Summary
PCR kombinert med høy oppløsning smelte analyse (HRMA) er vist som en rask og effektiv metode for å genotype sebrafisk.
Abstract
Sebrafisk er en kraftig virveldyr modellsystem for å studere utviklingen, modellering sykdom, og utfører medikamentscreening. Nylig ble en rekke genetiske verktøy er innført, inkludert flere strategier for å indusere mutasjoner og generering av transgene linjer. Imidlertid er store screening begrenset av tradisjonelle genotyping metoder, som er tidkrevende og arbeidskrevende. Her beskriver vi en teknikk for å analysere sebrafisk genotyper av PCR kombinert med høy oppløsning smelteanalyse (HRMA). Denne tilnærmingen er rask, følsom, og billig, med lavere risiko for forurensning gjenstander. Genotyping ved PCR med HRMA kan brukes for embryoer eller voksen fisk, blant annet i high-throughput screening protokoller.
Introduction
Sebrafisk (Danio rerio) er et virveldyr modellsystem mye brukt for studier av utvikling og sykdom modellering. Nylig har mange transgene og mutasjons teknologier er utviklet for sebrafisk. Rapid transgenesis teknikker, som regel basert på en Tol2 transposon system 1, har blitt kombinert med forbedrede kloning alternativer for flere DNA fragment montering to. Sink-finger nukleaser (ZFNs) og transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talens) har blitt brukt til å målrette loci i både somatiske og germline celler i sebrafisk 3,4. Disse teknikkene kan effektivt generere genmodifiserte dyr, med høyfrekvente mutasjon etablering og bakterie-nettoverføring 3,4.
Til tross for disse fremskrittene, tradisjonelle genotyping teknikker i sebrafisk begrense full effekt av de mutagenese og transgenesis verktøy. PCR etterfulgt av gelelektroforese, noen ganger kombinert med restriction-enzymbehandling, er mye brukt for å detektere genom modifikasjon, men er tidkrevende og mindre følsom for å identifisere små innskudd eller delesjoner. TaqMan probe-analyser har høye initielle kostnader og krever forsiktig optimalisering. Sekvensering av PCR-produkter kan ta flere dager, og er ikke praktisk for storskala screening. Restriction fragment lengde polymorfisme (RFLP) analyse kan bare diskriminere SNPs som påvirker et begrenset utvalg av restriksjonsenzym anerkjennelse sider.
Høyoppløselig smelteanalyse (HRMA), et lukket rør post-PCR-analyse-metoden, er en nylig utviklet metode som er rask, sensitiv, billig og mottagelig for screening av store antall prøver. HRMA kan brukes til å oppdage SNPs, mutasjoner og transgener 5-7. HRMA er basert på termisk denaturering av dobbelt-strengede DNA-molekyler, og hvert PCR-fragment har en unik dissosiasjon (smelter) karakteristisk 5. Prøver kan bli diskriminert på grunn av to sin annen nukleotid-sammensetning, GC-innhold, eller lengde, typisk i kombinasjon med et fluorescerende fargestoff som bare binder dobbelttrådet DNA 8.. Således kan HRMA skille mellom forskjellige genotyper basert på de forskjellige smelte-kurvekarakteristikk. Fordi HRMA benytter rimelige reagenser og det er en enkelt-trinn-post-PCR-prosessen, kan den brukes for high-throughput strategier. HRMA er destruktiv, så følgende analyse PCR amplicons kan brukes til andre applikasjoner. HRMA har vært anvendt i mange organismer og systemer, inkludert cellelinjer, mus og mennesker 9-11. Bruken har nylig blitt beskrevet i sebrafisk til å oppdage mutasjoner indusert av sink finger nukleaser (ZFNs) og Talens 6,12,13.
I denne artikkelen beskriver vi hvordan du utfører PCR-basert HRMA i embryonale og voksne sebrafisk (Figur 1). Denne protokollen er egnet til å påvise SNPs, transgener, og mutasjoner, inkludert single basepar endringer, innsettinger, eller slettinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. DNA Forberedelse
- Forbered DNA lyseringsbuffer: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Legg frisk proteinase K til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml på dag i bruk 12..
- Tissue samling:
- For voksen fisk fin klipp:
- Anesthetize fisk: Legg fisken i 0,004% MS-222 (Tricaine) løsning. Vent til gill bevegelse bremser.
- Sett fisk på en stabel med 5-10 Kimwipes og skjære et lite stykke av halefinnen, omtrent 2 til 3 mm, med en steril barberblad.
