Summary
ПЦР в сочетании с анализом расплава с высоким разрешением (HRMA) демонстрируется в качестве быстрого и эффективного метода для генотипа данио.
Abstract
Данио рерио является мощным позвоночных модельной системой для изучения развития, моделирования заболевания, а также выполнение скрининга препарата. Недавно целый ряд генетических инструментов были введены, в том числе несколько стратегий вызывая мутации и получения трансгенных линий. Однако масштабное обследование ограничивается традиционными методами генотипирования, которые много времени и трудоемким. Здесь мы опишем технику для анализа данио генотипов от ПЦР в сочетании с анализом высокого разрешения плавления (HRMA). Этот подход является быстрым, чувствительным и недорогой, с более низким риском артефактов загрязнения. Генотипирование с помощью ПЦР с HRMA могут быть использованы для эмбрионов или взрослых рыб, в том числе в скрининговых протоколах высокой пропускной.
Introduction
Данио рерио (Danio рерио) является позвоночным модель системы широко используются для изучения разработки и моделирования заболевания. В последнее время многие трансгенные и мутации технологии были разработаны для данио. Быстрые методы трансгенеза, как правило, на основе системы транспозонов Tol2 1, были объединены с улучшенными опциями клонирования для многократного монтажа фрагментов ДНК 2. Цинк-пальцевые нуклеазы (ZFNs) и активатор транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Таленс) были использованы для локусы в обоих соматических и половых клетках в данио 3,4. Эти методы могут эффективно генерировать генетически модифицированных животных, с созданием мутаций высокочастотной и передачи зародышевой линии 3,4.
Несмотря на эти успехи, традиционные методы генотипирования на рыбках данио ограничить всю мощь мутагенеза и трансгенеза инструментов. ПЦР с последующей гель-электрофореза, иногда в сочетании с ОГРАНИЧЕНИЯн фермент пищеварение, широко используется для обнаружения изменения генома, но требует много времени и менее чувствительны, чтобы определить небольшие вставки или делеции. TaqMan зондов анализы имеют высокие первоначальные затраты и требуют тщательной оптимизации. Секвенирование продуктов ПЦР может занять несколько дней и не практично для крупномасштабной проверки. Анализ длина Ограничение фрагмент полиморфизм (ПДРФ) может только различать ОНП, влияющие ограниченный диапазон сайтов рестрикции фермента распознавания.
Анализ высокого разрешения плавления (HRMA), метод анализа пост-ПЦР закрытого трубка, является недавно разработанный метод, который является быстрым, чувствительным, недорогой и поддаются скрининга большого количества образцов. HRMA может быть использован для обнаружения полиморфизмов, мутации и трансгены 5-7. HRMA основана на тепловой денатурации двухцепочечных ДНК, и каждый ПЦР ампликона имеет уникальный диссоциации (расплава) характерный 5. Образцы могут подвергаться дискриминации из-за то их различный состав нуклеотидов, содержание GC, или длина, как правило, в сочетании с флуоресцентным красителем, который связывается только двухцепочечной ДНК 8. Таким образом, HRMA можно выделить различные генотипы на основе различных характеристик расплава кривой. Поскольку HRMA использует недорогие реагенты и состоит из одного этапа после ПЦР, она может быть использована для стратегий высокой пропускной. HRMA является неразрушающим, так что следующее анализа ампликонов ПЦР могут быть использованы для других приложений. HRMA была применена во многих организмов и систем, в том числе клеточных линий, мышей и человека 9-11. Его использование в последнее время были описаны у рыбок данио для обнаружения мутаций, вызванных цинкового пальца нуклеаз (ZFNs) и Talens 6,12,13.
В этой статье мы расскажем, как выполнять на основе ПЦР HRMA в эмбриональном и взрослых данио (рис. 1). Этот протокол подходит для обнаружения ОНП, трансгены, и мутации, в том числе сиngle изменения базового пара, вставки или удаления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка ДНК
- Подготовка ДНК лизирующего буфера: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl рН 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Добавить свежий протеиназу К до конечной концентрации 1 мг / мл в день использования 12.
- Коллекция тканей:
- Для взрослого клипа рыбы плавников:
- Обезболить рыбу: Поместите рыбу в 0,004% MS-222 (Tricaine) раствора. Подождите, пока движение жаберных не замедляется.
- Положите рыбу на стопку 5-10 Kimwipes и вырезать небольшой кусок хвостового плавника, около 2-3 мм, с стерильной бритвой.
