Summary
PCR combinata con alta risoluzione melt analisi (HRMA) è dimostrato come un metodo rapido ed efficace al genotipo zebrafish.
Abstract
Zebrafish è un potente sistema modello vertebrato per studiare lo sviluppo, la modellazione della malattia, e l'esecuzione di screening di stupefacenti. Recentemente una varietà di strumenti genetici sono state introdotte, tra cui più strategie per indurre mutazioni e la generazione di linee transgeniche. Tuttavia, lo screening su larga scala è limitato con metodi tradizionali di genotipizzazione, che sono termini di tempo e di manodopera. Qui si descrive una tecnica per analizzare i genotipi di zebrafish per PCR combinato con alta risoluzione fusione di analisi (HRMA). Questo approccio è rapido, sensibile e poco costoso, con un minor rischio di artefatti contaminazione. Genotipizzazione mediante PCR con HRMA può essere utilizzato per gli embrioni o pesci adulti, anche nei protocolli di screening high-throughput.
Introduction
Zebrafish (Danio rerio) è un sistema modello vertebrato ampiamente usato per studi di sviluppo e modellazione della malattia. Recentemente, numerose tecnologie transgeniche e mutazione sono stati sviluppati per zebrafish. Tecniche di transgenesi rapida, di solito basati su un sistema di trasposoni Tol2 1, sono stati combinati con le opzioni di clonazione migliorate per aerei frammento di DNA di montaggio 2. Nucleasi zinc-finger (ZFNs) e trascrizione nucleasi effettrici attivatore-like (Talens) sono stati utilizzati per indirizzare loci in entrambe le cellule somatiche e germinali in zebrafish 3,4. Queste tecniche possono efficacemente generare animali geneticamente modificati, con la creazione mutazione ad alta frequenza e la trasmissione germinale 3,4.
Nonostante questi progressi, tecniche di genotipizzazione tradizionali in zebrafish limitano tutta la potenza degli strumenti di mutagenesi e transgenesi. PCR seguita da elettroforesi su gel, a volte combinati con RESTRIZIONn digestione enzimatica, è ampiamente utilizzato per rilevare modifiche genoma, ma richiede tempo e meno sensibile per identificare piccole inserzioni o delezioni. Saggi sonda TaqMan hanno elevati costi iniziali e richiedono un'attenta ottimizzazione. Sequenziamento dei prodotti di PCR può richiede parecchi giorni e non è pratico per lo screening su larga scala. Frammento di restrizione polimorfismo della lunghezza (RFLP) analisi può discriminare solo SNPs che colpiscono un numero limitato di siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione.
Ad alta risoluzione fusione analisi (HRMA), un post-PCR metodo di analisi chiuso tubo, è un metodo sviluppato di recente che è rapida, sensibile, poco costoso, e suscettibili di screening di un gran numero di campioni. HRMA può essere utilizzato per rilevare SNP, mutazioni, e transgeni 5-7. HRMA è basato su denaturazione termica di DNA a doppio filamento, e ogni amplicone PCR ha un unico dissociazione (melt) caratteristica 5. I campioni possono essere discriminati a causa to la loro diversa composizione nucleotidica, contenuto di GC, o lunghezza, tipicamente in combinazione con un colorante fluorescente che si lega solo a doppio filamento di DNA 8. Così, HRMA può distinguere diversi genotipi in base alle diverse caratteristiche melt-curva. Poiché HRMA utilizza reagenti economici ed è un passo singolo processo di post-PCR, può essere utilizzato per strategie ad alto rendimento. HRMA è non distruttiva, così in seguito all'analisi gli ampliconi della PCR possono essere utilizzati per altre applicazioni. HRMA è stato applicato in molti organismi e sistemi, inclusi linee cellulari, topi e nell'uomo 9-11. Il suo uso è stato recentemente descritto in zebrafish per rilevare le mutazioni indotte da nucleasi dito di zinco (ZFNs) e Talens 6,12,13.
In questo articolo, descriviamo come eseguire HRMA PCR-based in zebrafish embrionali e adulte (Figura 1). Questo protocollo è adatto per rivelare SNP, transgeni, e mutazioni, comprese SINGLE modifiche base-pair, inserimenti o eliminazioni.
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Protocol
1. Preparazione del DNA
- Preparare DNA tampone di lisi: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Aggiungi fresco proteinasi K a una concentrazione finale di 1 mg / ml il giorno di utilizzo 12.
- Collezione Tessuto:
- Per l'adulto clip di pinna di pesce:
- Anestetizzare il pesce: Mettere il pesce in 0,004% MS-222 la soluzione (tricaine). Attendere fino a quando il movimento branchia rallenta.