- Raskt plassere fisken i en tank som er merket med friskt vann for utvinning; nøye merke både tanken og tilsvarende rør som skal inneholde fin klippet. Bytt vann og mate fisken annenhver dag.
- Plukk opp den finneklippet med en steril pipette tips og overføre den til et rør fylt med 100 mL DNA lysis buffer.
- Kast pipettespissen, og kast barberblad i en beholder for skarpe gjenstander.
- For embryo hale klipp:
- Plasser embryoer inn 0.004% MS-222 (Tricaine) løsning. Vent 2 min.
- Klipp et stykke av halen med tang i henhold til en disseksjonsmikroskop.
- Sett halen i et merket rør fylt med 30 pl DNA lysis buffer.
- Raskt sette embryoet inn i et rør som inneholder 100 mL 4% paraformaldehyde.
- Etikett rør med embryoer og tilhørende hale rør.
- Oppbevar rør med embryoer ved 4 ° C over natten for fiksering.
- Rengjør tang hjelp Milli-Q vann og Kimwipes mellom hvert embryo for å redusere forurensning.
- For hele embryoer:
- Plasser embryoer inn 0.004% MS-222 (Tricaine) løsning. Vent 2 min.
- Sett 1-5 embryoer i et rør fylt med 100 pl DNA lysis buffer. Dechorionation er ikke nødvendig.
- For voksen fisk fin klipp:
- DNA fordøyelsen
Inkuber rørene med vev (finne eller hale klipp eller embryoer) ved 55 ° Ci 4 timer til over natten 12.. - Inaktivere proteinase K
Varme rør til 95 ° C i 15 min 12. DNA som skal brukes for PCR umiddelbart eller lagret ved -20 ° C i opp til 3 måneder.
2. PCR
- Design Grunning enten manuelt eller ved primer design software (f.eks Lightscanner Primer Design Software-Biofire). PCR-produkter for HRMA er vanligvis 50-200 bp; PCR-produkter for SNP deteksjon bør være mindre, typisk 50-80 bp.
- PCR
- Utføre PCR-reaksjon i en 96-brønn eller 384-brønners plate.
- Bruk 10 pl totalt volum: 4 mL LightScanner konsentrat-blanding (0,1 U hot-start Taq-polymerase AB, buffer, 0,2 mM dNTPs, 2 mM magnesiumklorid, og 1x fluorescerende dobbelttrådet DNA-bindende fargestoff), 5 pmol hver primer, og 1 mL genomisk DNA mal hentet fra voksen halefinnen eller 3 mL genomisk DNA fra embryonale hale 13.
- Cover prøver med 30 mL mineralolje. Dekk-plate med et optisk transparent klebe tetning.
- Optimal PCR sykkelforhold-typiske betingelser er 95 ° C i 5 minutter og 30 sykluser på 10 sek ved 95 ° C, 25 sek ved 60 ° C, 30 sek ved 72 ° C, som avsluttes med 95 ° C i 30 sek, og avkjølt til 15 ° C.
- Oppbevar PCR-plater ved 4 ° C eller fortsette direkte til HRMA.
- Bekrefte vår PCR-produktet ved analyse av sin størrelse ved hjelp av agarose-gel-elektroforese under innledende optimalisering av PCR, og hvis angitt, ved sekvensering av PCR-produktet.
Tre. HRMA
- Varmeplater
- Plasser plate i en smelte analysesystem.
- Åpne programvaren (LightScanner Programvare Call-IT 2.0).
- Varmeplater 60-95 ° C.
- Lag en ny datalagringsfilen.
- Analyser HRMA data (figur 2).
Flere trinn i analysen er mulige. Vi viser den mest brukte sett av data manipulations.- Delsett innstilling
Klikk kategorien Delsett. Velg brønnene med prøvene. - Normalisering
- Velg fanen Normal i venstre panel. For å eliminere fluorescens varians, manuelt plassere parallell dobbel-linje i pre-(første) og etter (endelig)-smelte regioner som illustrert (figur 2C, pilspisser) og normal premelt og post-smelte fluorescens signaler av alle prøvene til en og 0 , henholdsvis 14..
- Juster posisjonering av linjene, slik at smelten region er i området mellom de pre-og post-smelte linjer, men ikke valgt. Generelt, Nedre Min og Nedre Max (og Upper Min og Øvre Max) temperaturlinjer bør plasseres ca 1 ° C fra hverandre.
