Summary
हम एक विशिष्ट पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी कोशिकी epitopes के लिए उपयोग कर न्यूरॉन्स रहने की सतह पर प्रोटीन लेबल करने के लिए एक विधि का वर्णन. कोशिका की सतह पर एंटीबॉडी से बंधे और बाद में endocytosis के माध्यम से भली भाँति प्रोटीन प्रोटीन पर शेष से प्रतिष्ठित, या ऊष्मायन के दौरान सतह के लिए अवैध व्यापार किया जा सकता है.
Abstract
सभ्य न्यूरॉन्स में एक ख्यात transmembrane रिसेप्टर की सेल सतह स्थानीयकरण का प्रदर्शन करने के लिए, हम प्रोटीन की एक बाह्य भाग खिलाफ उठाए गए एक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लाइव न्यूरॉन्स की सतह पर प्रोटीन लेबल. कोशिकाओं निर्धारण के बाद फिर सेल सतह और आंतरिक प्रोटीन दोनों एक ही लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाएगा permeabilized रहे हैं रिसेप्टर्स, सतह के लिए और से तस्करी कर रहे हैं कि यह देखते हुए. यहाँ, हम या तो कोशिका की सतह पर बने रहे या इस अवधि के दौरान सतह के लिए तस्करी कर रहा था कि एंटीबॉडी ऊष्मायन कदम और प्रोटीन के दौरान endocytosis से भली भाँति किया गया था कि लेबल प्रोटीन विभिन्न करने के लिए प्रोटीन की तस्करी ("एंटीबॉडी खिला") का अध्ययन करने की विधि अनुकूलित . प्रोटीन की इन दो पूल भेद करने की क्षमता एक प्रारंभिक incubatio के बाद अत्यधिक केंद्रित unlabeled माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक रात अवरुद्ध कदम के समावेश के माध्यम से संभव बनाया गया थाएक fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ unpermeabilized न्यूरॉन्स के एन. एक अलग fluorophore साथ लेबल एक फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ भली भाँति पूल का पता लगाने की अनुमति दी न्यूरॉन्स के अवरुद्ध कदम, permeabilization के बाद. हम यह था कि खुलासा, इस ख्यात रिसेप्टर के subcellular स्थान के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्राप्त करने में सक्षम थे इस तकनीक का उपयोग, वास्तव में, न्यूरॉन्स में सेल सतह को तस्करी. इस तकनीक को एक बाह्य मिलान करने के लिए एक उपयुक्त एंटीबॉडी प्रदान करने, सेल प्रकार और सेल सतह प्रोटीन की एक श्रृंखला के लिए मोटे तौर पर लागू है उपलब्ध है.
Introduction
नव पहचान प्रोटीन के समारोह की स्थापना में, सवाल में प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण और तस्करी की जांच प्रोटीन 1,2 की संभावना भूमिका / एस के बारे में महत्वपूर्ण सुराग दे सकता है. विकासशील neocortex 3 के transcriptome की पहले से पंजीकृत विश्लेषण माउस मस्तिष्क corticogenesis के दौरान बदल अभिव्यक्ति का प्रदर्शन जीन की एक सूची के साथ हमें प्रदान की है. हम तो इन जीनों में से एक, sez6 द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन, न्यूरॉन विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका है कि पता लगाने के लिए एक जीन पीटा दृष्टिकोण अपनाया. हम जब्ती से संबंधित जीन 6, या Sez6, प्रोटीन के विकास डेन्ड्राइट में स्थित और भी वृक्ष के समान spines, प्राप्त और उत्तेजक संकेत है कि एकीकृत डेन्ड्राइट पर विशेष संरचनाओं में मौजूद है कि मनाया. इस प्रोटीन की कमी है इसके अलावा, जब डेन्ड्राइट और उत्तेजक synapses सही ढंग से 4 फार्म असफल. प्रोटीन की संभावित प्रमुख isoform एक transmembran की विशेषताएं हैई रिसेप्टर immunolabeled प्रोटीन की subcellular वितरण confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा या immunoelectron माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई थी जब, हालांकि ज्यादातर, नहीं तो सब, संकेत के प्लाज्मा झिल्ली पर लेबल थोड़ा, या नहीं, प्रोटीन के साथ somatodendritic डिब्बे में छोटे vesicles के साथ जुड़ा हुआ दिखाई दिया कोशिका की सतह पर.