- Mettere pesce su una pila di 5-10 Kimwipes e tagliare un piccolo pezzo di pinna caudale, circa 2-3 mm, con una lama di rasoio sterile.
- Introdurre rapidamente il pesce in un serbatoio etichettato con acqua dolce per recupero; etichettare accuratamente sia il serbatoio e tubo corrispondente che conterrà la clip pinna. Cambiare l'acqua e alimentare il pesce ogni altro giorno.
- Sollevare la clip pinna con un puntale sterile e trasferirlo in un tubo riempito con 100 microlitri di buffer di lisi del DNA.
- Gettare la punta della pipetta, e scartare il lametta in un apposito contenitore.
- Per la clip di embrione di coda:
- Mettere gli embrioni in 0,004% MS-222 la soluzione (tricaine). Attendere 2 min.
- Tagliare un pezzo di coda con una pinza sotto un microscopio da dissezione.
- Mettere la coda in una provetta riempita con 30 microlitri DNA tampone di lisi.
- Mettere rapidamente l'embrione in un tubo contenente 100 ml paraformaldeide al 4%.
- Etichettare le provette con embrioni e dei loro tubi di coda corrispondenti.
- Conservare le provette con embrioni a 4 ° C durante la notte per il fissaggio.
- Pulire le pinze con acqua Milli-Q e Kimwipes tra ogni embrione per minimizzare la contaminazione.
- Per gli embrioni interi:
- Mettere gli embrioni in 0,004% MS-222 la soluzione (tricaine). Attendere 2 min.
- Mettere 1-5 embrioni in un tubo riempito con 100 microlitri di tampone di lisi DNA. Dechorionation non è necessario.
- Per l'adulto clip di pinna di pesce:
- Digestione DNA
Incubare le provette con il tessuto (o pinna di coda clip o embrioni) a 55 ° Cper 4 ore fino a tutta la notte 12. - Inattivare il proteinasi K
Tubi di calore a 95 ° C per 15 min 12. DNA deve essere usato per la PCR immediatamente o conservato a -20 ° C per 3 mesi.
2. PCR
- Primer design manualmente o mediante iniettore software di progettazione (es. Lightscanner Primer Design Software-Biofire). I prodotti di PCR per HRMA sono di solito 50-200 bp; prodotti di PCR per il rilevamento SNP dovrebbero essere più piccole, tipicamente 50-80 bp.
- PCR
- Eseguire reazione di PCR in una piastra a 96 pozzetti o 384 pozzetti.
- Utilizza 10 microlitri volume totale: 4 microlitri master mix LightScanner (0,1 U hot-start Taq-AB polimerasi, tampone, 0.2 dNTP mm, 2 mm cloruro di magnesio, e 1x fluorescente DNA-binding dye a doppio filamento); 5 pmol ciascun primer, e 1 ml modello di DNA genomico estratto da pinna caudale adulti o 3 ml di DNA genomico da coda embrionale 13.
- Campioni Coprire con 30 ml di olio minerale. Coprire la piastra con un sigillo adesivo otticamente trasparente.
- Ottimizzare PCR-ciclismo condizioni tipiche condizioni sono 95 ° C per 5 minuti e 30 cicli di 10 secondi a 95 ° C, 25 sec a 60 ° C, 30 sec a 72 ° C, che termina con 95 ° C per 30 sec e raffreddati a 15 ° C.
- Conservare le piastre PCR a 4 ° C o direttamente continuano a HRMA.
- Confermare il prodotto di PCR mediante analisi della sua dimensione mediante elettroforesi su gel di agarosio durante l'ottimizzazione iniziale di PCR, e se indicato, mediante sequenziamento del prodotto PCR.
3. HRMA
- Piastre di calore
- Posizionare la piastra in un sistema di analisi melt.
- Aprire il software (LightScanner Software Call-IT 2.0).
- Piastre di calore 60-95 ° C.
- Creare un nuovo file di archiviazione dei dati.
- Analizzare i dati HRMA (Figura 2).
Più passaggi di analisi sono possibili. Mostriamo il set più comunemente usato di dati manipulations.- Impostazione sottoinsieme
Fare clic sulla scheda sottoinsiemi. Selezionare i pozzetti con i campioni. - Normalizzazione
- Selezionare la scheda Normalize nel pannello di sinistra. Per eliminare la fluorescenza varianza, posizionare manualmente la doppia linea parallela in pre-(iniziale) e le regioni posto (finale)-fusione come illustrato (Figura 2C, punte di freccia) e normalizzare prefusione e fluorescenza post-fusione segnali di tutti i campioni a 1 e 0 rispettivamente 14.
