Summary
高解像度融解分析（HRMA）と合わせPCRは、ゼブラフィッシュの遺伝子型を決定するための迅速かつ効率的な方法として示されている。
Abstract
ゼブラフィッシュは、発達を研究する疾患をモデル化し、薬物スクリーニングを行うための強力な脊椎動物モデル系である。最近、遺伝のさまざまなツールが突然変異を誘発し、トランスジェニック系統を生成するための複数の戦略を含め、導入されている。しかしながら、大規模スクリーニングは、時間がかかり、労働集約的であり、伝統的な遺伝子型決定法によって制限される。ここでは、高分解能融解分析（HRMA）と組み合わせたPCRによるゼブラフィッシュの遺伝子型を分析するための技術が記載されている。このアプローチは、汚染の成果物のリスクが低いと、迅速、高感度、かつ安価である。 HRMAとPCRによる遺伝子型決定は、ハイスループットスクリーニングプロトコルを含めて、胚または成体の魚のために使用することができる。
Introduction
ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） が広く開発および疾患モデルの研究のために使用脊椎動物モデル系である。最近では、数々のトランスジェニック、突然変異の技術は、ゼブラフィッシュのために開発されている。通常、トランスポゾンシステム1に基づいた迅速な遺伝子導入技術は、複数のDNA断片の集合体2のための改良されたクローン作成オプションと組み合わされている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENS）は、ゼブラフィッシュの3,4の両方の体細胞および生殖細胞系列の細胞に遺伝子座を標的とするために使用されてきた。これらの技術は、効率的に高周波突然変異の作成 および生殖系列伝達3,4と、遺伝子改変動物を生成することができる。
これらの進歩にもかかわらず、ゼブラフィッシュの伝統的なジェノタイピング技術は、変異誘発および遺伝子導入ツールのフルパワーを制限している。 PCRは、時にはrestrictioと組み合わせ、ゲル電気泳動、続いてnは消化酵素、広くゲノム改変を検出するために使用されるが、小さな挿入または欠失を同定するための時間がかかり、あまり敏感である。 TaqManプローブアッセイは、高い初期コストが、慎重な最適化を必要とする。 PCR産物の配列決定は数日かかると大規模なスクリーニングには実用的ではないができる。制限断片長多型（RFLP）分析は、唯一の制限酵素認識部位の限られた範囲に影響を与えるSNPを識別することができる。
高解像度融解分析（HRMA）、閉じたチューブのポスト-PCR分析法は、迅速、高感度、安価で、かつ多数のサンプルをスクリーニングに適している最近開発された方法である。 HRMAのSNPは、突然変異、および5-7導入遺伝子を検出するために使用することができる。 HRMAは、二本鎖DNAの熱変性に基づくものであり、各PCRアンプリコンは、特徴的な固有の解離（溶湯）5を有している。サンプルは、tと判別することができるそれらの異なるヌクレオチド組成、GC含量、または長さが、O、通常、二本鎖DNA に結合する8蛍光色素と組み合わせて含む。従って、HRMAは、異なる溶融曲線の特性に基づいて、異なる遺伝子型を区別することができる。 HRMAは、低コストの試薬を使用し、シングルステップのポストPCR処理であるため、ハイスループット戦略のために使用することができる。 HRMAので分析後のPCRアンプリコンが他の用途に使用することができ、非破壊である。 HRMA、細胞株、マウス、およびヒト9-11を含む、多くの生物およびシステムに適用されている。その使用は、最近、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）およびTALENS 6,12,13によって誘発される突然変異を検出するために、ゼブラフィッシュに記載されている。
本論文では、胚および成体ゼブラフィッシュ（ 図1）でPCRベースHRMAの実行方法について説明します。このプロトコルは、Siを含む、SNPは、導入遺伝子、および突然変異を検出するのに適しているngle塩基対の変化、挿入、または欠失。
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Protocol
1。 DNAの準備
- 50mMのKCl、10mMのトリス-HCl、pH8.3、0.3％のTween20、0.3％NP40：DNA溶解緩衝液を調製する。使用12日の1ミリグラム/ mlの最終濃度になるように、新鮮なプロテイナーゼKを追加します。
- 組織収集：
