Summary
PCR kombineret med høj opløsning smelte analyse (HRMA), er dokumenteret som en hurtig og effektiv metode til at genotype zebrafisk.
Abstract
Zebrafisk er en kraftfuld hvirveldyr modelsystem til at studere udvikling, modellering sygdom og udføre drug screening. For nylig en række genetiske værktøjer er blevet indført, herunder flere strategier til at inducere mutationer og generere transgene linier. Dog er storstilet screening begrænset af traditionelle genotypebestemmelse metoder, som er tidskrævende og arbejdskrævende. Her beskriver vi en teknik til at analysere zebrafisk genotyper ved PCR kombineret med høj opløsning smeltepunkt analyse (HRMA). Denne fremgangsmåde er hurtig, følsom og billig, med lavere risiko for artefakter forurening. Genotypebestemmelse ved PCR med HRMA kan anvendes til embryoner eller voksne fisk, herunder high-throughput screening protokoller.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) er et hvirveldyr modelsystem vid udstrækning anvendes til undersøgelser af udvikling og sygdom modellering. For nylig er der blevet udviklet en lang række transgene og mutation teknologier til zebrafisk. Rapid transgenese teknikker, normalt er baseret på en Tol2 transposon system 1 er blevet kombineret med forbedrede kloning muligheder for flere DNA-fragment samling 2. Zinkfinger-nukleaser (ZFNs) og transskription aktivator-lignende effektor nucleaser (TALENS) er blevet anvendt til at målrette loci i både somatiske og germline celler i zebrafisk 3,4. Disse teknikker kan effektivt generere genmodificerede dyr, med høj frekvens mutation skabelse og kim-line transmission 3,4.
Trods disse fremskridt traditionelle genotypebestemmelse teknikker i zebrafisk begrænse den fulde effekt af de mutagenese og transgenese værktøjer. PCR efterfulgt af gelelektroforese, undertiden kombineret med restriction enzymfordøjelsen, er almindeligt anvendt til at detektere genom ændring, men er tidskrævende og mindre følsomme over for identificere små insertioner eller deletioner. TaqMan probeassays har høje startomkostninger og kræver omhyggelig optimering. Sekventering af PCR-produkter kan tage flere dage og er ikke praktisk for stor skala-screening. Restriktionsfragmentlængde-polymorfisme (RFLP)-analyse kan kun skelne SNPs påvirker et begrænset udvalg af restriktionsenzymsteder genkendelsessites.
Høj opløsning smeltende analyse (HRMA), et lukket rør post-PCR-analyse metode, er en nyudviklet metode, der er hurtig, følsom, billig og medgørlige til screening af store antal prøver. HRMA kan anvendes til påvisning af SNP'er, mutationer og transgener 5-7. HRMA er baseret på termisk denaturering af dobbeltstrengede DNA'er, og hver PCR-amplikon har en unik dissociation (smelte) karakteristiske 5. Prøverne kan blive diskrimineret på grund af to deres forskellige nucleotid sammensætning, GC-indhold, eller længde, typisk i kombination med et fluorescerende farvestof, der kun binder dobbeltstrenget DNA 8. Således kan HRMA skelne mellem forskellige genotyper baseret på de forskellige smelte-kurve egenskaber. Fordi HRMA bruger billige reagenser og er et enkelt trin post-PCR-processen, kan det bruges til high-throughput strategier. HRMA er destruktiv, så følgende analyse PCR-amplikonerne kan bruges til andre formål. HRMA er blevet anvendt i mange organismer og systemer, herunder cellelinjer, mus og mennesker 9-11. Dens anvendelse er for nylig blevet beskrevet i zebrafisk til at opdage mutationer induceret af zink finger nucleaser (ZFNs) og Talens 6,12,13.
I dette papir, beskriver vi, hvordan du udfører PCR-baseret HRMA i embryonale og voksne zebrafisk (figur 1). Denne protokol er egnet til påvisning af SNP'er, transgenerne, og mutationer, herunder single basepar ændringer, indsættelser eller sletninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. DNA-forberedelse
- Forbered DNA lysis buffer: 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCI pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Tilføj frisk proteinase K til en slutkoncentration på 1 mg / ml på dagen for brug 12..
- Tissue samling:
- For voksne fisk fin clip:
- Bedøver fisk: Læg fisken i 0,004% MS-222 (tricaine) løsning. Vent gælle bevægelse langsommere.