निश्चित एक भविष्यवाणी की बड़ी बाह्य डोमेन के साथ इस ख्यात रिसेप्टर प्लाज्मा झिल्ली में अवैध है कि दिखाने के लिए, हम हम कोशिका की सतह पर प्रोटीन लेबल करने के लिए प्रोटीन का एक बाह्य भाग को उत्पन्न किया था सीरमरोधी का उपयोग कर एक जीवित कोशिका दृष्टिकोण अपनाया. एक व्यापक अवरुद्ध कदम और एक permeabilization कदम से अलग कर विभिन्न लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के दो अनुप्रयोगों के साथ इस "एंटीबॉडी खिला" दृष्टिकोण के संयोजन से, हम fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी अलग fluoresc असर के बंधन से प्रतिष्ठित प्रोटीन की दो अलग ताल की पहचान करने में सक्षम थेईएनटी टैग. इस प्रकार, हम या तो कोशिका की सतह पर बने रहे या इस अवधि के दौरान सतह के लिए तस्करी कर रहा था कि प्रोटीन से एंटीबॉडी ऊष्मायन चरण के दौरान endocytosis से भली भाँति किया गया था कि प्रोटीन भेद करने में सक्षम थे. इस पद्धति का उपयोग करके, हम ब्याज की प्रोटीन न्यूरॉन्स में कोशिका की सतह के लिए और से तस्करी कर रहा है कि स्थापना की. इसलिए, यह अपेक्षाकृत तेज और आसान तकनीक हम सभी इन तकनीकों के लिए एक ही खरगोश पॉलीक्लोनल सीरमरोधी प्रयोग किया जाता है कि इस तथ्य के बावजूद पारंपरिक immunocytochemistry तरीकों या पूर्व embedding immunogold इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से अधिक जानकारीपूर्ण साबित कर दिया. इस तकनीक कोशिकी डोमेन epitopes पहचानने एक अच्छा प्रतिरक्षी उपलब्ध है प्रदान की किसी भी transmembrane प्रोटीन के लिए आम तौर पर लागू है. तकनीक ग्लूटामेट रिसेप्टर GluR1 सबयूनिट 5 रिसेप्टर तस्करी का अध्ययन करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है.
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Protocol
1. अलग hippocampal न्यूरॉन संस्कृति
- Coverslips (borosilicate ग्लास) तैयार करें:
- 100% इथेनॉल में धो लें.
- यूवी विकिरण के तहत शुष्क हवा.
- पाली-D-लाइसिन (4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर 0.15 मीटर borate बफर में 0.5 मिलीग्राम / एमएल) के साथ कोट.
- अगले दिन (संस्कृति के दिन) laminin साथ फिर कोट पीबीएस में 3x धोने में (2.5 माइक्रोग्राम / एमएल, प्राकृतिक माउस laminin) + 5% v / वी गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) 2 घंटा पर के लिए पीबीएस में पतला 37 डिग्री सेल्सियस
- भ्रूण दिन 18 (E18) चूहा हिप्पोकाम्पी काटना और कैल्शियम और मैग्नीशियम, बर्फ पर ठंडा युक्त पीबीएस में इकट्ठा. नोट: जानवरों को शामिल सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल मेलबर्न विश्वविद्यालय के पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार Papain हदबंदी किट से papain और DNase मैं समाधान तैयार करें.
- 1 मिलीलीटर papain समाधान के लिए 50 μl DNase मैं समाधान जोड़ें.
- नोट: एक बारपहले तैयार, papain समाधान और DNase मैं समाधान अलग से (क्रमशः, papain और DNase मैं के लिए 0.5 मिलीग्राम और 25 μl aliquots) aliquots में तिरस्कृत और जब तक जरूरत -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- जितना संभव हो उतना पीबीएस निकालें और 15-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर papain / DNase मैं समाधान के साथ (भ्रूण में से एक कूड़े से) हिप्पोकाम्पी सेते हैं. धीरे ऊष्मायन अवधि के दौरान दो बार सामग्री मिश्रण करने के लिए ट्यूब झटका.