- Regolare il posizionamento delle linee in modo che la regione di fusione è nella regione tra le linee pre-e post-fusione, ma non selezionato. In generale, la Bassa Min e Max Inferiore (e Alto Min e Max Superiore) le linee di temperatura devono essere posizionati a circa 1 ° C a parte.
- Scegliere posizioni di temperatura per la normalizzazione tale che tutti i campioni hanno (100%) fluorescenza massima o totale per la regione Premelt e minimo o nullo (0%) fluorescenza per la regione post-fusione (come meglio posbile). Normalizzazione dovrebbe comportare una linea quasi orizzontale nella fluorescenza massimo 1 che si estende fino al punto di fusione e poi una linea quasi orizzontale dal punto di fusione alla fluorescenza minimo di 0, non ci dovrebbe essere livelli di fluorescenza 1 o minori di 0 . Per esempio, nella Figura 2C, normalizzare le curve prefusione utilizzando intervalli di temperatura di 79-80 ° C.
- Raggruppamento / Clustering
Distinguere genotipi in base alla loro temperatura di fusione (Figura 2C, scatola verde). Selezionare Raggruppamento.- Selezionare Autogroup dall'elenco di selezione Standards sotto la sezione Raggruppamento.
- Selezionare Normale o Alta per la fusione dei profili con i singoli passaggi o più transizioni rispettivamente dalla lista di selezione di sensibilità nella sezione Raggruppamento.
- Seleziona ComputeGruppi nella sezione Raggruppamento.
- Vai al menu File e fare clic su Salva per salvare i risultati.
- Impostazione sottoinsieme
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Representative Results
Il protocollo può essere eseguita durante un singolo giorno o separato in fasi di diversi giorni (diagramma di flusso di lavoro è mostrata in Figura 1). Estrazione del DNA è seguita dalla fusione e analisi di ampliconi PCR. Le temperature per la fusione del amplicone dipendono dalle dimensioni e GC-contenuti, ma iniziano in genere e temperature finali di 50 ˚ C e 95 ˚ C siano appropriate (Figure 2A e 2B). Una volta eseguita la fusione, analisi delle curve di fluorescenza melt richiede tipicamente normalizzazione della variazione delle diverse curve di esempio, usando regioni post-melt pre-e come standard (Figura 2C). Questo migliora confronto dei risultati dei vari campioni in cui la variazione di fluorescenza è legato alle variazioni sperimentali minori. Ogni coppia di linee di temperatura per la normalizzazione deve essere collocato circa 1 ˚ C a parte (Figura 2C, punte di freccia).; Raggruppamento dei risultati dei dati è rappresentato in due modi diversi: un grafico superiore che mostra profili curva di fusione, e un grafico inferiore che mostra una differenza trama sottrattiva rispetto ad un campione di riferimento (Figura 2D).
Analisi HRMA può essere utilizzato per rilevare mutazioni (figure 3a e 3b) o transgeni (Figura 3C). Nella Figura 3A, due mutazioni differenti in gene EIF2B5 sono mostrati (curve rosse e blu nella Figura 3A) sottraendo i dati di fluorescenza normalizzati del campione wild-type. Non importa quale genotipo è scelto per riferimento. Differenze più sottili o confusione in fusione curve possono essere distinti utilizzando la differenza trama sottrattiva. Nella Figura 3B, è mostrato un esempio di quattro genotipi differenti in un singolo insieme di embrioni.
Figura 1. Schema di protocollo per HRMA basato su PCR di zebrafish DNA genomico. Estrazione del DNA da tessuto intero (pinna-clip o embrione) è seguita da amplificazione PCR in presenza di un legante il DNA a doppio filamento colorante fluorescente. L'amplicone PCR viene denaturato e segnale di fluorescenza viene registrato, seguita da analisi melt-curva, per rilevare l'amplicone e / o per differenziare genotipi.
