Summary
PCR kombineras med hög upplösning smältanalys (HRMA) visas som en snabb och effektiv metod att genotypbestämma zebrafisk.
Abstract
Zebrafish är en kraftfull ryggradsdjur modellsystem för att studera utveckling, modellering sjukdom, och utföra drogscreening. Nyligen har en mängd olika genetiska verktyg har införts, inklusive flera strategier för att inducera mutationer och generera transgena linjerna. Emellertid är storskalig screening begränsas av traditionella genotyping metoderna, som är tidskrävande och arbetsintensiv. Här beskriver vi en teknik för att analysera zebrafisk genotyper av PCR i kombination med hög upplösning smältanalys (HRMA). Denna metod är snabb, känslig och billig, med lägre risk för kontamineringsartefakter. Genotypning med PCR med HRMA kan användas för embryon eller vuxna fiskar, bland annat i high-throughput screening protokoll.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) är ett ryggradsdjur modellsystem i stor utsträckning använts för studier av utveckling och sjukdom modellering. På senare tid har ett stort antal transgena och mutationstekniker utvecklats för zebrafisk. Snabba genmodifiering tekniker, vanligen baserade på ett Tol2 transposon systemet 1, har kombinerats med förbättrade kloningsalternativ för flera DNA-fragment enheten 2. Zink-finger nukleaser (ZFNs) och transkriptions aktivator liknande effektor nukleaser (Talens) har använts för att rikta loci i både somatiska och könsceller celler i zebrafisk 3,4. Dessa tekniker kan effektivt generera genetiskt modifierade djur, med hög frekvens skapande mutation och bakterie-line överföring 3,4.
Trots dessa framsteg, traditionella genotypning tekniker i zebrafisk begränsar den fulla kraften av mutagenes och genmodifiering verktyg. PCR följt av gel-elektrofores, ibland i kombination med restriction enzymdigestion, används ofta för att upptäcka genom modifiering, men är tidskrävande och mindre känslig för att identifiera små infogningar och borttagningar. TaqMan probanalyser har höga initiala kostnader och kräver noggrann optimering. Sekvensering av PCR-produkter som kan ta flera dagar och är inte praktiskt för storskalig screening. Restriction fragment length polymorphism (RFLP)-analys kan bara diskriminera SNPs som påverkar ett begränsat urval av restriktionsenzymigenkänningsställen.
Högupplöst smältanalys (HRMA), en sluten tub post-PCR-analys-metoden, är en nyligen utvecklad metod som är snabb, känslig, billig, och kan bli föremål för screening av ett stort antal prover. HRMA kan användas för att upptäcka SNP, mutationer, och transgener 5-7. HRMA baseras på termisk denaturering av dubbelsträngade DNA: n, och varje PCR-amplikon har en unik dissociation (smälta) karakteristiska 5. Prover kan diskrimineras på grund av to deras annorlunda nukleotid sammansättning, GC-halt, eller längd, vanligen i kombination med ett fluorescerande färgämne som bara binder dubbelsträngat DNA 8. Sålunda kan HRMA särskilja olika genotyper baserade på de olika smält kurvkarakteristiken. Eftersom HRMA använder lågprisreagens och är ett enda steg efter PCR-processen, kan den användas för high-throughput strategier. HRMA är icke-förstörande, så följande analys PCR amplikoner kan användas för andra tillämpningar. HRMA har tillämpats i många organismer och system, inklusive cellinjer, möss och människor 9-11. Dess användning har nyligen beskrivits i zebrafisk för att detektera mutationer som inducerats av zinkfinger nukleaser (ZFNs) och TALENS 6,12,13.
I detta dokument beskriver vi hur du utför PCR-baserad HRMA på embryonala och vuxna zebrafisk (figur 1). Detta protokoll är lämpligt för att upptäcka SNP, transgener och mutationer, inklusive siOPIC baspar förändringar, insättningar eller deletioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA-framställning
- Förbered DNA lysbuffert: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Lägg färska proteinas K till en slutlig koncentration av 1 mg / ml på dagen för användning 12.
- Vävnadssamling:
- För vuxna fiskar fin klipp:
- Bedöva fisk: Lägg fisken i 0,004% MS-222 (tricaine) lösning. Vänta tills gill rörelse saktar.
- Placera fisken på en bunt med 5-10 Kimwipes och skära en liten bit av stjärtfenan, ca 2-3 mm, med en steril rakblad.
