Summary
Vi beskriver en fremgangsmåte for å merke proteiner på overflaten av levende neuroner ved å bruke et spesifikt polyklonalt antistoff til ekstracellulære epitoper. Protein bundet av antistoff på celleoverflaten og senere internaliseres via endocytose kan skilles fra protein som gjenstår, eller trafikk til, overflaten i løpet av inkuberingen.
Abstract
For å demonstrere den celleoverflaten lokalisering av et antatt transmembranreseptoren i dyrkede nevroner, merket vi proteinet på overflaten av levende neuroner med en bestemt primær antistoff reist mot en ekstracellulær del av proteinet. Gitt at reseptorer er trafikkert til og fra overflaten, hvis celler er permeabilized etter fiksering og deretter både celle-overflate og interne protein vil bli detektert av den samme merket sekundært antistoff. Her vi tilpasset en metode som brukes for å studere protein handel ("antistoff feeding") for å differensielt etikett protein som var blitt internalisert etter endocytose ved antistoffet inkubasjonstrinn og protein som enten forble på celleoverflaten eller er trafikkert til overflaten i løpet av denne perioden . Evnen til å skille mellom disse to dammer av protein ble gjort mulig ved inkorporering av en over natten blokkering trinn med høyt konsentrert umerket sekundært antistoff etter en innledende inkuberingn av unpermeabilized nevroner med en fluorescently-merket sekundært antistoff. Etter blokkerende trinn, permeabilization av neuronene tillatt påvisning av internalisert basseng med et fluorescerende sekundært antistoff som er merket med en annen fluorofor. Ved hjelp av denne teknikken vi var i stand til å innhente viktig informasjon om den subcellulære plasseringen av denne antatte reseptor, avslører at det var faktisk smugles til celleoverflaten i nevroner. Denne teknikken er bredt anvendelig på en rekke celletyper og celle-overflateprotein, og gir et egnet antistoff til en ekstracellulær epitope er tilgjengelig.
Introduction
I etablere funksjonen av nylig identifiserte proteiner, kan etterforskningen av den subcellulære lokalisering og trafficking av proteinet i spørsmålet gi viktige ledetråder om den sannsynlige rolle / s av protein 1,2. Bioinformatiske analyse av transcriptome av utviklings neocortex 3 gitt oss en liste av gener som viser endret uttrykk under mus hjernen corticogenesis. Vi deretter vedtatt et gen knockout tilnærming for å fastslå at proteinet kodet av en av disse genene, sez6, har en nøkkelrolle i nevroner utvikling. Vi observerte at Seizure-relatert gen 6, eller Sez6, protein ligger i utviklings dendritter og er også til stede i dendrittutløperne, spesialiserte strukturer på dendritter som mottar og integrerer eksitatoriske signaler. Videre, når dette proteinet mangler, dendritter og eksitatoriske synapser mislykkes i å danne fullstendig 4.. Den sannsynlige dominerende isoform av proteinet har funksjonene til et transmembrane reseptoren selv, når den subcellulære fordeling av immunolabeled protein ble undersøkt ved konfokal mikroskopi eller ved immunoelectron mikros de fleste, om ikke alle, av signalet først forbundet med små blærer i somatodendritic rommet med liten, eller ingen, protein merket på plasmamembranen på celleoverflaten.
For definitivt å vise at denne antatte reseptor med en forutsagt stort ekstracellulært domene er trafikkert til plasmamembranen, vi innført en levende celle tilnærming ved hjelp av antiserum som vi hadde generert til en ekstracellulær del av proteinet til å merke proteiner på celleoverflaten. Ved å kombinere denne "antistoff fôring" tilnærming med to anvendelser av forskjellig-merket sekundært antistoff adskilt av en omfattende blokkering trinn og en permeabilization skritt, var vi i stand til å identifisere to ulike bassenger av protein preget av binding til fluorescently-merket sekundære antistoffer peiling forskjellige fluorescerendeent koder. Således, var vi i stand til å skille protein som var blitt internalisert etter endocytose ved antistoffet inkubasjonstrinn fra protein som enten forble på celleoverflaten eller er trafikkert til overflaten i løpet av denne perioden. Ved hjelp av denne fremgangsmåte ble det etablert at proteinet av interesse er trafikkert til og fra celleoverflaten i nerveceller. Derfor denne relativt rask og enkel teknikk vist seg mer informativ enn tradisjonelle immunocytokjemi metoder eller pre-embedding immunogold elektronmikroskopi, til tross for at vi brukte samme kanin polyklonale antiserum for alle disse teknikkene. Denne teknikk er anvendbar generelt for enhver transmembran protein ga en god antistoff gjenkjenne ekstracellulære domene epitoper er tilgjengelig. Teknikken har blitt brukt tidligere for å studere reseptor smugling av glutamat reseptor GluR1 subenhet fem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Dissociated Hippocampus Neuron Kultur
- Forbered Dekk (borsilikatglass):
- Vask i 100% etanol.