- Быстро поставить рыбу в меченым бак с пресной водой для восстановления; тщательно маркировать как танк и соответствующий трубку, которая будет содержать плавник клип. Меняйте воду и кормить рыбу каждый день.
- Поднимите плавник клип с стерильной кончика пипетки и передать его в трубке, заполненной 100 мкл буфера для лизиса ДНК.
- Откажитесь от пипетки, и выбросьте лезвие в контейнер для острых предметов.
- Для эмбрион хвост клип:
- Наведите эмбрионов в 0,004% MS-222 (Tricaine) раствора. Подождите 2 мин.
- Отрежьте кусок хвоста щипцами под микроскопом рассекает.
- Поместите хвост в меченого трубки, заполненной 30 мкл ДНК-буфера для лизиса.
- Быстро поставить эмбрион в пробирку, содержащую 100 мкл 4% параформальдегида.
- Этикетка трубки с эмбрионами и соответствующих им хвостовых труб.
- Хранить пробирки с эмбрионами при 4 ° С в течение ночи для фиксации.
- Очистите щипцов с помощью Milli-Q воды и Kimwipes между каждого эмбриона для минимизации загрязнения.
- Для целых эмбрионов:
- Наведите эмбрионов в 0,004% MS-222 (Tricaine) раствора. Подождите 2 мин.
- Положите 1-5 эмбрионов в трубке, заполненной 100 мкл буфера для лизиса ДНК. Dechorionation не надо.
- Для взрослого клипа рыбы плавников:
- Пищеварение ДНК
Инкубируйте пробирки с ткани (FIN или хвоста клипов или эмбрионов) при 55 ° Св течение 4 часов до ночного 12. - Инактивировать протеиназы К
Тепловые трубы до 95 ° С в течение 15 мин 12. ДНК следует использовать для ПЦР немедленно или хранить при -20 ° С в течение 3 месяцев.
2. ПЦР
- Дизайн Грунтовки вручную или грунтовки разработки программного обеспечения (например, Lightscanner Грунтовка Design Software-Biofire). ПЦР-продукты для HRMA, как правило, 50-200 б.п.; продукты ПЦР для выявления SNP должна быть меньше, обычно 50-80 б.п..
- ПЦР
- Выполните ПЦР в 96-луночный или 384-луночный планшет.
- Используйте 10 мкл общий объем: 4 мкл LightScanner Master Mix (0,1 ед горячего старта Taq-AB-полимераза, буфер, 0,2 мм дНТФ, 2 мМ хлорида магния и 1x люминесцентные двухцепочечной ДНК-связывающий краситель); 5 пмоль каждого праймера, и 1 мкл шаблон геномной ДНК, выделенную из взрослых хвостового плавника или 3 мкл геномной ДНК из эмбрионального хвоста 13.
- Образцы крышки с 30 мкл минерального масла. Закройте планшет с оптически-прозрачного слоя герметика.
- Оптимизация ПЦР велосипедные условия-типичные условия 95 ° С в течение 5 мин и 30 циклов по 10 сек при 95 ° С, 25 сек при 60 ° С, 30 сек при 72 ° С, заканчивая 95 ° С в течение 30 сек и охлаждали до 15 ° С.
- Храните ПЦР планшеты при 4 ° С или продолжить непосредственно на HRMA.
- Подтверждение наш продукт ПЦР при анализе его размера с помощью электрофореза в агарозном геле при начальной оптимизации ПЦР, и если указано, секвенированием ПЦР-продукта.
3. HRMA
- Тепловые плиты
- Поместите пластину в системе анализа расплава.
- Откройте программное обеспечение (LightScanner Программное обеспечение Call-IT 2.0).
- Тепловые плиты из 60-95 ° С.
- Создайте новый файл для хранения данных.
- Анализ данных HRMA (рис. 2).
Несколько шагов анализа возможны. Мы покажем, наиболее часто встречающихся набор данных мanipulations.- Установка подмножества
Перейдите на вкладку подмножество. Выберите скважин с большим количеством примеров. - Нормализация
- Выберите вкладку Нормализовать на левой панели. Для устранения флуоресценции дисперсию, вручную установите параллельный двойной линии в предварительной (начальной) и регионы сообщение (конечная)-расплава, как показано (рис. 2C, наконечники стрел) и нормализовать premelt и флуоресценции после расплава сигналы всех образцов 1 и 0 соответственно 14.