Figura 2. Screen-shots di software per eseguire HRMA e analizzare i risultati. A. Schermata di software LightScanner;. Riquadro giallo è amplificato in "B" B. Vista della regione inscatolato ingrandita in "A". Impostazione di inizio e fine Temp sono presenti (frecce). C. Posizionare il Premelt e linee di post-fusione paralleli per la normalizzazione (frecce). Notate la variazione di fluorescenza in pre-e regioni post-fusione (box rosso). Grafico inferiore (riquadro verde) indica melt curve derivanti dalle trame di dati grezzi seguente normalizzazione. D. Spettacoli grafico superiore fondono profili curva dopo il raggruppamento automatico; diversi genotipi sono illustrati in colori diversi (box rosso). Grafico inferiore (riquadro verde) mostra la curva differenza di fluorescenza. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Uso HR. MA per identificare le mutazioni e transgeni fluorescenza curve di differenza sono presenti; cambiamento di fluorescenza (asse y) alla temperatura (asse x) viene.. HRMA stato usato per rilevare pesci portatori di mutazioni nel gene EIF2B5. Wild type è mostrata in grigio (freccia). Colori rosso e blu rappresentano due diverse mutazioni EIF2B5, confermati mediante sequenziamento del prodotto della PCR. B. Quattro diversi alleli mutanti FOXP2 sono identificati con HRMA. Rosso: zc82 / + (8 soppressione bp), verde: zc83 / + (17 bp delezione), blu: zc82/zc83 (8bp deletion/17bp soppressione), grigio:. Zc83/zc83 (omozigoti soppressione 17BP) C. Pesci transgenici Gal4 (curve di grigio) può essere distinto da wild type (curva marrone, freccia). Si noti che per il rilevamento transgene, la normalizzazione non deve essere eseguita. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
PCR combinata con HRMA è una potente tecnologia per la genotipizzazione zebrafish. I vantaggi di questo approccio sono la velocità, robustezza e sensibilità per rilevare anche mutazioni puntiformi. L'intero protocollo, dalla pinna-clip analisi per fondere curva, può essere eseguito in meno di otto ore da un singolo individuo. Inoltre, la tecnica è suscettibile di screening ad alto rendimento, non richiede l'uso di bromuro di etidio, ed è sigillato per tutta PCR e fasi di analisi che aiuta a ridurre i problemi di contaminazione.
Un passo fondamentale per questa tecnica è amplicone PCR e design primer. Lunghezza tipica per i prodotti di PCR in HRMA è 50-200 bp. Ampliconi brevi aumentano la sensibilità e sono ideali per rilevare le variazioni di un singolo nucleotide. Se Melt-curve di specie strettamente correlate prodotto PCR non possono distinguere facilmente, un piccolo oligonucleotide complementare al SNP e bloccato all'estremità 3 'può essere incluso nella reazione PCR (Lunaprobes; sondas). Le sonde sono generati da asimmetrica PCR utilizzando diverse concentrazioni del forward e reverse primer, con un 3 'bloccanti C3 per prevenire l'estensione sonda nella successiva HRMA PCR. La sonda viene poi inserita nella reazione PCR HRMA. HRMA poi si verifica con la sonda, in cui la sonda asimmetrica lega al prodotto di PCR e genera duplex sonda-bersaglio con differenti melt-curve che possono essere utilizzati per distinguere alleli.
Diverse compagnie offrono sistemi di analisi melt-curva. Questi includono il Biofire Lightscanner, la Roche LightcyclerVR 480 e Qiagen Rotor-Gene Q. Diversi fluorescenti, DNA-binding coloranti sono disponibili, compreso LC Green Plus e SYT09 EvaGreen. Vi è una certa variazione di sensibilità nella rilevazione di mutazioni basati su tinture fluorescenti diversi e macchine fuso curva 8,15. Nonsaturating coloranti, per esempio, SYBR Green I, non sono adatti per la maggior parte delle applicazioni HRMA: ad alte concentrazioni, SYBR Green I inibizionets l'attività della DNA polimerasi; ed a concentrazioni inferiori, SYBR Green I non può misurare con precisione il comportamento di fusione per la sua ridistribuzione dalle regioni fuse ritorna regioni di dsDNA 16. In generale le piattaforme Real Time PCR più esistenti sono in grado di preformatura HRMA utilizzando un pacchetto software add-on ed una seconda generazione di DNA colorante fluorescente vincolante. Mentre i dettagli tecnici del software e la sequenza delle fasi sperimentali variano leggermente tra le piattaforme, i concetti scientifici generali sono sostanzialmente identiche.
Il nostro laboratorio e altri hanno dimostrato che HRMA può essere utilizzato sia in zebrafish embrionali e adulte per rilevare transgeni, e mutazioni indotte da ZFNs e Talens 6,12,13. HRMA è stato usato per scoprire polimorfismi in zebrafish 6,12. Il nostro laboratorio utilizza HRMA sia per lo screening iniziale delle mutazioni TALEN-indotte, nonché per l'ordinamento dei principi stabiliti (TSQ e JLB, inedito). Altro potenziale Applicationi che potrebbero essere applicati a zebrafish sono metilazione-sensibile HRMA (ms-HRMA) 17, la quantificazione di copia-varianti di numero 5 e rilevamento del patogeno in terrari 18.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri delle Blaschke, Grunwald, e Wittwer laboratori per consulenza e assistenza tecnica. Questo lavoro è supportato dalla Fondazione PCMC, NIH R01 MH092256 e DP2 MH100008, e la March of Dimes Foundation assegno di ricerca # 1-FY13-425, a JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96-well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| High-resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldehyde |
References
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