- Lufttørk under UV bestråling.
- Coat med poly-D-lysin (0,5 mg / ml i 0,15 M boratbuffer, over natten ved 4 ° C).
- På den neste dag (dag av kulturen) vaskes 3 ganger i PBS og deretter belegge med laminin (2,5 mikrogram / ml, naturlige mus laminin) + 5% volum / volum varmeinaktivert føtalt kalveserum (FCS) fortynnet i PBS i 2 timer ved 37 ° C.
- Dissekere embryonale dag 18 (E18) rotte hippocampi og samle inn PBS som inneholder kalsium og magnesium, kjølt på is. MERK: alle eksperimentelle protokoller som involverer dyr ble godkjent av dyreetikk komité ved University of Melbourne.
- Klargjør papain og DNase I løsninger fra Papain Dissosiasjon Kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Tilsett 50 mL DNase I-løsning til 1 ml papain løsning.
- MERK: Nårførst fremstilt, kan papain løsningen og DNase I-løsninger bli dispensert separat i alikvoter (0,5 ml og 25 ul delmengder av papain og DNase I, henholdsvis) og lagret ved -20 ° C inntil behov.
- Fjerne så mye som mulig PBS og inkuberes hippocampi (fra en kull med embryoer) med 1 ml papain / DNase I-løsning ved 37 ° C i 15-20 min. Knips forsiktig på røret for å blande innholdet to ganger i løpet av inkubasjonstiden.
- Triturer hippocampus vevet forsiktig (for å unngå dannelse av bobler) med en flammepolert silikonisert Pasteur-pipette 10-15x til celle spredning er oppnådd, og få, om noen, biter av undissociated vev forblir.
- Lag forsiktig dissosiert cellesuspensjonen i løpet av en 3 ml pute av 4% vekt / volum bovint serumalbumin (BSA) i Hanks balanserte saltoppløsning pluss additiver (HBSS +, se avsnitt 1.6.1).
- Forbered denne trinngradient løsning ved å oppløse BSA ved romtemperatur uten oppsiktring i HBSS inneholdende 2 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 4 mM NaHCO3 og 40 mM glukose (HBSS +) og deretter steril-filter og oppbevares ved 4 ° C.
- Sentrifuger, 100 xg, 7 min i en benk sentrifuge med en swing-out rotor.
- Fjern supernatanten være forsiktig for ikke å suge cellepelleten.
- Resuspender de pelleterte cellene forsiktig med en flammepolert (silikonisert) Pasteur pipette (eller en 1 ml blå pipettespissen) i 1 ml komplett Neurobasal medium (med 2% B27, 0,5 mM L-glutamin supplert med 1% FCS).
- Count to 10 ul delprøver ved hjelp av en hemocytometer (NB bare telle fase lyse celler som "levende" celler).
- Plate primære nevroner på preprepared belagte glass dekkglass (0.75-1 x 10 5/18 mm dekkglass i 12-brønns plate). Umiddelbart før pletter suge overflødig laminin / serum-løsning fra dekkglass og erstatte med primær neuron kulturmedium (se nedenfor). NB Den nødvendige numbra av Dekk må bestemmes på forhånd som dekk preparatet er begynt dagen før kultur (se trinn 1.1).
- Kultur-rat primære E18 hippocampal neuroner i opp til 21 dager in vitro (DIV) i Neurobasal medium, 2% B27, 0,5 mM L-glutamin supplert med 1% FCS (varme-inaktivert). Utfør en halv medium endring på 7 DIV og ukentlig etterpå. Den anti-mitotisk fluorodeoxyuridine / uridin tilsettes i 7 DIV, 1/1 000 fortynning av 10 mM lager av hvert nukleosid) for å forebygge glial overvekst.
2. Antistoff Inkubasjon med Levende Nerveceller
- I løpet av den første uken i kultur, er nevroner utvikle dendrittiske lysthus og etter uke 2-3, har nevroner modnet tilstrekkelig å være under synaptogenesis 6,7.
- På utvalgte eksperimentell tidspunkt / s, gjelder det primære antistoffet å triplikate brønner inneholder primære embryonale nevroner på dekkglass. Til en aliquot av antistoff direkte i kulturmediet avde primære neuroner til den ønskede endelige fortynning Merk: I vårt eksempel, en kanin polyklonalt antiserum dannet mot et rekombinant utskilt form av proteinet ble fortynnet 1/500 ved å tilsette 2 pl til 1 ml av kulturmedium i tillegg, en sentrifugering i 10 min , 13.000 xg, RT kan innarbeides før inntak av en aliquot av antistoff, da dette vil fjerne eventuelle partikler, og kan bidra til å redusere bakgrunnen.