- Snabbt placera fisken i en märkt tank med färskvatten för återvinning, noga märka både tanken och motsvarande rör som ska innehålla fin klippet. Byt vatten och mata fiskarna varannan dag.
- Plocka upp fenan klämma med en steril pipettspets och överföra den i ett rör fyllt med 100 | il DNA-lysbuffert.
- Kasta pipettspetsen, och kasta rakblad i en behållare för vassa föremål.
- För embryo svans klipp:
- Placera embryon till 0,004% MS-222 (tricaine)-lösning. Vänta 2 min.
- Skär en bit av svansen med pincett under en dissekera mikroskop.
- Sätt svansen i ett märkt rör fyllt med 30 | il DNA-lysbuffert.
- Snabbt sätta embryot till ett rör innehållande 100 ^ 4% paraformaldehyd.
- Etikett rör med embryon och deras motsvarande svans rör.
- Förvara rören med embryon vid 4 ° C över natten för fixering.
- Rengör pincett använder Milli-Q-vatten och Kimwipes mellan varje embryo för att minimera kontaminering.
- För hela embryon:
- Placera embryon till 0,004% MS-222 (tricaine)-lösning. Vänta 2 min.
- Sätt 1-5 embryon på ett rör fyllt med 100 | il DNA-lysbuffert. Dechorionation är inte nödvändigt.
- För vuxna fiskar fin klipp:
- DNA-digerering
Inkubera rören med vävnad (fin eller svans klipp eller embryon) vid 55 ° Cunder 4 timmar upp till över natten 12. - Inaktivera proteinas K
Värme rör till 95 ° C under 15 min 12. DNA som skall användas för PCR omedelbart eller förvarades vid -20 ° C i upp till 3 månader.
2. PCR
- Design Primers antingen manuellt eller med primer design mjukvara (t.ex. Lightscanner Primer Design Software-Biofire). PCR-produkter för HRMA är vanligtvis 50-200 bp, PCR-produkter för SNP upptäckt bör vara mindre, typiskt 50-80 bp.
- PCR
- Utför PCR-reaktion i en 96-brunn eller 384-brunnsplatta.
- Använd 10 | il total volym: 4 | il LightScanner huvudblandning (0,1 U hot-start Taq-AB-polymeras, buffert, 0,2 mM dNTP, 2 mM magnesiumklorid, och 1x fluorescerande dubbelsträngade DNA-bindande färgämne), 5 pmol av varje primer, och 1 pl iskt DNA-mall utvinns ur vuxen stjärtfenan eller 3 l iskt DNA från embryonala svans 13.
- Täck prover med 30 pl mineralolja. Täck plattan med en optiskt transparent adhesiv tätning.
- Optimera PCR-cykelbetingelser-typiska betingelser är 95 ° C under 5 min och 30 cykler av 10 sek vid 95 ° C, 25 sek vid 60 ° C, 30 sek vid 72 ° C, som slutar med 95 ° C under 30 sek och kyldes till 15 ° C.
- Förvara PCR-plattorna vid 4 ° C eller fortsätta direkt till HRMA.
- Bekräfta vår PCR-produkten genom analys av dess storlek med hjälp av agarosgel-elektrofores under initial optimering av PCR, och om indikerat, genom sekvensering av PCR-produkten.
3. HRMA
- Värmeplattor
- Placera plattan i en smält-analyssystem.
- Öppna programvaran (LightScanner Software Call-IT 2.0).
- Värmeplattor 60-95 ° C.
- Skapa ett nytt datalagringsfilen.
- Analysera HRMA uppgifter (figur 2).
Flera steg i analysen är möjliga. Vi visar det mest använda uppsättningen data manipulations.- Delmängd inställning
Klicka på fliken Delmängd. Markera brunnar med prov. - Normalisering
- Välj fliken Normalisera i den vänstra panelen. För att eliminera fluorescens varians, placera manuellt den parallella dubbellinje i pre-(initial) och efter (final) smälta regioner enligt bilden (figur 2C, pilspetsar) och normalisera premelt och post smälta fluorescens signaler från alla prover till 1 och 0 respektive 14.
- Justera placeringen av linjerna så att smältområdet är i området mellan de pre-och post-smältlinjer, men inte valt. Generellt Nedre Min och Nedre Max (och Övre Min och Övre Max) temperaturlinjer bör placeras ca 1 ° C från varandra.