- 成魚フィンクリップの場合：
- 魚を麻酔：0.004％、MS-222（トリカイン）溶液中に魚を置きます。鰓の動きが遅くなるまで待ってください。
- 5月10日キムワイプのスタック上に魚を入れて滅菌したカミソリの刃で、テールフィン、2〜3mm程度の小片をカット。
- すぐに回復のための新鮮な水とラベルされたタンクに魚を置き、慎重にフィンクリップが含まれていますタンクとそれに対応するチューブの両方にラベルを付ける。水を変更し、一日おきに魚を食べます。
- 無菌ピペットチップでフィンのクリップをピックアップし、100μlのDNA溶解緩衝液で満たされたチューブに転送します。
- ピペットチップを廃棄して、鋭利物容器にカミソリの刃を捨てる。
- 胚テールクリップの場合：
- 0.004％のMS-222（トリカイン）溶液中に胚を置きます。 2分待ちます。
- 解剖顕微鏡下でピンセットで尾の部分をカット。
- 30μlのDNA溶解緩衝液で満たされたラベルチューブに尾を置く。
- すぐに100μlの4％パラホルムアルデヒドを含むチューブに胚を置く。
- 胚およびそれに対応する尾管をラベルチューブ。
- 固定用の4℃で一晩胚を試験管に保管してください。
- 汚染を最小限に抑えるために各胚の間でミリQ水とキムワイプを使用して鉗子を清掃してください。
- 全体の胚の場合：
- 0.004％のMS-222（トリカイン）溶液中に胚を置きます。 2分待ちます。
- 100μlのDNA溶解緩衝液で満たされたチューブ内で1-5胚を置く。 Dechorionationは必要ありません。
- 成魚フィンクリップの場合：
- DNA消化
55℃で組織（FINあるいはテールクリップや胚）でチューブをインキュベートします一晩12に4時間のアップのため。 - プロテイナーゼKを不活性化
15分12 95℃まで熱管。 DNAは直ちにPCRに使用するか、最大3ヶ月間-20℃で保存する必要があります。
2。 PCR法
- 設計プライマー手動またはプライマー設計ソフトウェア（ 例えば Lightscannerプライマー設計ソフトウェアBiofire）による。 HRMAのためのPCR産物は、通常、50〜200塩基対であり、SNP検出のためのPCR産物は、典型的には50〜80塩基対、小さくなければならない。
- PCR法
- 96ウェルまたは384ウェルプレート中でPCR反応を行う。
- 各プライマー5pmolの、4μlのLightScannerマスターミックス（0.1 UホットスタートTaqポリメラーゼ-ABポリメラーゼ、緩衝液、0.2mMのdNTPを、2mMの塩化マグネシウム、および1×蛍光二本鎖DNA結合色素）：10μlの全容積を使用大人のテールフィンまたは胚の尾13から3μLゲノムDNAから抽出され、1μlのゲノムDNAテンプレート。
- 30μlのミネラルオイルをカバーサンプル。 光学的に透明な接着シールでプレートをカバーしています。
- PCRサイクリング条件は、典型的な最適条件は、95℃で5分および10秒の30サイクル、95℃であり、60°C、72°Cで30秒、25秒、30秒、95℃で終わるに冷却15℃
- 店舗PCRプレート4℃またはHRMAに直接進んでください。
- PCRの最初の最適化中にアガロースゲル電気泳動を用いてそのサイズを分析することによって我々のPCR産物を確認すると、PCR産物の配列決定により、示されている場合。
3。 HRMA
- 熱板
- 溶融分析システムにプレートを置きます。
- （LightScannerソフトウェアがコールイット2.0）ソフトウェアを起動します。
- 60〜95℃から熱板
- 新しいデータ·ストレージ·ファイルを作成します。
- HRMAのデータを分析します（ 図2）。
分析の複数のステップが可能です。我々は、データmの最も一般的に使用されるセットを示すanipulations。- サブセットの設定
サブセット]タブをクリックします。サンプルでウェルを選択します。 - 正規化
- 左側のパネルでノーマライズ ] タブを選択します。蛍光分散を解消するために、手動で前（初期）平行二重線を配置し、ポスト（最終）溶融領域（ 図2C、矢頭）示されているように、1から0への全てのサンプルのプリメルトとポスト溶融蛍光シグナルを標準化それぞれ14。
- 溶融領域は前後のメルトライン間の領域になるように線の位置を調整するが、選択されていない。一般的に、低最小と下マックス（アッパー最小アッパー最大）温度ラインは約1℃離して配置する必要があります。