- For det preimmune serum-kontroller, tilsett et ekvivalent mengde av preimmune serum (til den samme endelige fortynning). Hvis ingen preimmune serum er tilgjengelig, tilsett tilsvarende volum av Neurobasal medium eller PBS (ingen primære antistoffkontroll). Alternativt, hvis en passende primære antistoff er tilgjengelig som gjenkjenner intracellulær region / s av proteinet, dette antistoff kan bli tilsatt til en kontroll brønnen for å teste spesifisiteten av overflatefarging.
- Retur cellene til kultur-inkubator i 1-4 timer (dette inkubasjonsperiode kan bestemmes empirisk). I vår experiments, antistoffet var til stede under hele perioden, selv om det eksperimentelle design kan omfatte en puls med antistoffet, etterfulgt av en ytterligere inkubasjonsperiode etter utvasking (en puls-chase eksperimenter) for å vurdere tidsforløpet for internalisering.
Valgfritt trinn: Denne inkubasjon kan utføres ved romtemperatur eller til og med på is for å redusere frekvensen av basal protein internalisering, om nødvendig. Hvis det utføres i en ikke-CO 2 kontrollert miljø, bør mediet endres til en som ikke bikarbonat-bufret før tilsetning av antistoff / antiserum. FORSIKTIG: Eldre nevroner kulturer (> 14 dager, og spesielt dyrkede mus embryonale nevroner) ikke tåler fulle mellom endringer også.
- Vi har benyttet inkubasjonstider for denne primære antistoff internalise trinn av 1 time, 2 timer og 4 timer med gode resultater, selv om den optimale tid vil være avhengig av mengde av proteinet av interesse, så vel som dynamikken i protein handel i cells under studien.
MERK: dual-fargebilder som vises i Representative resultater ble oppnådd med en inkubasjonstid på en time ved 37 ° C i en vev kultur inkubator. - Etter inkubasjon i den ønskede periode, aspirere av antistoff-inneholdende medium. Vask brønnene forsiktig, men hurtig en gang med PBS ved romtemperatur.
Tre. Sekundær Antistoff Søknad til Faste, Unpermeabilized Cells
- Fix nevroner med 4% paraformaldehyde i fosfatbuffer pH 7,2, 5 min ved romtemperatur Merk: For best resultat, bruk nylaget fiksativ, alternativt bruke fix som har blitt lagret ved -20 ° C og helt tint slik at ingen utfelt paraformaldehyde er tydelig . FORSIKTIG: Paraformaldehyde fiksativ bør utarbeides og håndteres i et avtrekksskap.
- Fjern fix fra brønner (overføre til flytende avfallsbeholder i avtrekksskap) og skyll 3x med PBS.
- VALGFRITT TRINN: Hvis ønskelig, for å spare på antistoffreagenser, Dekk kanfjernes forsiktig fra den 12-brønns plate med pinsett og plassert cellesiden opp, på et ark av Parafilm lagt på bunnen av en engangs-kulturplate.
- Løsninger kan deretter pipetteres forsiktig ned på dekkglass, slik at de er fullstendig dekket uten oppløsningen flom over kanten av dekkglass på Parafilm.
- Denne teknikken er egnet for kortvarige inkubasjoner (1-2 t) er imidlertid lengre inkubasjoner (for eksempel over natten) bør utføres i et fuktet kammer. Alternativt kan dekkglass plasseres tilbake i brønnene til 12-brønners plate for inkubering over natten, og tilstrekkelig volum bør tilsettes for å sikre at dekk ikke tørker ut.
- Blokk i 30 minutter ved romtemperatur med 5% BSA i PBS (Note: Ikke i vaskemiddel til den blokkerende løsning på dette stadium da det er viktig at cellene ikke blir permeabilized).
- For å merke overflateprotein før du fortsetter med deteksjonsjon av internalisert protein, gjelder den første fluorescensmerkede 2 ° antistoff av valget.
Merk: I det eksempel som er beskrevet her, var det primære antiserum dannet i kanin (in-house-antistoff) til et rekombinant utskilt isoform 4.. Således, for den første sekundære antistoffet til å gjenkjenne det ekstracellulære området av transmembran-isoformen på overflaten av unpermeabilized nevroner, har vi brukt esel anti-kanin Dylight 649 (1/200 fortynnet i PBS inneholdende 5% BSA). Det anbefales å sentrifuger utvannet sekundær antistoff løsninger (10 min, 13 000 xg, RT) før bruk. - Inkuber Dekk for to timer ved romtemperatur.