- सेल फैलाव प्राप्त की है और यदि कोई हो, कुछ है जब तक एक लौ पॉलिश siliconized पाश्चर पिपेट 10-15x के साथ धीरे हिप्पोकैम्पस ऊतक (बुलबुले की पीढ़ी से परहेज) Triturate, undissociated ऊतक का हिस्सा बने हुए हैं.
- ध्यान हैंक्स बैलेंस्ड नमक समाधान प्लस additives में वी गोजातीय सीरम albumin (BSA) w / 4% की 3 मिलीलीटर गद्दी से अधिक अलग सेल निलंबन लेयर (HBSS; धारा 1.6.1 देखें).
- हलचल के बिना कमरे के तापमान पर बीएसए भंग करके इस कदम ढाल समाधान तैयार2 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी MgSO 4, 4 मिमी 3 NaHCO और 40 मिमी ग्लूकोज (HBSS) 4 डिग्री सेल्सियस पर तो बाँझ फिल्टर और दुकान युक्त HBSS में अंगूठी
- अपकेंद्रित्र, 100 XG, एक स्विंग बाहर रोटर के साथ एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र में 7 मिनट.
- सतह पर तैरनेवाला सेल गोली महाप्राण के लिए नहीं सावधान किया जा रहा निकालें.
- 1 मिलीलीटर में एक लौ पॉलिश (siliconized) पाश्चर पिपेट (या 1 मिलीलीटर नीले पिपेट टिप) के साथ धीरे pelleted कोशिकाओं Resuspend पूरा Neurobasal मध्यम (2% B27 के साथ, 0.5 मिमी एल glutamine 1% FCS साथ पूरक).
- (केवल "" जी कोशिकाओं के रूप में चरण उज्ज्वल कोशिकाओं गिनती नायब) एक hemocytometer का उपयोग दो 10 μl aliquots गणना.
- Preprepared लेपित कांच coverslips (12 अच्छी तरह से थाली में 0.75-1 x 10 5/18 मिमी coverslip) पर प्राथमिक न्यूरॉन्स प्लेट. (देखें नीचे) तुरंत पहले चढ़ाना, coverslips से अतिरिक्त laminin / सीरम समाधान aspirate और प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति के माध्यम से बदलें. नायब आवश्यक ncoverslips का भूरा रंग coverslip तैयारी पूर्व संस्कृति को सुबह शुरू हो गया है के रूप में (1.1 कदम देखें) अग्रिम में निर्धारित किया जाना चाहिए.
- संस्कृति चूहा प्राथमिक E18 Neurobasal मध्यम में इन विट्रो (DIV), 2% B27, 1% एफसीएस (गर्मी निष्क्रिय) के साथ पूरक 0.5 मिमी एल glutamine में अप करने के लिए 21 दिनों के लिए hippocampal न्यूरॉन्स. साप्ताहिक उसके बाद 7 DIV और एक आधा मध्यम परिवर्तन प्रदर्शन करना. विरोधी mitotic fluorodeoxyuridine / uridine 7 DIV पर जोड़ा जाता है, प्रत्येक न्यूक्लीओसाइड के 10 मिमी शेयर) की 1/1, 000 कमजोर पड़ने glial अतिवृद्धि को रोकने के लिए.
2. लाइव न्यूरॉन्स के साथ एंटीबॉडी ऊष्मायन
- संस्कृति में पहले सप्ताह के दौरान, न्यूरॉन्स वृक्ष के समान arbors विकसित कर रहे हैं और सप्ताह में 2-3 से, न्यूरॉन्स synaptogenesis 6,7 के दौर से गुजर होने के लिए पर्याप्त परिपक्व है.
- चयनित प्रयोगात्मक समय बिंदु / s, coverslips पर प्राथमिक भ्रूण न्यूरॉन्स युक्त कुओं तिहरा को प्राथमिक एंटीबॉडी लागू होते हैं. सीधे की संस्कृति के माध्यम में एंटीबॉडी के एक विभाज्य जोड़ेंवांछित अंतिम कमजोर पड़ने नोट को प्राथमिक न्यूरॉन्स: हमारे उदाहरण में, प्रोटीन का एक पुनः संयोजक secreted फार्म के खिलाफ उठाए गए एक खरगोश पॉलीक्लोनल सीरमरोधी कुएं में संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर के लिए 2 μl जोड़कर 1/500 पतला था, 10 मिनट के लिए एक centrifugation , 13,000 XG, आरटी पहले इस रूप में एंटीबॉडी के एक विभाज्य लेने के लिए शामिल किया जा सकता है किसी भी बात कण निकाल देंगे और पृष्ठभूमि कम करने में मदद कर सकते हैं.