- Sæt fisk på en stak af 5-10 Kimwipes og skære et lille stykke af halefinnen, omkring 2-3 mm, med et sterilt barberblad.
- Placer hurtigt fisken i en mærket beholder med frisk vand til nyttiggørelse, omhyggeligt mærke både tanken og tilhørende rør, der indeholder den fin klip. Skift vandet og fodre fisk hver anden dag.
- Saml finnen klip med en steril pipette spids og overføre det til et rør fyldt med 100 ul DNA lysisbuffer.
- Kassér pipettespidsen og barberblad kassere ind i en affaldsbeholder.
- For embryo tail clip:
- Placer embryoner i 0,004% MS-222 (tricaine) løsning. Vent 2 min.
- Klip et stykke hale med en pincet under et dissektionsmikroskop.
- Sæt halen i et mærket rør fyldt med 30 pi DNA-lysisbuffer.
- Hurtigt sætte embryo i et rør indeholdende 100 ul 4% paraformaldehyd.
- Label rør med embryoner og deres tilsvarende hale rør.
- Opbevar rør med embryoner ved 4 ° C natten over til fiksering.
- Rengør pincet hjælp Milli-Q vand og Kimwipes mellem hver foster for at minimere forurening.
- For hele embryoner:
- Placer embryoner i 0,004% MS-222 (tricaine) løsning. Vent 2 min.
- Put 1-5 embryoner i et rør fyldt med 100 ul DNA-lysisbuffer. Dechorionation er ikke nødvendig.
- For voksne fisk fin clip:
- DNA fordøjelse
Inkuber rør med væv (FIN eller hale klip eller embryoner) ved 55 ° Ci 4 timer op til natten 12. - Inaktivere proteinase K
Heat rør til 95 ° C i 15 min 12.. DNA skal anvendes til PCR med det samme eller opbevaret ved -20 ° C i op til 3 måneder.
2. PCR
- Design Primere enten manuelt eller ved primer design software (f.eks Lightscanner Primer Design Software-Biofire). PCR-produkter til HRMA er normalt 50-200 bp; PCR-produkter til SNP detektion bør være mindre, typisk 50-80 bp.
- PCR
- Udføre PCR-reaktionen i en 96-brønd eller 384-brønds plade.
- Anvend 10 ul totalvolumen: 4 pi LightScanner stamblanding (0,1 U hot-start Taq-AB-polymerase, buffer, 0,2 mM dNTP'er, 2 mM magnesiumchlorid og 1x fluorescerende dobbeltstrenget DNA-bindende farvestof), 5 pmol af hver primer og 1 pi genomisk DNA-template ekstraheret fra voksen halefinne eller 3 pi genomisk DNA fra embryonale hale 13.
- Cover prøver med 30 ul mineralolie. Dæk pladen med en optisk transparent selvklæbende forsegling.
- Optimer PCR cyklusbetingelser-typiske betingelser er 95 ° C i 5 minutter og 30 cyklusser af 10 sekunder ved 95 ° C, 25 sek ved 60 ° C, 30 sek ved 72 ° C og sluttede med 95 ° C i 30 sekunder og afkølet til 15 ° C.
- Opbevar PCR-plader ved 4 ° C eller fortsætte direkte til HRMA.
- Bekræfte vores PCR-produkt ved analyse af dets størrelse ved hjælp af agarosegelelektroforese under indledende optimering af PCR, og hvis indiceret, ved sekventering af PCR-produktet.
3. HRMA
- Heat plader
- Placer pladen i en smelte analysesystem.
- Åbn softwaren (LightScanner Software Call-IT 2.0).
- Varmegulvplader 60-95 ° C.
- Opret en ny storage datafil.
- Analyser HRMA data (figur 2).
Det er muligt at flere trin af analysen. Vi viser de mest almindeligt anvendte datasæt manipulations.- Subset indstilling
Klik fanen Subset. Vælg brøndene med prøverne. - Normalisering
- Vælg fanen Normalize i venstre panel. For at eliminere fluorescens varians, manuelt placere parallel dobbelt-line i pre-(indledende) og indlæg (endelig)-melt regioner som illustreret (Figur 2C, pilespidser) og normalisere premelt og post-melt fluorescens signaler fra alle prøver til 1 og 0 henholdsvis 14.
- Juster placeringen af linjer, så smelte region er i området mellem det præ-og post-melt linjer, men ikke valgt. I almindelighed, Lower Min og Nedre Max (og Øvre Min og Upper Max) temperatur linjer skal anbringes omtrent 1 ° C fra hinanden.
