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Biology

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

doi: 10.3791/51138 Published: February 5, 2014

Summary

PCR in Kombination mit hochauflösenden Schmelzanalyse (HRMA) als schnelle und effiziente Methode, um Zebrafisch-Genotyp nachgewiesen.

Abstract

Der Zebrafisch ist ein leistungsfähiges Wirbeltier-Modellsystem für die Untersuchung der Entwicklung, Modellierung Krankheit und Arzneimittel-Screening durchführen. Kürzlich wurde eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen eingeführt, darunter mehrere Strategien zur Induktion von Mutationen und zur Erzeugung transgener Linien. Jedoch wird großen Screening durch Genotypisierung traditionellen Methoden, die zeitaufwändig und arbeitsintensiv sind begrenzt. Hier beschreiben wir eine Technik, um Zebrafisch-Genotypen durch PCR in Kombination mit hochauflösenden Schmelzanalyse (HRMA) zu analysieren. Dieser Ansatz ist eine schnelle, empfindliche und preiswert, mit einem geringeren Risiko der Kontamination Artefakte. Genotypisierung mittels PCR mit HRMA für Embryonen oder ausgewachsene Fische verwendet werden, auch im Hochdurchsatz-Screening-Protokolle.

Introduction

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Zebrafisch (Danio rerio), ein Wirbeltier-Modellsystem für die Untersuchung der weithin Entwicklung und Krankheit Modellierung verwendet. Kürzlich wurden zahlreiche transgenen und Mutationstechniken für Zebrafisch entwickelt. Rapid-Techniken Transgenese, in der Regel auf einem Tol2 Transposonsystem 1 basiert, haben mit verbesserten Klonen Optionen für mehrere DNA-Fragment Anordnung 2 zusammengefasst. Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-Effektor wie Nukleasen (Talens) verwendet worden, um Loci in beiden somatischen und Keimbahnzellen im Zebrafisch 3,4 Ziel. Diese Techniken können effizient genetisch veränderte Tiere zu erzeugen, mit Hochfrequenz-Mutation Erstellung und Keimbahn-Übertragung 3,4.

Trotz dieser Fortschritte, traditionelle Techniken, Genotypisierung im Zebrafisch begrenzen die volle Leistung der Mutagenese und Transgenese-Tools. PCR, gefolgt von Gelelektrophorese, manchmal kombiniert mit EINSCHRÄNKn Enzymverdauung, wird häufig zur Modifikation Genom nachzuweisen, ist jedoch zeitaufwendig und weniger empfindlich gegenüber kleinen Insertionen oder Deletionen zu identifizieren. TaqMan-Sondentests haben eine hohe Anfangskosten und erfordern eine sorgfältige Optimierung. Die Sequenzierung von PCR-Produkten kann mehrere Tage dauern und ist nicht praktisch für große Screening. Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP)-Analyse kann nur unterscheiden SNPs mit Auswirkungen auf eine begrenzte Anzahl von Restriktionsenzym-Erkennungsstellen.

Hochauflösende Schmelzanalyse (HRMA), eine geschlossene Röhre Post-PCR-Analyseverfahren, ist eine kürzlich entwickelte Methode, die schnell, empfindlich, kostengünstig und zugänglich Screening einer großen Anzahl von Proben. HRMA kann verwendet werden, um SNPs, Mutationen und Transgene 5-7 zu erkennen. HRMA auf die thermische Denaturierung von doppelsträngigen DNAs basiert, und jedes PCR-Amplicon eine eindeutige Dissoziation (Schmelze) Kennlinie 5. Die Proben unterschieden werden durch to ihrer unterschiedlichen Nukleotid-Zusammensetzung, GC-Gehalt, oder Länge, in der Regel in Kombination mit einem Fluoreszenz-Farbstoff bindet, die nur doppelsträngige DNA-8. Somit kann HRMA verschiedenen Genotypen basierend auf den unterschiedlichen Schmelzkurvencharakteristika unterscheiden. Da HRMA verwendet Low-Cost-Reagenzien und ist eine Einzelschritt-Post-PCR-Verfahren, kann es für Hochdurchsatz-Strategien verwendet werden. HRMA ist nicht destruktiv, so dass folgende Analyse die PCR-Produkte auch für andere Anwendungen verwendet werden. HRMA in vielen Organismen und Systeme, einschließlich Zelllinien, Mäusen und Menschen 9-11 angewandt. Sein Einsatz hat kürzlich im Zebrafisch beschrieben worden, um Mutationen, die durch Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Talens 6,12,13 induziert wird.