- Отрегулируйте расположение линий, так что расплав регион находится в области между пре-и пост-расплава линий, но не выбран. В общем, Нижняя Мин и Нижняя Макс (и Верхняя Мин и Верхняя Макс) Температура линии должны быть размещены около 1 ° C на части.
- Выберите температуры позиции по нормализации, что все образцы имеют максимальную или полную (100%) флуоресценции для premelt региона и минимальной или нет (0%) флуоресценции для пост-расплава регионе (в лучшем случае как позSible). Нормализация должно привести к почти горизонтальной линии при максимальной флуоресценции 1, что не простирается до температуры плавления, а затем почти горизонтальной линии от точки плавления при минимальной флуоресценции 0; не должно быть уровни флуоресценции выше 1 или ниже 0 . Например, на фиг.2С, нормализовать кривые предплавления использованием диапазоны температур 79-80 ° С.
- Группировка / кластеризация
Различают генотипов в зависимости от их температуры плавления (рис. 2С, зеленый ящик). Выберите группировка.- Выберите Autogroup из списка стандартов отбора в разделе Группировка.
- Выберите Обычный или Высокий для плавки профили с одиночными переходов или нескольких переходов соответственно из списка выбора чувствительности в разделе Группировка.
- Выберите ВычислитьГруппы по данному разделу группировки.
- Перейдите в меню Файл и нажмите кнопку Сохранить, чтобы сохранить результаты.
- Установка подмножества
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол может быть выполнена в течение одного дня или разделены с шагом в течение нескольких дней (блок-схема работы показан на рисунке 1). Выделение ДНК следуют расплава и анализа ПЦР ампликонов. Температуры для расплава ампликона зависеть от размера и GC-содержания, но обычно начальную и конечную температуры 50 ˚ С и 95 ˚ C являются подходящими (фиг.2А и 2В). После того, как расплав выполняется анализ кривых флуоресценции расплава обычно требует нормализации вариации различных кривых образцов, используя пред-и пост-расплава областей в качестве стандартов (рис. 2в). Это улучшает сравнение результатов различных образцов, в которых изменение флуоресценции, связанных с незначительными экспериментальных отклонений. Каждая пара температурных линий для нормализации должны быть размещены около 1 ˚ C друг от друга (рис. 2C, наконечники стрел).; Группировка результатов данных представлена двумя различными способами: верхний график, который показывает расплава профили кривой, и нижний график, который показывает субтрактивной разница участок в сравнении с эталонным образцом (рис. 2D).
Анализ HRMA может быть использован для обнаружения мутаций (фиг.3А и 3В) или трансгенов (Фигура 3С). На фиг.3А, два различных мутаций в гене eif2b5 показаны (красный и синий кривые на фиг.3А) путем вычитания нормированные данные флуоресценции образца дикого типа. Это не имеет значения, какой генотип выбирается для справки. Более тонкие или противоречивые различия в талых кривых можно выделить с помощью вычитания разница участок. На фиг.3В показан пример четырех различных генотипов в одном сбора эмбрионов показан.
Рисунок 1. Схема протокола для ПЦР на основе HRMA из данио геномной ДНК. Экстракции ДНК из цельной ткани (трубчато-клипа или эмбрион) следует ПЦР-амплификации в присутствии флуоресцентного двухцепочечной ДНК-связывающего красителя. ПЦР ампликона денатурируют и сигнал флуоресценции регистрируется, с последующим анализом расплава кривой, для обнаружения ампликона и / или дифференцировать генотипов.