- Preimmune सीरम नियंत्रण के लिए, (एक ही अंतिम कमजोर पड़ने के लिए) preimmune सीरम के एक बराबर राशि जोड़ें. कोई preimmune सीरम उपलब्ध है, तो Neurobasal मध्यम या पीबीएस के बराबर मात्रा (कोई प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण) जोड़ने. एक उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी प्रोटीन के intracellular क्षेत्र / एस पहचानता है कि उपलब्ध है, तो वैकल्पिक रूप से, इस एंटीबॉडी अच्छी तरह से सतह धुंधला की विशिष्टता का परीक्षण करने के क्रम में एक नियंत्रण करने के लिए जोड़ा जा सकता है.
- 1-4 घंटे के लिए संस्कृति इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें (इस ऊष्मायन अवधि अनुभव से निर्धारित किया जा सकता है). हमारे experime मेंप्रयोगात्मक डिजाइन internalization के समय के पाठ्यक्रम का आकलन करने के लिए धोने के आउट होने के बाद एक और ऊष्मायन अवधि (एक नाड़ी चेस प्रयोग) द्वारा पीछा एंटीबॉडी की एक नाड़ी शामिल कर सकता है, हालांकि एनटीएस, एंटीबॉडी पूरी अवधि के लिए मौजूद थे.
वैकल्पिक कदम: इस ऊष्मायन यदि आवश्यक हो तो, बेसल प्रोटीन internalization की दर को धीमा करने के लिए कमरे के तापमान पर या यहां तक कि बर्फ पर बाहर किया जा सकता है. एक गैर सीओ 2 नियंत्रित वातावरण में प्रदर्शन किया है, तो मध्यम बाइकार्बोनेट एंटीबॉडी / सीरमरोधी के अलावा पहले बफर नहीं है कि एक के लिए परिवर्तित किया जाना चाहिए. चेतावनी: परिपक्व न्यूरॉन संस्कृतियों (> 14 दिन, और विशेष रूप से सभ्य माउस भ्रूण न्यूरॉन्स) अच्छी तरह से पूरा मध्यम परिवर्तन बर्दाश्त नहीं है.
- इष्टतम समय ब्याज की प्रोटीन की बहुतायत पर निर्भर है और साथ ही होगा, हालांकि हम अच्छे परिणाम के साथ 1 घंटा, 2 घंटा, और 4 घंटे के इस प्राथमिक एंटीबॉडी internalization कदम के लिए ऊष्मायन बार इस्तेमाल किया है सेल में प्रोटीन की तस्करी की गतिशीलताअध्ययन के तहत रास.
नोट: प्रतिनिधि परिणाम में दिखाया दोहरी रंग छवियों को एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे की एक ऊष्मायन के साथ प्राप्त किया गया. - वांछित अवधि के लिए ऊष्मायन के बाद, एंटीबॉडी युक्त मध्यम बंद aspirate. कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ धीरे लेकिन तेजी से एक बार कुओं धो लें.
3. फिक्स्ड, Unpermeabilized कोशिकाओं को माध्यमिक एंटीबॉडी आवेदन
- फॉस्फेट बफर पीएच 7.2 में 4% paraformaldehyde के साथ न्यूरॉन्स फिक्स, कमरे के तापमान नोट पर 5 मिनट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, हौसले से तैयार लगानेवाला का उपयोग करें, नहीं उपजी paraformaldehyde स्पष्ट है कि इतने वैकल्पिक रूप से -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और पूरी तरह thawed किया गया है कि निदान का उपयोग . चेतावनी: paraformaldehyde लगानेवाला तैयार है और एक धूआं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए.
- वेल्स (धूआं हुड में तरल अपशिष्ट कंटेनर को हस्तांतरण) से तय निकालें और पीबीएस के साथ 3x कुल्ला.