- Vælg temperatur positioner for normalisering, således at alle prøver har maksimal eller fuld (100%) fluorescens for premelt regionen og minimal eller ingen (0%) fluorescens til post-smelte region (så godt som muligt). Normalisering bør resultere i en næsten vandret linie ved den maksimale fluorescens 1, der strækker sig indtil smeltepunktet og derefter en næsten vandret linie fra smeltepunkt på mindst fluorescens fra 0, og der bør ikke være fluorescens-niveauer over 1 eller under 0 . For eksempel i figur 2C, normalisere forsmelte kurver ved hjælp af temperaturområder af 79-80 ° C.
- Gruppering / Clustering
Skelne genotyper baseret på deres smeltetemperatur (figur 2C, grøn boks). Vælg gruppering.- Vælg Autogruppér fra standarderne valgliste under Gruppering sektionen.
- Vælg Normal eller Høj til at smelte profiler med enkelte overgange eller flere overgange fra henholdsvis valgliste af følsomhed under Gruppering sektionen.
- Vælg ComputeGrupper under Gruppering sektion.
- Gå til menuen Filer, og klik på Gem for at gemme resultaterne.
- Subset indstilling
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen kan udføres i løbet af en enkelt dag eller separeret i trin over flere dage (rutediagram arbejde er vist i figur 1). DNA-ekstraktion efterfulgt af smelten og analyse af PCR amplikoner. Temperaturerne for smelte af amplikonet afhænge af størrelsen og GC-indhold, men generelt start og slut temperaturer på 50 ˚ C og 95 ˚ C er passende (figur 2A og 2B). Når smelten udføres, kræver typisk analyse af fluorescens melt kurver normalisering af variationen i de forskellige prøve kurver, ved hjælp af præ-og post-melt regioner standarder (figur 2C). Dette forbedrer sammenligning af resultater fra forskellige prøver, hvor variationen af fluorescens er relateret til mindre eksperimentelle variationer. Hvert par af temperatur linjer for normalisering bør placeres ca 1 ˚ C fra hinanden (figur 2C, pilespidser)., Gruppering af data resulterer er repræsenteret på to forskellige måder: en øvre graf, der viser smelte kurve profiler, og en nederste graf, der viser en subtraktiv forskel plot i forhold til en reference prøve (figur 2D).
HRMA analyse kan anvendes til påvisning af mutationer (figur 3A og 3B) eller transgener (figur 3C). I figur 3A, er to forskellige mutationer i eif2b5 gen vist (rød og blå kurver i figur 3A) ved at subtrahere de normaliserede fluorescens data for vildtype-prøve. Det er ligegyldigt, hvilken genotype er valgt som reference. Kan skelnes mere subtile eller forvirrende forskelle i smelte-kurver ved at bruge den subtraktive forskel plot. I figur 3B er et eksempel på fire forskellige genotyper i en enkelt samling af embryoner vist.
Figur 1. Skitse af protokol for PCR-baseret HRMA af zebrafisk genomisk DNA. DNA-ekstraktion fra hele væv (fin-clip eller foster) er efterfulgt af PCR-amplifikation i nærværelse af en fluorescerende dobbeltstrenget DNA-bindende farvestof. PCR-amplikon denatureres og fluorescens-signalet registreres, efterfulgt af smelte-kurve analyse til påvisning af amplikonet og / eller differentiere genotyper.
Figur 2.. Screen-shots af software til at udføre HRMA og analysere resultaterne. A. B gule boks er forstørret i "B" Screen shot af LightScanner software.. Forstørret billede af indrammede område i "A". Indstilling Start og Slut Temp vises (pile). C. Placer premelt og post-melt parallelle linjer for normalisering (pilespidser). Læg mærke til fluorescens varians i præ-og post-smeltende regioner (rød boks). Nederste graf (grøn boks) viser melt-kurverne, der stammer fra de rå data plots efter normalisering. D. Øverste graf viser smelte kurve profiler efter automatisk gruppering, forskellige genotyper er illustreret i forskellige farver (rød boks). Nederste graf (grøn boks) viser fluorescens forskellen kurve. Klik her for at se større billede.