Рисунок 2. Скриншоты программного обеспечения для выполнения HRMA и анализировать результаты. A. В желтый ящик увеличивается в "B"; Снимок экрана программного обеспечения LightScanner.. Увеличенный вид коробочной региона в «А». Установка начала и завершения Темп показаны (стрелки). C. Расположите premelt и пост-расплава параллельные линии для нормализации (наконечники стрел). Обратите внимание на флуоресценции дисперсию в пред-и пост-плавильных регионах (Red Box). Нижняя диаграмма (зеленая коробка) показывает расплава-кривые, полученные из сырья участков данных после нормализации. D. Верхние шоу график расплава профили кривой после автоматической группировки; различные генотипы проиллюстрированы в разные цвета (красный ящик). Нижняя диаграмма (зеленая коробка) показывает разницу флуоресценции кривую. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Использование HR. М.А. определить мутации и трансгены разница кривые флуоресценции показаны; изменение флуоресценции (ось у) до температуры (ось х) показан.. HRMA был использован для обнаружения рыбы, несущих мутации в гене eif2b5. Дикого типа показана на сером (стрелки). Красные и синие цвета представляют собой две различные мутации eif2b5, подтвержденные секвенирования продукта ПЦР. B. Четыре различных FOXP2 мутантные аллели отождествляются с HRMA. Красный: zc82 / + (8 б.п. удаление), зеленый: zc83 / + (17 б.п. удаление), синий: zc82/zc83 (8BP deletion/17bp удаление), серый:. Zc83/zc83 (17BP удаления гомозиготы) C. Gal4 трансгенных рыб (серые кривые) можно отличить от дикого типа (коричневый кривая, стрелка). Обратите внимание, что для обнаружения трансгенной, нормализация не должна быть выполнена. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ПЦР в сочетании с HRMA это мощная технология для рыбок данио генотипирования. Преимущества этого подхода заключаются в его скорость работы, надежность и чувствительность для обнаружения даже точечные мутации. Весь протокол, с трубчато-клипа анализа расплава кривой, может быть выполнена менее чем за восемь часов на одного человека. Кроме того, метод поддается для высокопроизводительного скрининга; не требуют использования бромистым этидием, и уплотнен для всех этапов ПЦР и анализа, который помогает минимизировать проблемы загрязнения.
Важным шагом для этого метода является ПЦР ампликон и грунтовка дизайн. Типичный длина ПЦР-продуктов в HRMA 50-200 б.п.. Короткие ампликоны увеличить чувствительность и идеально подходят для детектирования единичных нуклеотидных замен. Если расплава кривые близкородственных видов ПЦР-продукт не может быть легко отличить, небольшой олигонуклеотид, комплементарный к SNP и блокировали в 3'-конце может быть включен в ПЦР-реакции (Lunaprobes; зондас). Зонды генерируются асимметричной ПЦР с использованием различных концентрации прямого и обратного праймеров, с 3 'C3 блокатор, чтобы предотвратить расширение зонда в последующем HRMA ПЦР. Зонд затем включены в реакции ПЦР HRMA. Затем HRMA происходит с зондом, в котором асимметричный зонд связывается с ПЦР-продукта и генерирует зонд-мишень дуплексы с различными расплава-кривых, которые можно использовать для различения аллелей.
Несколько компаний предлагают системы анализа расплава кривой. К ним относятся Biofire Lightscanner, Рош LightcyclerVR 480 и Qiagen Rotor-Gene Q. Несколько люминесцентные, ДНК-связывающие красители доступны, в том числе ЖК Green PLUS и SYT09 EvaGreen. Существует несколько вариантов чувствительности в обнаружении мутации на основе различных красителей люминесцентных и расплава кривой машин 8,15. Nonsaturating красители, например, SYBR Green I, непригодны для большинства применений HRMA: при высоких концентрациях, SYBR Green I ингибиторовTS деятельности ДНК-полимеразы, а при более низких концентрациях, SYBR Green я не могу точно измерить характеристики плавления вследствие его перераспределения из расплавленных участков обратно в регионах двухцепочечной ДНК 16. В целом большинство существующих платформ ПЦР в реальном времени способны брикетирования HRMA с использованием программного пакета дополнения и второго поколения люминесцентные связывания ДНК красителя. Хотя технические детали программного обеспечения и последовательности экспериментальных шагов незначительно отличаться между платформами, общие научные понятия практически идентичны.
В нашей лаборатории и другие показали, что HRMA может быть использован как в эмбриональных и взрослых данио для обнаружения трансгенов, и мутации, индуцированный ZFNs и Talens 6,12,13. HRMA был использован, чтобы обнаружить полиморфизмы в данио 6,12. Наша лаборатория использует HRMA как для первоначального скрининга Talen-индуцированных мутаций, а также для сортировки установленных линий (TSQ и JLB, не опубликовано). Другие потенциальные заявки Листовионы, которые могут быть применены к данио включают метилирования чувствительных HRMA (MS-HRMA) 17 количественное копирования числа вариантов 5 и обнаружение возбудителя в вивариев 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим членов Бляшке, Grunwald, и Wittwer лаборатории для консультаций и технической помощи. Эта работа проводится при поддержке PCMC Foundation, NIH R01 MH092256 и DP2 MH100008, и марте Dimes Foundation исследовательский грант № 1-FY13-425, к JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96-well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| High-resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldehyde |
References
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
- Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
- Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
- Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
- Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
- Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
- Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
- Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
- Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
- Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).