In diesem Papier beschreiben wir, wie man auf PCR-Basis HRMA in embryonalen und adulten Zebrafisch (Abbildung 1) durchzuführen. Dieses Protokoll ist für die Detektion von SNPs, Transgene, und Mutationen, einschließlich single Basenpaar-Veränderungen, Insertionen oder Deletionen.

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Protocol

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1. DNA-Präparation

  1. Vorbereitung DNA Lysepuffer: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Frisches Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml am Tag der Verwendung 12.
  2. Tissue Sammlung:
    1. Für erwachsene Fischflosse Clip:
      1. Anesthetize Fisch: Den Fisch in 0,004% MS-222 (Tricaine)-Lösung. Warten Sie, bis Kiemenbewegung verlangsamt.
      2. Setzen Sie Fisch auf einem Stapel von 5-10 Kimwipes und schneiden Sie ein kleines Stück der Schwanzflosse, ca. 2-3 mm, mit einer sterilen Rasierklinge.
      3. Schnell stellen die Fische in einem markierten Tank mit Frischwasser für die Wiederherstellung, sorgfältig beschriftet sowohl den Tank und Schlauch, der den entsprechenden fin Clip enthalten wird. Wechseln Sie das Wasser und die Fische füttern jeden zweiten Tag.
      4. Nehmen Sie den Fin-Clip mit einer sterilen Pipettenspitze und übertragen sie in ein Rohr mit 100 ul DNA-Lyse-Puffer gefüllt.
      5. Entsorgen Sie die Pipettenspitze, und entsorgen Sie die Rasierklinge in einen Behälter für scharfe Gegenstände.
    2. Für Embryo Schwanz-Clip:
      1. Zeigen Embryonen in 0,004% MS-222 (Tricaine)-Lösung. Warten Sie 2 min.
      2. Schneiden Sie ein Stück Schwanz mit einer Pinzette unter einem Binokular.
      3. Setzen Sie den Schwanz in ein beschriftetes Röhrchen mit 30 ul DNA-Lyse-Puffer gefüllt.
      4. Setzen schnell den Embryo in ein Röhrchen mit 100 ul 4% Paraformaldehyd.
      5. Beschriften Sie die Röhrchen mit Embryonen und ihre entsprechenden Endrohre.
      6. Die Röhrchen mit Embryonen bei 4 ° C über Nacht zur Fixierung.
      7. Reinigen Sie die Zange mit Milli-Q-Wasser und Kimwipes zwischen jedem Embryo auf Kontamination zu minimieren.
    3. Für ganze Embryonen:
      1. Zeigen Embryonen in 0,004% MS-222 (Tricaine)-Lösung. Warten Sie 2 min.
      2. Setz 1-5 Embryonen in einem Rohr mit 100 ul DNA-Lysepuffer gefüllt. Dechorionation ist nicht erforderlich.
  3. DNA-Verdau
    Rohre mit Gewebe (fin oder Schwanz Clips oder Embryonen), bei 55 ° C inkubieren4 Stunden bis zu 12 über Nacht.
  4. Inaktivierung der Proteinase K
    Wärmerohren auf 95 ° C für 15 min 12. DNA für die PCR sollte sofort verwendet werden oder bei -20 ° C für 3 Monate gelagert.

2. PCR

  1. Design-Primer entweder manuell oder durch Primer-Design-Software (zB Lightscanner Primer-Design-Software-Biofire). PCR-Produkte sind in der Regel für HRMA 50-200 bp, PCR-Produkte für die SNP-Nachweis sollte kleiner sein, in der Regel 50-80 bp.
  2. PCR
    1. Führen Sie die PCR-Reaktion in einem 96-Well oder 384-Well-Platte.
    2. Verwenden Sie 10 ul Volumen: 4 ul LightScanner Master-Mix (0,1 U Hot-Start Taq-AB-Polymerase, Puffer, 0,2 mM dNTPs, 2 mM Magnesiumchlorid und 1x Leuchtstoffdoppelstrang-DNA-bindenden Farbstoff), 5 pmol von jedem Primer, und 1 ul genomische DNA-Vorlage aus adulten Schwanzflosse oder 3 ul genomischer DNA aus embryonalen Schwanz 13 extrahiert.
    3. Titel Proben mit 30 ul Mineralöl. Die Platte mit einem optisch transparenten Klebesiegel.
    4. Optimierung der PCR-Zyklusbedingungen sind typische Bedingungen 95 ° C für 5 min und 30 Zyklen von 10 s bei 95 ° C, 25 sec bei 60 ° C, 30 sec bei 72 ° C, endend mit 95 ° C für 30 sec und gekühlt 15 ° C.
    5. Speicher PCR-Platten bei 4 ° C oder direkt weiter HRMA.
    6. Bestätigen unsere PCR-Produkt durch Analyse seiner Größe unter Verwendung von Agarose-Gel-Elektrophorese bei der ersten Optimierung der PCR, und, wenn angegeben, durch Sequenzierung des PCR-Produkts.