Figur 3. Brug HR. MA at identificere mutationer og transgener Fluorescens forskel kurver vist, ændring i fluorescens (y-akse) over for temperatur (x-akse) er vist A.. HRMA blev anvendt til at detektere fisk bærer mutationer i eif2b5 genet. Vildtype er gråt (pil). Rød og blå farver repræsenterer to forskellige eif2b5 mutationer, bekræftet ved sekventering af PCR-produktet. B. Fire forskellige FOXP2 mutantalleler er identificeret med HRMA. Rød: zc82 / + (8 bp sletning), grøn: zc83 / + (17 bp sletning), blå: zc82/zc83 (8bp deletion/17bp udgår), grå:. Zc83/zc83 (17bp sletning homozygote) C. Gal4 transgene fisk (grå kurver) kan skelnes fra vildtype (brun kurve, pil). Bemærk, at for transgen detektion, normalisering bør ikke udføres. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PCR kombineret med HRMA er en kraftfuld teknologi til zebrafisk genotypebestemmelse. Fordelene ved denne metode er dens hastighed, robusthed og følsomhed til at påvise selv punktmutationer. Hele protokollen, fra fin-clip at smelte-kurve analyse kan udføres på mindre end otte timer af en enkelt person. Hertil kommer, at teknikken er modtagelig for high-throughput screening ikke kræver anvendelse af ethidiumbromid, og er forseglet for alle PCR og analyse trin, som hjælper med at minimere forureningsproblemerne.
Et afgørende skridt for denne teknik er PCR-amplikon og primer design. Typisk længde for PCR-produkter i HRMA er 50-200 bp. Korte amplikoner øge følsomheden og er ideelle til at detektere en enkelt nukleotid ændringer. Hvis der ikke kan skelnes let smelte-kurver af nært beslægtede PCR-produkt art, kan et lille oligonukleotid komplementær til SNP og blokeret i 3'-enden inkluderes i PCR-reaktionen (Lunaprobes; probes). Proberne er genereret ved asymmetrisk PCR under anvendelse af forskellige koncentrationer af forward og reverse primere med en 3 'C3 blocker at forhindre probeforlængelse i den efterfølgende HRMA PCR. Sonden er derefter medtaget i HRMA PCR-reaktionen. HRMA sker derefter med proben, hvor den asymmetriske probe binder til PCR-produktet og genererer probe-mål-duplexer med forskellige smelte-kurver, der kan anvendes til at skelne mellem alleler.
Flere selskaber tilbyder smelte-kurve analysesystemer. Disse omfatter den Biofire Lightscanner, Roche LightcyclerVR 480 og Qiagen Rotor-Gene Q. Adskillige fluorescerende, DNA-bindende farvestoffer er tilgængelige, herunder LC Green PLUS og SYT09 EvaGreen. Der er en vis variation i følsomhed i mutation detektion baseret på forskellige fluorescerende farvestoffer og smelte-kurve maskiner 8,15. Nonsaturating farvestoffer, for eksempel, SYBR Green I, er uegnet til de fleste HRMA anvendelser: ved høje koncentrationer, SYBR Green I hæmningts aktiviteten af DNA-polymerase, og ved lavere koncentrationer, SYBR Green I kan ikke præcist måle smelteopførsel grundet dens omfordeling fra smeltede regioner tilbage til områder af dsDNA 16. Generelt fleste eksisterende Real Time PCR-platforme er i stand til preforming HRMA hjælp af en software-pakke add-on og en anden generation fluorescerende DNA-bindende farvestof. Mens tekniske detaljer af softwaren og rækkefølge af eksperimentelle trin variere lidt mellem platforme, de overordnede videnskabelige begreber er stort set identiske.
Vores lab og andre har vist, at HRMA kan bruges i både embryonale og voksne zebrafisk til at opdage transgener, og mutationer induceret af ZFNs og Talens 6,12,13. HRMA er blevet anvendt til at finde polymorfier i zebrafisk 6,12. Vores lab bruger HRMA både for indledende screening af TALEN-inducerede mutationer samt til sortering af etablerede linier (TSQ og JLB, upubliceret). Andre potentielle applicationer, der kan anvendes til at zebrafisk omfatte methylering-følsomme HRMA (ms-HRMA) 17, kvantificering af copy-nummer varianter 5, og påvisning af patogener i vivariums 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer af Blaschke, Grunwald, og Wittwer Labs for rådgivning og teknisk assistance. Dette arbejde er støttet af PCMC Foundation, NIH R01 MH092256 og DP2 MH100008, og March of Dimes Foundation forskningsbevilling # 1-FY13-425, til JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96-well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| High-resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldehyde |
References
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
- Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
- Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
- Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
- Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
- Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
- Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
- Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
- Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
- Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).