- Välj positioner temperatur för normalisering så att alla prover har högsta eller full (100%) fluorescens för premelt regionen och minimal eller ingen (0%) fluorescens för eftersmältområdet (så gott som möjligtligt). Normalisering bör resultera i en nästan horisontell linje med maximal fluorescens av 1 som sträcker sig till smältpunkten och sedan en nästan horisontell linje från smältpunkten vid minimi fluorescens av 0, det borde inte vara fluorescens nivåer över 1 eller under 0 . Till exempel, i figur 2C, normalisera försmältning kurvor med användning av serier av 79 till 80 ° C. Temperaturen
- Gruppering / Clustering
Skilj genotyper baserat på deras smälttemperatur (Figur 2C, grön ruta). Välj gruppering.- Välj Autogroup från urvalslistan standarder under Gruppering avsnittet.
- Välj Normal eller Hög för att smälta profiler med enkla övergångar eller flera övergångar respektive från urvalslistan känslighet under Gruppering avsnittet.
- Välj ComputeGrupper under Gruppering avsnittet.
- Gå till Arkiv-menyn och klicka på Spara för att spara resultatet.
- Delmängd inställning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kan utföras Protokollet under en enda dag eller separeras i steg under flera dagar (flödesdiagram av arbete visas i figur 1). DNA-extraktion följt av smältan och analys av PCR-amplikoner. Temperaturerna för smälta av amplikon bero på storleken och GC-innehåll, men i allmänhet start-och sluttemperaturer av 50 ˚ C och 95 ˚ C är lämpliga (figurerna 2A och 2B). När smältan utförs analys av de fluorescenssmältkurvor kräver typiskt normalisering av variationen av de olika provkurvor, med användning av pre-och post-smält regioner som standarder (figur 2C). Detta förbättrar jämförelse av resultat från olika prover där variationen av fluorescens är relaterad till mindre experimentella variationer. Varje par av temperaturlinjer för normalisering bör placeras ca 1 ˚ C från varandra (figur 2C, pilspetsar).; Gruppering av dataresultat representeras på två olika sätt: ett övre diagram som visar smältkurvan profiler, och ett nedre diagram som visar en subtraktiv skillnad tomt i jämförelse med ett referensprov (figur 2D).
HRMA analys kan användas för att detektera mutationer (fig. 3A och 3B) eller transgener (fig 3C). I figur 3A är två olika mutationer i eif2b5 genen visas (röd och blå kurvorna i figur 3A) genom att subtrahera de normaliserade fluorescensdata för provet vildtyp. Det spelar ingen roll vilken genotyp väljs som referens. Mer subtila eller förvirrande skillnader i smältvatten kurvor kan urskiljas med hjälp av subtraktiv skillnaden tomten. I figur 3B är ett exempel på fyra olika genotyper på en enda samling av embryon visas.
Figur 1. Disposition av protokoll för PCR-baserad HRMA av zebrafisk genom-DNA. DNA-extraktion från hel vävnad (fena-clip eller embryo) följs av PCR-amplifiering i närvaro av en fluorescerande dubbel-strängat DNA-bindande färgämne. PCR-amplikon denatureras och fluorescens-signalen upptecknas, följt av smältkurvan analys, för att detektera amplikonen och / eller för att skilja genotyper.