- すべてのサンプルは、POSに最もよくとして最大値またはプリメルト領域および最小または後の溶融領域に対するいいえ（0％）蛍光（のための完全な（100％）の蛍光を有するように正規化するための温度位置を選択してくださいてアクセスします）。正規化は、融点と0の最小蛍光での溶融点からしてほぼ水平線まで伸びる1の最大蛍光でほぼ水平線になるはずです。1上または0以下の蛍光レベルがあってはならない。たとえば、 図2（c）に、79〜80℃の温度範囲を使用前溶融曲線を正規化
- グループ化/クラスタリング
それらの融解温度（ 図2C、緑のボックス）に基づいて遺伝子型を区別します。 グループ化を選択します。- グループ化]セクションの下の標準選択リストからAUTOGROUPを選択します。
- グループセクションの下に感度選択リストから、それぞれの単一の遷移や、複数の遷移にプロファイルを溶融させるための標準または高 ]を選択します。
- 計算を選択します。グループ化]セクションの下にグループ化します。
- [ファイル ] メニューに移動し、その結果を保存するために[保存]をクリックします。
- サブセットの設定
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Representative Results
プロトコルは、1日の間に行うか（作業のフロー図を図1に示されている）、数日間にわたって段階で分離することができる。 DNA抽出は、PCRアンプリコンの溶融および分析が続く。アンプリコンの溶融のための温度は、大きさおよびGC含量に依存するが、一般的に開始し、50˚C 95˚Cの終了温度が（ 図2Aおよび2B）が適切である。溶融が実行されると、蛍光溶融曲線の分析は、典型的には、標準（ 図2C）のように前後の溶融領域を用いて、異なるサンプル曲線の変動の正常化を必要とする。これは、蛍光の変化は軽微な実験的変動に関連した異なるサンプルからの結果の比較を改善する。正規化のための温度線の各ペアは、離れて約1˚C（ 図2C、矢頭）に配置する必要があります。融解曲線プロファイルを示す上面図であり、参照試料（ 図2D）と比較して、サブトラクティブ差プロットを示す下側のグラフ：;データ結果のグループ化は、2つの異なる方法で表されている。
HRMA解析は、変異（ 図3Aおよび3B）、または導入遺伝子（ 図3C）を検出するために使用することができる。 図3Aに、eif2b5遺伝子内の2つの異なる変異は、野生型試料の正規化された蛍光データを減算することにより（ 図3Aの赤と青の曲線）が示されている。これは、参考のために選択される遺伝子型は関係ありません。溶融曲線におけるより微妙や混乱を招くの違いは、サブトラクティブ差プロットを使用して識別することができる。 図3Bにおいて、胚の単一のコレクション内の4つの異なる遺伝子型の一例が示されている。
図1。ゼブラフィッシュのゲノムDNAのPCR系HRMAためのプロトコルの概要を全組織（フィンクリップまたは胚）からのDNA抽出は、蛍光二本鎖DNA結合色素の存在下でのPCR増幅が続く。 PCRアンプリコンを変性させ、蛍光シグナルは、アンプリコンを検出するために、および/または遺伝子型を区別するために、溶融曲線分析、続いて記録される。
図2。HRMAを実行し、結果を分析するためのソフトウェアのスクリーンショット。 LightScannerソフトウェアのスクリーンショット、黄色のボックスを「B」に拡大され、B。。 「A」の箱入りの領域の表示を拡大。開始と終了温度を設定すると（矢印）が示されている。C。プリメルトおよび標準化のためのポストメルト平行線（矢印）を置きます。前後の溶融領域（赤枠）の蛍光の分散に注目してください。下のグラフ（緑のボックス）が規格化。D次生データのプロットから得られた溶融曲線を示す。上のグラフが示すには、自動グループ化後の曲線プロファイルを溶かし、異なる遺伝子型が異なる色（赤枠）に示されている。下のグラフ（緑のボックス）は、蛍光差曲線を示しています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3。 HRを使用して。温度（x軸）に対する蛍光（y軸）の変化が示されているA;変異および導入遺伝子を同定するための蛍光差曲線が示されているMA。 HRMAはeif2b5遺伝子に変異を保有する魚を検出するために使用した。野生型は灰色（矢印）に示されている。赤と青の色がPCR産物の配列決定により確認eif2b5つの異なる変異を表す。B。四つの異なるFOXP2の変異体対立遺伝子がHRMAで識別されます。赤：zc82 / +（8 bpの欠失）、緑：zc83 / +（17 bpの欠失）、青：zc82/zc83（8bp deletion/17bpの削除）、グレー：zc83/zc83（17bp欠失ホモ接合体）C。 Gal4のトランスジェニック魚（灰色の曲線）は、野生型（ブラウン曲線、矢印）から区別することができる。導入遺伝子の検出のために、正規化が行われるべきでないことに注意してください。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