- Velg temperatur posisjoner for normalisering slik at alle prøvene har maksimal eller full (100%) fluorescens for premelt regionen og minimum eller ingen (0%) fluorescens for den post-smelte region (som best poslig). Normalisering bør resultere i en nesten horisontal linje ved maksimal fluorescens av 1 som strekker seg frem til smeltepunktet og deretter en tilnærmet horisontal linje fra smeltepunktet på det minimum fluorescens fra 0, og det bør ikke være fluorescens-nivåer over 1 eller under 0 . For eksempel, i figur 2C, normalisere premelting kurvene ved hjelp av temperaturområdene 79 til 80 ° C.
- Gruppering / Clustering
Skille genotyper basert på deres smeltetemperatur (figur 2C, grønn boks). Velg gruppering.- Velg Autogroup fra Standards valglisten under Gruppering delen.
- Velg Normal eller Høy for smelting profiler med enkle overganger eller flere overganger henholdsvis fra Sensitivity valglisten under Gruppering delen.
- Velg ComputeGrupper under Gruppering delen.
- Gå til Fil-menyen og klikk på Lagre for å lagre resultatene.
- Delsett innstilling
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen kan utføres i løpet av en dag eller separert i trinn i løpet av flere dager (flytdiagram av arbeids er vist i figur 1). DNA-ekstraksjon etterfulgt av smelten og analyse av PCR-amplikoner. Temperaturen på smelten av amplikonet avhenge av størrelsen og GC-innhold, men generelt er start-og slutttemperaturer på 50 ˚ C og 95 ˚ C er passende (figurene 2A og 2B). Når smelten er utført, analyse av fluorescensen smeltekurver krever vanligvis normalisering av variasjonen av de forskjellige eksempelkurver, ved hjelp av pre-og post-smelte regioner som standarder (figur 2C). Dette forbedrer sammenligning av resultater fra forskjellige prøver hvor variasjonen av fluorescens er knyttet til små eksperimentelle variasjoner. Hvert par av temperaturlinjer for normalisering bør plasseres omtrent 1 ˚ C fra hverandre (figur 2C, pilspisser).; Gruppering av data resultater er representert på to forskjellige måter: en øvre graf som viser smelte kurve profiler, og en lavere graf som viser en subtraktiv forskjell tomt i forhold til en referanseprøve (figur 2D).
HRMA analysen kan brukes til å detektere mutasjoner (figurene 3A og 3B), eller transgener (figur 3C). I figur 3A, er to forskjellige mutasjoner i eif2b5 genet vist (rød og blå kurvene i figur 3A) ved å trekke fra den normaliserte fluorescens data av villtype-prøven. Det spiller ingen rolle hvilken genotype er valgt som referanse. Mer subtile eller forvirrende forskjeller i smeltevann kurver kan skilles ved hjelp av subtraktiv forskjellen tomten. I figur 3B, er et eksempel på fire forskjellige genotyper i en enkelt samling av embryoer er vist.
Figur 1. Outline of protokoll for PCR-basert HRMA av sebrafisk genomisk DNA. DNA-ekstraksjon fra hele vev (fin-klips eller embryo) er etterfulgt av PCR-amplifikasjon i nærvær av en fluoriserende dobbeltkjedet DNA-bindende fargestoff. PCR-fragment er denaturert og fluorescens-signal blir registrert, etterfulgt av smeltekurve analyse, for å detektere fragment og / eller for å differensiere genotyper.