3. HRMA

  1. Wärmeplatten
    1. Zeigen Platte in einem Schmelzanalyse-System.
    2. Öffnen Sie die Software (Software LightScanner Call-IT 2.0).
    3. Wärmeplatten von 60 bis 95 ° C
    4. Erstellen Sie einen neuen Datenspeicher-Datei.
  2. Analysieren HRMA Daten (Abbildung 2).
    Mehrere Analyseschritte möglich sind. Wir zeigen die am häufigsten verwendeten Satz von Daten manipulations.
    1. Subset-Einstellung
      Klicken Sie auf Subset-Registerkarte. Wählen Sie die Vertiefungen mit Proben.
    2. Normalisierung
      1. Wählen Sie die Registerkarte Normalisieren in der linken Panel. Um Fluoreszenz Varianz zu beseitigen, manuell positionieren Sie den parallelen Doppellinie in der Vor-(initial) und Post (final) Schmelz Regionen dargestellt (2C, Pfeilspitzen) und normalisieren Vorschmelze und Post-Schmelze Fluoreszenzsignale aller Proben 1 und 0 bzw. 14.
      2. Einstellen der Positionierung der Leitungen, so daß der Schmelzbereich in dem Bereich zwischen den Pre-und Post-Schmelzeleitungen, aber nicht ausgewählt. Im Allgemeinen ist die Nieder Min-und Max Nieder (und Ober Min-und Max Ober) Temperaturleitungen sollten getrennt aufgestellt werden, etwa 1 ° C.
      3. Wählen Temperatur Positionen für die Normalisierung, so dass alle Proben Maximum oder voll (100%) für die Fluoreszenz Vorschmelze Region und minimale oder gar keine (0%) Fluoreszenz für die Post-Schmelzbereich (am besten wie möglichlich). Die Normalisierung sollte in einer nahezu horizontalen Linie bei der maximalen Fluoreszenz von 1, die bis zum Schmelzpunkt und dann eine nahezu horizontale Linie aus der Schmelze Punkt bei der minimalen Fluoreszenz von 0 erstreckt sich führen, es sollte nicht Fluoreszenzwerte über 1 oder unter 0 sein . Beispielsweise in Fig. 2C, normalisieren die Vorschmelztemperatur Kurven mit Temperaturbereichen von 79-80 ° C.
    3. Gruppierung / Clustering
      Unterscheiden Genotypen basierend auf ihren Schmelztemperatur (2C, grün Kasten). Wählen Sie Gruppierung.
      1. Wählen Sie aus dem Autogroup Standards Auswahlliste unter dem Abschnitt Gruppierung.
      2. Wählen Sie Normal oder Hoch zum Schmelzen Profile mit einzelnen Übergänge oder mehrere Übergänge jeweils von der Empfindlichkeit Auswahlliste unter dem Abschnitt Gruppierung.
      3. Wählen ComputeGruppen unter der Gruppierung Abschnitt.
      4. Gehen Sie auf das Menü Datei und klicken Sie auf Speichern, um die Ergebnisse zu speichern.

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Representative Results

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Das Protokoll kann an einem einzigen Tag über mehrere Tage durchgeführt wird oder in Stufen getrennt (Flußdiagramm der Arbeit ist in Fig. 1 gezeigt). Die DNA-Extraktion wird durch die Schmelze und Analyse von PCR-Amplikons, gefolgt. Die Temperaturen für die Schmelze des Amplikons sind abhängig von der Größe und der GC-Gehalt, aber in der Regel Anfang und Ende Temperaturen von 50 ˚ C und 95 ˚ C falls (2A und 2B) sind. Sobald die Schmelze durchgeführt wird, die Analyse der Fluoreszenzschmelzkurven erfordert typischerweise Normalisierung der Variation der verschiedenen Probenkurven mit Pre-und Post-Schmelzbereiche als Standards (Fig. 2C). Dies verbessert den Vergleich der Ergebnisse aus verschiedenen Proben, bei denen die Veränderung der Fluoreszenz, um kleinere experimentelle Variationen verwandt. Jedes Paar der Temperaturlinien für die Normalisierung sollte etwa 1 ˚ C auseinander (2C, Pfeilspitzen) platziert werden.Eine obere Grafik, Schmelzkurvenverläufe zeigt, und eine untere Grafik, die einen Unterschied subtraktiven Grundstück im Vergleich zu einer Referenzprobe (2D) zeigt:; Gruppierung von Daten Ergebnisse ist in zwei Arten vertreten.