- वैकल्पिक कदम: अगर वांछित, एंटीबॉडी अभिकर्मकों को बचाने के लिए, coverslips कर सकते हैंध्यान से संदंश के साथ 12 अच्छी तरह से थाली से हटा दिया है और एक डिस्पोजेबल संस्कृति प्लेट के आधार पर रखी Parafilm के एक पत्रक पर, सेल साइड अप रखा जाना.
- वे पूरी तरह से Parafilm पर coverslip के किनारे पर समाधान बाढ़ के बिना कवर किया जाता है, ताकि समाधान तो coverslips पर धीरे pipetted किया जा सकता है.
- इस तकनीक (जैसे रातोंरात) एक humidified कक्ष में बाहर किया जाना चाहिए लेकिन अब incubations अल्पकालिक incubations (1-2 घंटे) के लिए उपयुक्त है. वैकल्पिक रूप से, coverslips वापस रातोंरात ऊष्मायन और पर्याप्त मात्रा के लिए 12 अच्छी तरह से थाली के कुओं में रखा जा सकता है coverslips बाहर सूखी नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए.
- पीबीएस में 5% BSA (: यह कोशिकाओं permeabilized नहीं कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है के रूप में इस स्तर पर अवरुद्ध समाधान करने के लिए डिटर्जेंट न जोड़ें नोट) के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ब्लॉक.
- Detec के साथ आगे बढ़ने से पहले सतह प्रोटीन लेबल करने के लिए आदेश मेंभली भाँति प्रोटीन की tion, चुनाव के पहले fluorescently लेबल 2 ° एंटीबॉडी लागू होते हैं.
नोट: यहां वर्णित उदाहरण में, प्राथमिक सीरमरोधी एक पुनः संयोजक secreted isoform 4 खरगोश (घर में एंटीबॉडी) में उठाया गया था. इस प्रकार, unpermeabilized न्यूरॉन्स की सतह पर transmembrane isoform के बाह्य क्षेत्र का पता लगाने के लिए सबसे पहले माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए, हम गधा विरोधी खरगोश DyLight 649 (5% BSA युक्त पीबीएस में पतला 1/200) का इस्तेमाल किया. यह प्रयोग करने से पहले पतला एंटीबॉडी समाधान (10 मिनट, 13,000 XG, आर टी) अपकेंद्रित्र की सिफारिश की है. - कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए coverslips सेते हैं.
- पीबीएस के साथ (वेल्स) में coverslips धोने, 2x 5 मिनट.
4. अतिरिक्त लेबल न किए गए 2 ° एंटीबॉडी के साथ ब्लॉकिंग
- Unlabeled 2 ° एंटीबॉडी के एक उच्च एकाग्रता (> 0.1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ unpermeabilized न्यूरॉन्स ब्लॉक.
- unlabeled 2 ° एंटीबॉडी प्रजातियों के खिलाफ उठाया जाना चाहिए जिसमेंप्राथमिक एंटीबॉडी कमरे के तापमान पर ऊष्मायन रातोंरात द्वारा इस मामले (खरगोश) में उठाया गया था.
- इस प्रोटोकॉल के लिए, AffiniPure एफ अटल बिहारी टुकड़ा विरोधी खरगोश बकरी आईजीजी (एच + एल) 0.13 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया था.
नोट: रातोंरात ऊष्मायन एक छोटी ऊष्मायन अवधि (2 घंटे) के रूप में महत्वपूर्ण हो पाया था पूरी तरह से लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी से बाध्य नहीं किया गया है कि प्राथमिक एंटीबॉडी का पूरा रोकने के लिए अपर्याप्त था.
- पीबीएस के साथ (वेल्स) में coverslips धोने, 2x 5 मिनट.
- इस अवरुद्ध कदम के बाद, फॉस्फेट बफर पीएच 7.2, कमरे के तापमान पर 5 मिनट में 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं के बाद तय कर लो. (धूआं हुड में तरल अपशिष्ट कंटेनर को हस्तांतरण लगानेवाला) लगानेवाला को हटाने के बाद पीबीएस (2x) के साथ कुल्ला.
5. दूसरा Fluorescently संयुग्मित 2 ° एंटीबॉडी की Permeabilization और अनुप्रयोग
- Permeabilize और कमरे Tempe में 0.1% ट्राइटन-X-100 युक्त पीबीएस में 5% BSA के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक30 मिनट के लिए rature.
