplicón de PCR y el diseño del cebador. La longitud típica de los productos de PCR en HRMA es 50-200 pb. Amplicones cortos aumentan la sensibilidad y son ideales para la detección de cambios de un solo nucleótido. Si las curvas de fusión de las especies de productos de PCR estrechamente relacionados no se pueden distinguir fácilmente, un pequeño oligonucleótido complementario al SNP y bloqueado en el extremo 3 'se puede incluir en la reacción de PCR (Lunaprobes; sondas). Las sondas se generaron por PCR asimétrica usando diferente concentración de la cebadores directo e inverso, con un bloqueador de C3 3 'para prevenir la extensión de la sonda en la posterior HRMA de PCR. La sonda se incluye entonces en la reacción de PCR HRMA. HRMA a continuación, se produce con la sonda, en el que la sonda asimétrica se une al producto de la PCR y genera dúplex sonda-diana con diferentes curvas de fusión que pueden ser utilizados para distinguir los alelos.
Varias compañías ofrecen sistemas de análisis de la curva de fusión. Estos incluyen el Biofire Lightscanner, la Roche LightcyclerVR 480 y el Qiagen Rotor-Gene Q. Varios, tintes de unión a ADN fluorescentes están disponibles, incluyendo LC Verde PLUS y SYT09 EvaGreen. Hay alguna variación en la sensibilidad en la detección de mutaciones basadas en diferentes colorantes fluorescentes y máquinas de fusión de la curva de 8,15. Nonsaturating colorantes, por ejemplo, SYBR Green I, no son adecuados para la mayoría de aplicaciones HRMA: en altas concentraciones, SYBR Green I inhibiciónts la actividad de la ADN polimerasa, y en concentraciones más bajas, SYBR Green I no puede medir con precisión el comportamiento de fusión debido a su redistribución desde las regiones fundidas de nuevo a las regiones de dsDNA 16. En general las plataformas de PCR en tiempo real más actuales son capaces de preformación HRMA usando un paquete de software add-on y un colorante fluorescente de unión a ADN de segunda generación. Mientras que los detalles técnicos del software y la secuencia de pasos experimentales varían ligeramente entre las plataformas, los conceptos científicos generales son esencialmente idénticos.
Nuestro laboratorio y otros han demostrado que HRMA se puede utilizar tanto en embriones de pez cebra adultos y para detectar los transgenes, y las mutaciones inducidas por ZFNs y talens 6,12,13. HRMA se ha utilizado para descubrir los polimorfismos en el pez cebra 6,12. Nuestro laboratorio utiliza HRMA tanto para el cribado inicial de las mutaciones inducidas-TALEN, así como para la clasificación de las líneas establecidas (TSQ y JLB, no publicado). Otros applicat potencialiones que podrían aplicarse para el pez cebra son sensible a la metilación HRMA (ms-HRMA) 17, la cuantificación del número de copias variantes de 5, y la detección de patógenos en viveros 18.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a los miembros de las Blaschke, Grunwald, y Wittwer laboratorios para el asesoramiento y la asistencia técnica. Este trabajo es apoyado por la Fundación PCMC, NIH R01 MH092256 y DP2 MH100008, y la Fundación March of Dimes beca de investigación # 1-FY13-425, a JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96-well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| High-resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldehyde |
References
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