HRMA Analyse kann verwendet werden, um Mutationen (3A und 3B) oder Transgenen (3C) zu detektieren. In 3A sind zwei verschiedene Mutationen im Gen eif2b5 durch Subtraktion der normierten Fluoreszenzdaten des Wildtyp-Probe gezeigt (rote und blaue Kurven in Abbildung 3A). Es spielt keine Rolle, welcher Genotyp wird als Referenz gewählt. Mehr subtile oder verwirrende Unterschiede in der Schmelzkurven können mit Hilfe der subtraktiven Unterschied Grundstück unterschieden werden. In Fig. 3B ist ein Beispiel von vier verschiedenen Genotypen in einer Sammlung von Embryonen gezeigt.

Figur 1 Fig. 1 ist. Umriss-Protokoll für die PCR-basierte HRMA von Zebrafisch genomischer DNA. DNA Extraktion aus Vollgewebe (fin-Clip oder Embryo) durch PCR-Amplifikation in Gegenwart einer Fluoreszenz-Doppelstrang-DNA-bindenden Farbstoff gefolgt. Das PCR-Amplikon wird denaturiert und Fluoreszenzsignal aufgezeichnet wird, gefolgt von Schmelzkurvenanalyse, um das Amplikon zu detektieren und / oder Genotypen zu unterscheiden.

Figur 2
Abbildung 2. Screen-Shots von Software zur HRMA durchführen und die Ergebnisse analysieren. A. Screenshot der LightScanner Software;. Gelben Box ist in "B" vergrößert B. Vergrößerte Ansicht verpackt Region "A". Einstellen Start-und End Temp angezeigt (Pfeile). C. Positionieren Sie den Vorschmelze und Post-Schmelze parallelen Linien zur Normalisierung (Pfeilspitzen). Beachten Sie die Fluoreszenz Varianz in Pre-und Post-Schmelzregionen (roter Kasten). Untere Grafik (grünes Feld) zeigt Schmelzkurven aus den Rohdaten Parzellen folgende Normalisierung. D abgeleitet. Obere Grafik zeigt schmelzen Kurvenverläufe nach der automatischen Gruppierung, verschiedene Genotypen sind in verschiedenen Farben (roter Kasten) veranschaulicht. Untere Grafik (grünes Feld) zeigt die Fluoreszenzdifferenzkurve. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 3
3. Mit HR. MA um Mutationen zu identifizieren und Transgene Fluoreszenzdifferenz Kurven gezeigt, Fluoreszenzänderung (y-Achse) auf die Temperatur (x-Achse) A gezeigt.. HRMA wurde verwendet, um Fische, die Mutationen in dem Gen eif2b5 zu erkennen. Wild-Typ ist in grau (Pfeil) gezeigt. Rote und blaue Farben stehen für zwei verschiedene eif2b5 Mutationen durch Sequenzierung des PCR-Produkts. B bestätigt. Vier verschiedene FOXP2 mutierten Allele sind mit HRMA identifiziert. Rot: zc82 / + (8 bp-Deletion), grün: zc83 / + (17-bp-Deletion), blau: zc82/zc83 (8bp deletion/17bp Streichung), grau:. Zc83/zc83 (17bp Deletion homozygot) C. Gal4 transgenen Fischen (grau-Kurven) von Wildtyp (braune Kurve, Pfeil) unterschieden werden. Beachten Sie, dass für Transerkennung, Normalisierung sollte nicht durchgeführt werden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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Discussion

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PCR in Kombination mit HRMA ist eine leistungsstarke Technologie für die Zebrafisch-Genotypisierung. Die Vorteile dieses Ansatzes sind seine Geschwindigkeit, Robustheit und Empfindlichkeit, auch Punktmutationen. Das gesamte Protokoll, aus fin-Clip zum Schmelzkurvenanalyse kann in weniger als acht Stunden von einer einzelnen Person durchgeführt werden. Darüber hinaus ist die Technik zugänglich für Hochdurchsatz-Screening, die Verwendung von Ethidiumbromid nicht erforderlich, und wird für alle PCR und Analyseschritte die Verunreinigungen Probleme minimieren hilft abgedichtet.