- अवरुद्ध समाधान (coverslips बाहर सूखी नहीं है कि देखभाल) निकालें. एक अलग fluorophore साथ टैग दूसरा fluorescently संयुग्मित 2 ° एंटीबॉडी जोड़ें.
- नोट: यह (नीचे देखें) confocal खुर्दबीन पर उपलब्ध / उत्तेजना उत्सर्जन फिल्टर पर निर्भर करता है, पहले से इस्तेमाल एक से इस fluorophore टैग अंतर करना संभव होगा.
- इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत उदाहरण के लिए, एक एलेक्सा Fluor 488 संयुग्मित गधा विरोधी खरगोश 2 ° एंटीबॉडी (1 / पीबीएस में 200, 5% BSA और 0.1% ट्राइटन-X-100) का इस्तेमाल किया गया था. कमरे के तापमान पर 2 घंटा सेते हैं तो 2 ° एंटीबॉडी समाधान निकालें.
- धो पीबीएस के साथ 3x 5 मिनट coverslips और, अंततः, विआयनीकृत पानी के साथ संक्षिप्त धोने.
6. बढ़ते और इमेजिंग
- माउंट एक जलीय बढ़ते मध्यम युक्त antifade (जैसे Vectashield) के साथ कांच स्लाइड पर coverslips और सूखी अनुमति देते हैं. सेशन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोरफ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता का timal संरक्षण.
- छवि एक confocal खुर्दबीन पर कोशिकाओं immunostained.
- दो फ्लोरोफोरे संकेतों का पता लगाने के लिए उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर उपलब्ध होना चाहिए.
- विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों (depolarized 8,9 या नियंत्रण परिस्थितियों में उदाहरण के लिए, internalization दर) की तुलना में किया जा रहे हैं, सभी एक ही छवि अधिग्रहण मापदंडों के साथ imaged हैं विभिन्न स्थितियों से coverslips दोहराने कि सुनिश्चित करते हैं. मानक ब्याज के क्षेत्रों या जिसके परिणामस्वरूप छवियों से puncta विशेषताओं (जैसे संख्या, आकार) के एकीकृत घनत्व तो मानक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे फिजी / ImageJ, Metamorph) का उपयोग करके मापा जा सकता है.
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Representative Results
यहाँ प्रस्तुत दोहरी रंग फ्लोरोसेंट immunostaining तकनीक (चित्रा 1 में रेखाचित्र के रूप में दिखाया गया है) जीवित कोशिकाओं में transmembrane प्रोटीन की कोशिकी डोमेन लेबलिंग के लिए उपयोगी है. ऊष्मायन अवधि के दौरान, immunoglobulins सुलभ epitopes बाँध और एक साथ ही एंटीबॉडी के साथ प्रोटीन अणुओं की आबादी के अनुपात, endocytosed है. इसके अलावा, नए संश्लेषित प्रोटीन आगे तस्करी के माध्यम से कोशिका की सतह तक पहुंच सकता है और पुनर्नवीनीकरण प्रोटीन अणुओं प्लाज्मा झिल्ली 10 को लौट जा सकता है.
इस विधि के दो अलग प्रोटीन पूल, सेल सतह का पता लगाने के लिए अनुकूलित है और अध्ययन के तहत प्रोटीन के लिए विशिष्ट वही प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग, भली भाँति किया गया है. पूर्व permeabilization के लिए तय की कोशिकाओं को एक fluorescently टैग किया माध्यमिक एंटीबॉडी लागू करके, निर्धारण के समय में सेल सतह पर स्थानीय प्रोटीन का पता लगाया जा सकता है. एक Thor का समावेशough प्रारंभिक माध्यमिक एंटीबॉडी से बाध्य नहीं किया गया है कि शेष प्रोटीन प्राथमिक एंटीबॉडी सतह परिसरों के किसी भी बंधन निषेध करने के लिए कदम अवरुद्ध अनुमति देता ऊष्मायन के दौरान endocytosed गया है कि प्रोटीन एंटीबॉडी परिसरों की (एक अलग fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ) बाद में पता लगाने अवधि (चित्रा 1).