Figur 2. Screen-shots av programvara för att utföra HRMA och analysera resultat. A. B gul ruta förstoras i "B", skärmdump av LightScanner programvara.. Förstorad bild av boxed regionen i "A". Ställa in start och slut Temp visas (pilar). C. Placera premelt och post-smält parallella linjer för normalisering (pilspetsar). Lägg märke till fluorescens variansen i före och efter-smältregioner (röd box). Undre grafen (grön ruta) visar smältvatten kurvor härrör från de råvaror data tomter efter normalisering. D. Övre grafen smälta kurva profiler efter automatisk gruppering, olika genotyper visas i olika färger (röd box). Undre grafen (grön ruta) visar fluorescens skillnaden kurvan. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Använda HR. MA för att identifiera mutationer och transgener Fluorescence differenskurvor visas, förändringen i fluorescens (Y-axeln) mot temperatur (x-axeln) visas en.. HRMA användes för att detektera fisk som bär på mutationer i eif2b5 genen. Vild typ visas i grått (pil). Röda och blå färger representerar två olika eif2b5 mutationer, bekräftas av sekvensering av PCR-produkten. B. Fyra olika FOXP2 muterade alleler identifieras med HRMA. Röd: zc82 / + (8 deletion bp), grön: zc83 / + (deletion 17 bp), blå: zc82/zc83 (8 bp deletion/17bp text utgår), grå. Zc83/zc83 (17bp radering homozygoter) C. Gal4 transgen fisk (grå kurva) kan skiljas från vild typ (brun kurva, pil). Lägg märke till att för transgen detektering, normalisering bör inte utföras. Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PCR i kombination med HRMA är en kraftfull teknik för zebrafisk genotypning. Fördelarna med denna metod är dess hastighet, robusthet och känslighet för att upptäcka och med punktmutationer. Hela protokollet från fin-klämma för att smältkurva analys kan utföras på mindre än åtta timmar av en enda individ. Dessutom är tekniken mottaglig för high-throughput screening, inte kräver användning av etidiumbromid, och är tätad för alla PCR-och analyssteg, som hjälper till att minimera föroreningsfrågor.
Ett kritiskt steg för denna teknik är PCR-produkten och primer design. Typisk längd för PCR-produkter i HRMA är 50-200 bp. Korta amplicons öka känsligheten och är idealiska för att upptäcka single nucleotide förändringar. Om smält-kurvor av närbesläktade PCR produkt arter som inte kan skiljas lätt, kan en liten oligonukleotid komplementär till SNP och blockerade vid 3 'änden ingå i PCR-reaktionen (Lunaprobes; probes). Sonderna genereras genom asymmetrisk PCR med användning av olika koncentrationer av den framåt och bakåt primers med en 3'-C3-blockerare för att förhindra prob förlängning i den efterföljande HRMA PCR. Sonden är då ingår i HRMA PCR-reaktionen. HRMA sker sedan med proben, varvid den asymmetriska proben binder till den PCR-produkt och genererar sond-mål-duplexar med olika smältkurvor som kan användas för att särskilja alleler.
Flera företag erbjuder smält-kurvan analyssystem. Dessa inkluderar den Biofire Lightscanner, Roche LightcyclerVR 480 och Qiagen Rotor-Gene Q. Flera fluorescerande, DNA-bindande färgämnen är tillgängliga, inklusive LC Grön PLUS och SYT09 EvaGreen. Det finns en viss variation i känslighet i mutationsdetektion baserade på olika fluorescerande färgämnen och smält curve maskiner 8,15. Icke mättande färgämnen, till exempel SYBR Green I, är olämpliga för de flesta HRMA applikationer: vid höga koncentrationer, SYBR Green I hämningsts aktiviteten av DNA-polymeras, och vid lägre koncentrationer, SYBR Green I kan inte exakt mäta smältbeteende på grund av sin omfördelning från smälta områdena tillbaka till regioner av dsDNA 16. Generellt flesta befintliga Real Time PCR plattformar klarar av preforming HRMA hjälp av ett programpaket tillägg och en andra generationens fluorescerande DNA-bindande färgämne. Även om tekniska detaljer i programvaran och sekvensen av experimentella steg varierar något mellan plattformarna, de övergripande vetenskapliga begrepp är i huvudsak identiska.
Vårt laboratorium och andra har visat att HRMA kan användas i både embryon och vuxna zebrafisk för att detektera transgenes, och mutationer som inducerats av ZFNs och TALENS 6,12,13. HRMA har använts för att upptäcka polymorfism i zebrafisk 6,12. Vårt labb använder HRMA både för initial screening av TALEN-inducerade mutationer samt för sortering av etablerade linjer (TSQ och JLB, opublicerad). Andra potentiella applicatjoner som skulle kunna tillämpas på zebrafisk inkluderar metylering känsliga HRMA (ms-HRMA) 17, kvantifiering av kopierings antal varianter 5, och detektion av patogener i terrarium 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar i Blaschke, Grunwald, och Wittwer labb för rådgivning och teknisk hjälp. Detta arbete stöds av PCMC Foundation, NIH R01 MH092256 och DP2 MH100008, och March of Dimes Foundation forskningsanslag # 1-FY13-425, till JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96-well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| High-resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldehyde |
References
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
- Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
- Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
- Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
- Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
- Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
- Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
- Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
- Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
- Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).