Figur 2. Screen-shots av programvare for å utføre HRMA og analysere resultatene. A. B gule boksen er forstørret i "B"; skjermbilde av LightScanner programvare.. Forstørret bilde av eske regionen i "A". Innstilling Start og End Temp vises (piler). C. Plasser premelt og post-smelte parallelle linjer for normalisering (pilspisser). Legg merke til fluorescens variansen i pre-og post-smelting regioner (rød boks). Nedre graf (grønn boks) viser smeltevann kurver utledet fra rådata tomter etter normalisering. D. Øvre grafen viser smelte kurveprofiler etter automatisk gruppering; ulike genotyper er illustrert i farger (rød boks). Nedre graf (grønn boks) viser fluorescens forskjellen kurve. Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Ved hjelp av HR. MA for å identifisere mutasjoner og transgener Fluorescens differanse kurver er vist; endring i fluorescens (y-akse) mot temperatur (x-aksen) er vist en.. HRMA ble anvendt for å detektere fisk som bærer mutasjoner i eif2b5 genet. Villtype er vist i grått (pil). Røde og blå farger representerer to forskjellige eif2b5 mutasjoner, bekreftet av sekvensering av PCR-produktet. B. Fire forskjellige FOXP2 mutant alleler er identifisert med HRMA. Red: zc82 / + (8 bp sletting), grønn: zc83 / + (17 bp sletting), blå: zc82/zc83 (8BP deletion/17bp sletting), grå:. Zc83/zc83 (17bp sletting homozygoter) C. Gal4 transgen fisk (grå kurver) kan skilles fra villtype (brun kurve, pil). Legg merke til at for transgenet deteksjon, normalisering bør ikke utføres. Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PCR kombinert med HRMA er en kraftig teknologi for sebrafisk genotyping. Fordelene med denne fremgangsmåten er dens hastighet, robusthet, og følsomhet for å detektere og med punktmutasjoner. Hele protokoll, fra fin-klippet til smelte-kurve analyse kan utføres på mindre enn åtte timer av et enkelt individ. Dessuten er teknikken mottagelig for high-throughput screening, krever ikke bruk av etidiumbromid, og er forseglet til alle PCR-og analysefremgangsmåten, som bidrar til å redusere forurensningsproblemer.
Et kritisk punkt for denne teknikken er PCR fragment og primer design. Typisk lengde for PCR-produkter i HRMA er 50-200 bp. Korte amplicons øke følsomheten og er ideelle for å detektere enkelt nukleotidforandringer. Dersom smelte-kurver av nær beslektede PCR-produktarter ikke kan skilles lett, kan en liten oligonukleotid komplementær til den SNP and blokkert ved 3'-enden være inkludert i PCR-reaksjonen (Lunaprobes; probes). Sondene er generert ved asymmetrisk PCR ved anvendelse av forskjellig konsentrasjon av forover og revers primere med en 3 'C3 stopperen for å hindre at sonden forlengelse i den etterfølgende HRMA PCR. Proben blir deretter inkludert i HRMA PCR-reaksjon. HRMA skjer deretter med sonden, hvor den asymmetriske proben bindes til PCR-produktet, og genererer probe-mål-duplekser med forskjellige smelte-kurver som kan brukes for å skille alleler.
Flere selskaper tilbyr smelte-kurve analysesystemer. Disse inkluderer Biofire Lightscanner, Roche LightcyclerVR 480 og Qiagen Rotor-Gene Q. Flere fluorescerende, DNA-bindende fargestoffer er tilgjengelig, inkludert LC Green Plus og SYT09 EvaGreen. Det er noe variasjon i følsomheten i mutasjonsdeteksjon basert på ulike fluorescerende fargestoffer og smelte-kurve maskiner 8,15. Metningsfargestoffer, for eksempel, SYBR Grønn jeg, er uegnet for de fleste HRMA programmer: ved høye konsentrasjoner, SYBR Grønn Jeg hemmendets aktiviteten av DNA-polymerase, og ved lavere konsentrasjoner, SYBR grønn I kan ikke nøyaktig måle smelte oppførsel på grunn av den omfordeling fra smeltede områder tilbake til regioner av dsDNA 16.. Generelt fleste eksisterende Real Time PCR-plattformer er i stand til preforming HRMA ved hjelp av en programvarepakke add-on og en andre generasjons fluorescerende DNA bindende fargestoff. Mens tekniske detaljer om programvare og rekkefølgen av eksperimentelle skritt variere litt mellom plattformer, den samlede vitenskapelige begreper er i hovedsak identiske.
Vår lab og andre har vist at HRMA kan brukes i både embryonale og voksne sebrafisk til å oppdage transgener, og mutasjoner indusert av ZFNs og Talens 6,12,13. HRMA har blitt brukt til å oppdage polymorfismer i sebrafisk 6,12. Laboratoriet bruker HRMA både for innledende screening av TALEN-induserte mutasjoner samt for sortering av etablerte linjer (TSQ og JLB, upublisert). Andre potensielle applicationer som kan brukes til sebrafisk omfatter metylering følsomme HRMA (ms-HRMA) 17, kvantifisering av kopi-antall varianter fem, og deteksjon av patogen i vivariums 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer av Blaschke, Grunwald, og Wittwer laboratorier for råd og teknisk assistanse. Dette arbeidet støttes av PCMC Foundation, NIH R01 MH092256 og DP2 MH100008, og March of Dimes Foundation forskningsstipend # 1-FY13-425, til JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96-well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| High-resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldehyde |
References
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
- Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
- Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
- Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
- Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
- Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
- Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
- Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
- Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
- Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).