इस विधि के साथ प्राप्त की दोहरी रंग लेबलिंग के प्रतिनिधि छवियों चित्रा 2 में दिखाया गया. किसी भी शेष सतह प्रोटीन / प्राथमिक एंटीबॉडी परिसरों के बंधन संतृप्ति के उद्देश्य से प्रासंगिक unlabeled माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लंबी अवधि (रातोंरात ऊष्मायन) के एक अवरुद्ध कदम का समावेश, इस दृष्टिकोण की सफलता के लिए महत्वपूर्ण साबित हुई. पूर्व permeabilization को unlabeled माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इस अवरुद्ध कदम की दक्षता एक Arrowhead द्वारा चिह्नित छोटे सेल के अपवाद के साथ डबल दाग puncta के अभाव (द्वारा प्रदर्शन किया हैचित्रा 2), जो गोल हुआ और गाढ़ा प्रदर्शित होने, एक मरते हुए सेल की विशेषता आकारिकी दर्शाती है. दो लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए स्थितियां और संयोजन का अनुकूलन आवश्यक हो सकता है और कोई प्राथमिक एंटीबॉडी हालत एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है. इस प्रोटोकॉल तक काम करते हैं, हम इसे पूरी तरह से विशेष रूप से यहां वर्णित रातोंरात ऊष्मायन से कम समय अवरुद्ध साथ, कुछ लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के अविशिष्ट बंधन ब्लॉक करने के लिए संभव नहीं था.
सभ्य न्यूरॉन्स में भली भाँति प्रोटीन की एकल रंग लेबलिंग (चित्रा 3) के उदाहरण endosomal डिब्बे 10,11 में प्रोटीन की विशेषता कबरा धुंधला पैटर्न पर प्रकाश डाला. एंटीबॉडी खिला ऊष्मायन के दौरान भाँति कि प्रोटीन की पुष्टि करने और प्रदर्शित कबरा धुंधला endosomes में स्थानीयकृत किया गया था, एक प्रारंभिक / पुनर्चक्रण endosome मार्कर (transferrin-mCherry व्यक्त न्यूरॉन्स, टीएफआर-मातृ एवं शिशु स्वास्थ्य) 12 permeabilization के बाद immunostained गया. टीएफआर-मच अभिव्यक्ति के साथ कबरा धुंधला की व्यापक ओवरलैप 4 चित्र में दिखाया गया है.
चित्रा 1. लाइव सभ्य न्यूरॉन्स के एंटीबॉडी खिलाने के बाद दोहरी रंग सेल सतह की लेबलिंग और भली भाँति प्रोटीन दिखा योजनाबद्ध. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. लाऔर भली भाँति प्रोटीन (हरा, int); सेल सतह प्रोटीन (Ext सियान) के beling. साथ विलय छवि (मर्ज) के साथ एक सुसंस्कृत चूहे hippocampal न्यूरॉन पर डबल धुंधला (Arrowhead) केवल जाहिरा तौर पर अस्वस्थ था कि एक सेल में मनाया गया. स्केल बार = 10 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. एकल रंग (भाँति प्रोटीन) की उच्च शक्ति देखने endocytosed प्रोटीन की ठेठ कबरा पैटर्न दिखा immunostaining. स्केल बार = 10 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4. पुनर्चक्रण endosome के लिए एक फ्लोरोसेंट मार्कर (एक transferrin रिसेप्टर mCherry संलयन प्रोटीन, टीएफआर-मातृ एवं शिशु स्वास्थ्य के लिए एक अभिव्यक्ति का निर्माण, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 2000 Lipofectamine [Invitrogen] का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था व्यक्त एक न्यूरॉन के वृक्ष के समान कुंज के एक क्षेत्र ). अभिकर्मक के बाद दिन, न्यूरॉन्स पुनर्चक्रण endosome डिब्बे के साथ ओवरलैप दिखा, endocytosed प्रोटीन (उम्मीदवार रिसेप्टर) के लिए) permeabilization के बाद (दाग रहे थे. स्केल बार = 20 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
यहाँ वर्णित तकनीक (द्वारा Arancibia-Carcamo एट अल. समीक्षा) सेल सतह biotinylation 12 की है कि पूरक है और यह भली भाँति प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण के बारे में जानकारी के संरक्षण के लिए पसंद की विधि है, एक उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी एक के लिए प्रदान की बाह्य मिलान उपलब्ध है. इसके अलावा, समय के साथ प्रोटीन की तस्करी / internalization के quantitation प्रोटीन के अर्क तैयार करने की जरूरत के बिना (प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लाइव सेल ऊष्मायन के दौरान अलग अलग समय पर coverslips फिक्सिंग से) किया जा सकता है.