HRMAと組み合わせたPCRは、ゼブラフィッシュの遺伝子型解析のための強力な技術です。このアプローチの利点は、その速度、ロバスト性、さらには点突然変異を検出するための感度である。全体のプロトコルは、フィンクリップする溶融曲線解析から、単一の個人によって8時間未満で行うことができる。また、この技術は、ハイスループットスクリーニングのために適している、臭化エチジウムの使用を必要としないと、汚染の問題を最小限に抑えることができ、すべてのPCRおよび分析工程のために封止されている。
このテクニックのための重要なステップは、PCRアンプリコンとプライマーデザインです。 HRMAでのPCR産物の典型的な長さは50〜200 bpである。短いアンプリコンは、感度を高め、単一ヌクレオチド変化を検出するために理想的である。プローブは、密接に関連したPCR産物種の溶融曲線は容易に区別できない場合には、SNPに相補的な3 '末端でブロックされた小さいオリゴヌクレオチドは、PCR反応（Lunaprobesに含めることができるS）。プローブは、その後のHRMA PCRにおけるプローブの拡張を防ぐために前方の異なる濃度を用いて非対称PCRによって生成され、リバースプライマーを、3 '、C3ブロッカーとしている。プローブはその後HRMA PCR反応に含まれる。 HRMA次いで非対称プローブはPCR産物に結合し、対立遺伝子を区別するために使用することができる異なる溶融曲線でプローブ - 標的二重鎖を生成したプローブで起こる。
いくつかの企業は、溶融曲線分析システムを提供しています。これらはBiofire Lightscanner、ロシュLightcyclerVR 480及びキアゲンローター遺伝子Q.いくつかの蛍光DNA結合色素は、LC緑色のプラスとSYT09 EvaGreenを含め、利用可能ながあります。異なる蛍光色素および溶融カーブマシン8,15に基づいて変異検出感度にばらつきがあります。例えば非飽和色素、SYBRグリーンIは、ほとんどのHRMA用途には適していない。高濃度のSYBR Green IでinhibiDNAポリメラーゼの活性tsの、そしてより低い濃度で、サイバーグリーン私は正確に戻って二本鎖DNA 16の地域による溶融地域からの再配布に融解挙動を測定することはできません。一般的に、ほとんどの既存のリアルタイムPCRプラットフォームは、ソフトウェアパッケージアドオンと第二世代の蛍光DNA結合色素を使用してHRMAを予備成形することができる。実験工程のソフトウェアシーケンスの技術的な詳細は、プラットフォーム間で若干異なりますが、全体的な科学的概念は、本質的に同一である。
我々の研究室などがHRMAが導入遺伝子、及びZFNを6,12,13およびTALENSによって誘発される突然変異を検出するために胚および成体ゼブラフィッシュの両方で使用することができることを実証した。 HRMAは、ゼブラフィッシュ6,12における多型を検出するために使用されています。私たちの研究室ではTALEN誘発される変異の最初のスクリーニングのためだけでなく、確立された行（TSQとJLB、未発表）のソートの両方HRMAを使用しています。他の潜在的なアプリケーションシートそしてvivariums 18における病原体の検出、ゼブラフィッシュにも適用することができたイオンは、メチル化感受性HRMA（MS-HRMA）17、コピー数の定量が5に変異体が含まれる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、助言や技術支援のためのBlaschke、メイ、そしてウィトワーラボのメンバーに感謝。この作品は、JLBに、PCMC財団、NIH R01 MH092256とDP2 MH100008、そしてダイム財団研究助成金＃1-FY13-425の3月までサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96-well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| High-resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldehyde |
References
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