Ein entscheidender Schritt für diese Technik ist die PCR-Amplikon und Primer-Design. Typische Länge für PCR-Produkte in HRMA 50-200 bp. Kurze Amplikons erhöhen die Empfindlichkeit und sind ideal zur Erfassung Einzel-Nukleotid-Veränderungen. Sonde, wenn das Schmelzkurven von eng verwandten Arten PCR-Produkt nicht leicht unterschieden werden können, kann ein kleines Oligonucleotid, das komplementär zu dem SNP-und am 3'-Ende blockiert in der PCR-Reaktion (Lunaprobes enthaltens). Die Sonden werden durch asymmetrische PCR unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen der Vorwärts-und Rückwärts-Primer mit einer 3'-C3-Blocker zur Verlängerung der Sonde in der anschließenden PCR HRMA verhindern. Die Sonde wird dann in der HRMA PCR-Reaktion enthalten. HRMA tritt dann mit der Sonde, wobei die asymmetrische Sonde bindet an das PCR-Produkt erzeugt und Sonden-Target-Doppelstränge mit unterschiedlichen Schmelzkurven, die verwendet werden können, um Allele zu unterscheiden.

Mehrere Firmen bieten Schmelzkurvenanalyse-Systeme. Dazu gehören die Biofire Lightscanner, die Roche LightcyclerVR 480 und des Qiagen Rotor-Gene Q. Mehrere fluoreszierenden, DNA-bindende Farbstoffe zur Verfügung, einschließlich LC PLUS und Grün SYT09 EvaGreen. Es gibt einige Unterschiede in der Empfindlichkeit der Mutationserkennung basierend auf unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen und Schmelzkurve Maschinen 8,15. Nonsaturating Farbstoffe, zum Beispiel SYBR Green I, sind für die meisten Anwendungen ungeeignet HRMA: bei hohen Konzentrationen, SYBR Green I Inhibitorents die Aktivität der DNA-Polymerase, und bei niedrigeren Konzentrationen, SYBR Green kann ich nicht genau messen Schmelzverhalten aufgrund seiner Umverteilung von geschmolzen Regionen zurück zur Region von dsDNA 16. In der Regel die meisten bestehenden Echtzeit-PCR-Plattformen in der Lage sind Vorformen HRMA mit einem Software-Paket Add-on und eine zweite Generation von fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff. Während technische Details der Software und die Reihenfolge der experimentellen Schritte unterscheiden sich leicht zwischen den Plattformen sind die wissenschaftlichen Gesamtkonzepte im Wesentlichen identisch.

Unser Labor und andere haben gezeigt, dass HRMA kann sowohl in embryonalen und adulten Zebrafisch verwendet, um Transgene erkennen und Mutationen durch ZFNs und Talens 6,12,13 induziert. HRMA wurde genutzt, um Polymorphismen im Zebrafisch 6,12 entdecken. Unser Labor verwendet HRMA sowohl für die ersten Screening von TALEN-induzierte Mutationen sowie für die Sortierung von etablierten Linien (TSQ und JLB, unveröffentlicht). Andere mögliche applicatIonen, die an Zebrafischen angewendet werden könnten, sind methylierungssensitive HRMA (ms-HRMA) 17, Quantifizierung der Kopienzahl-Varianten 5 und Erregernachweis in 18 Terrarien.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir danken Mitglieder der Blaschke, Grunwald, Wittwer und Labors für die Beratung und technische Unterstützung. Diese Arbeit wird von der Stiftung PCMC, NIH R01 MH092256 und DP2 MH100008 und der March of Dimes Foundation Forschungsstipendium # 1-FY13-425, bis JLB unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 Reaction LightScanner Master Mix BioFire HRLS-ASY-0002 www.biofiredx.com
Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates Bio-Rad Laboratories HSP9665 www.bio-rad.com
Microseal 'B' Adhesive Seals Bio-Rad Laboratories MSB1001 www.bio-rad.com
96-well LightScanner Instrument BioFire LSCN-ASY-0040 www.biofiredx.com
LightScanner Software with Call-IT 2.0 BioFire www.biofiredx.com
High-resolution Melting Analysis 2.0 BioFire www.biofiredx.com
LightScanner Primer Design Software BioFire www.biofiredx.com
Vector NTI Software Invitrogen www.invitrogen.com
Tricaine
Paraformaldehyde

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References

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Xing, L., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. J. Vis. Exp. (84), e51138, doi:10.3791/51138 (2014).More

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