तीव्रता या संख्या और हित के क्षेत्रों में puncta के आकार (उदाहरण के लिए, सोमा से एक निर्धारित दूरी पर पिरामिड neuronal somata या समीपस्थ शिखर डेन्ड्राइट के शिखर क्षेत्रों) confocal छवियों में विभिन्न परिस्थितियों में मापा जा सकता है तुलना (धुंधला उदाहरण के लिए , बेसल स्तर बनाम प्रेरित 8,9). भाँति रिसेप्टर हस्ताक्षरएनएएल तीव्रता फिर सतह रिसेप्टर्स की है कि सामान्यीकृत किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, तकनीक पहले से भली भाँति, एंटीबॉडी बाध्य प्रोटीन पर लौटने के लिए अनुमति देने के लिए एक ऊष्मायन द्वारा पीछा कोशिका की सतह से शेष एंटीबॉडी को दूर करने के लिए एक अलग करना कदम के शामिल किए जाने के माध्यम से वापस कोशिका की सतह को रीसाइक्लिंग रिसेप्टर के quantitation के लिए अनुकूलित किया जा सकता सतह 13.
इस पद्धति का उपयोग करके, हम Sez6, ब्याज की ख्यात झिल्ली रिसेप्टर, पहुँचता है और न्यूरॉन्स में सेल सतह पर स्थानीय है कि इस बात की पुष्टि करने में सक्षम थे. अधिक सामान्य रूप से प्रयुक्त immunofluorescence या immunoelectron माइक्रोस्कोपी (पूर्व embedding immunogold) प्रोटोकॉल पहले से विफल रहा था, जहां इस प्रकार, इस तकनीक का सफल रहा. इस प्रोटीन की प्राथमिक अमीनो एसिड अनुक्रम के आधार पर भविष्यवाणियों के बावजूद, सेल सतह पर अपनी उपस्थिति का निश्चित सबूत प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो गया था. हम nonpermeabilized कोशिकाओं की सतह पर पाया प्रोटीन भेद के रूप में आसानी से दिखाई दे रहा थाsomatodendritic और axonal डिब्बों में intracellularly मौजूद लोगों को इसी तरह की विशेषताओं रखने टी puncta. इस सतह कबरा धुंधला के लिए एक संभावित व्याख्या यह एंटीबॉडी के बंधन internalization उत्तेजित और, इसलिए, नवजात क्लैथ्रिन लेपित गड्ढ़े 14 में क्लस्टर कार्गो का पता लगाने के लिए सक्षम हो सकता है. जल्दी / पुनर्चक्रण endosome संवाददाता टीएफआर-mCherry के साथ कि भली भाँति प्रोटीन puncta के धुंधला पैटर्न के ओवरलैप इस अवधारणा को अप्रत्यक्ष समर्थन देते हैं. इसके अतिरिक्त, हम प्रोटीन का एक अनुपात भी सतह पर अपने क्लस्टर वितरण के लिए खातों जो लिपिड rafts में मौजूद है कि सबूत (अप्रकाशित) है.
हम मौजूदा प्रोटोकॉल में न्यूरॉन्स पर हमारा ध्यान केंद्रित किया है, हम glial कोशिकाओं आकृति विज्ञान जैसी astrocytes में (प्रोटीन की स्रावित और / या cleaved संस्करणों का प्रतिनिधित्व करने की संभावना) immunoreactive प्रोटीन की तेज का सबूत मनाया. यह निष्कर्ष हितों की हैसेंट, यह यह विधि अन्य प्रकार की कोशिकाओं को लागू किया जाएगा तात्पर्य है कि क्योंकि विधि दूसरे स्रावित (उदाहरण के लिए, cocultures में) कारकों और, के पैराक्राइन प्रभाव के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है इंगित करता है कि सबसे पहले है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
लेखकों के आंकड़ों के साथ सहायता के लिए Teele Palumaa धन्यवाद. राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद, ऑस्ट्रेलिया से परियोजना अनुदान 1008046 द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| Fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| Uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm Round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC - handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen - Molecular Probes | A21206 |
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