- Vask Dekk (i brønner), 2x 5 min med PBS.
4. Blokkering med Excess Umerket 2 ° Antistoff
- Blokker unpermeabilized nerveceller med en høy konsentrasjon (> 0,1 mg / ml) av umerket 2 ° antistoff.
- Den umerkede 2 ° antistoff bør heves mot arter hvordet primære antistoff ble hevet (i dette tilfellet kanin) ved inkubering over natten ved romtemperatur.
- For denne protokollen, ble AffiniPure F ab fragment geit anti-kanin IgG (H + L) anvendt ved en konsentrasjon på 0,13 mg / ml.
MERK: inkubering over natten ble funnet å være viktig som en kortere inkubasjonstid (2 timer) var utilstrekkelig for fullstendig blokkering av primært antistoff som ikke var fullt ut bundet av merket sekundært antistoff.
- Vask Dekk (i brønner), 2x 5 min med PBS.
- Etter at denne blokkerende trinnet, etter fikser cellene med 4% paraformaldehyd i fosfatbuffer pH 7,2, i 5 min ved romtemperatur. Rens med PBS (2x) etter fjerning av fikseringsmiddel (transfer fikseringsmiddel til flytende avfallsbeholderen i avtrekksskap).
5. Permeabilization og anvendelse av den andre fluorescensmerkede Konjugert 2 ° Antistoff
- Permeabilize og blokkere cellene med 5% BSA i PBS inneholdende 0,1% Triton-X-100 ved romtemperatur temperatur for 30 min.
- Fjern blokkering løsningen (som tar vare på at Dekk ikke tørker ut). Tilsett andre fluorescensmerket-konjugert 2 ° antistoff merket med et annet fluorofor.
- MERK: Det må være mulig å skille denne fluoroforen tag fra ett tidligere brukt, avhengig av de tilgjengelige eksitasjon / utslipps filtre på konfokalmikroskop (se nedenfor).
- For eksemplet som presenteres i denne protokollen, ble en Alexa Fluor 488-konjugert esel-anti-kanin-antistoff 2 ° benyttes (1/200 i PBS, 5% BSA og 0,1% Triton-X-100). Inkuber 2 timer ved romtemperatur og deretter fjerne 2 ° antistoff løsning.
- Vask Dekkglass 3 x 5 min med PBS og til slutt vaskes kort med avionisert vann.
6. Montering og Imaging
- Mount Dekk på glassplater med en vandig montering medium som inneholder antifade (f.eks VECTASHIELD) og la tørke. Oppbevares i mørke ved 4 ° C for optimal bevaring av fluorescerende signal intensitet.
- Bilde immunostained celler på en konfokalmikroskop.
- Egnede eksitasjons-og emisjonsfiltre for påvisning av de to fluoroforen signalene må være tilgjengelig.
- Hvis ulike eksperimentelle forhold er å bli sammenlignet (for eksempel internalise priser under depolariserte 8,9 eller kontroll forhold), sikre at alle replikere Dekk fra de ulike forholdene er bilde av med de samme bildeinnhentingsparametere. Den integrerte tetthet av standard regioner av interesse eller puncta attributter (for eksempel antall, størrelse) fra de resulterende bildene kan deretter måles ved hjelp av standard programvare for bildeanalyse (f.eks Fiji / ImageJ, Metamorph).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tofargede fluorescent farging teknikk som presenteres her er nyttig for merking av ekstracellulære domener av transmembrane proteiner i levende celler (vist skjematisk i figur 1). I løpet av inkubasjonsperioden, immunoglobulinene binde tilgjengelige epitoper og en andel av befolkningen av proteinmolekyler, sammen med bundet antistoff, blir endocytosed. I tillegg kan det nylig syntetiserte proteiner når celleoverflaten via forover-handel og resirkulerte proteinmolekyler kan returneres til plasmamembranen 10..
Denne metoden er optimalisert for deteksjon av to forskjellige protein bassenger, celle-overflate og internaliseres ved hjelp av den samme primære antistoff som er spesifikt for proteinet som studeres. Ved å anvende en fluorescerende merket sekundært antistoff i faste celler før permeabilization, kan proteinet lokalisert på celleoverflaten ved fiksering skal detekteres. Innlemmelsen av en thorgrundige blokkerer trinnet å forby enhver binding av gjenværende protein-primære antistoff overflatekompleksene som ikke er bundet av den første sekundære antistoff kan den etterfølgende deteksjon (med sekundært antistoff konjugert til et annet fluorofor) av protein-antistoff-komplekser som ble endocytosed under inkuberingen periode (figur 1).
Representative bilder av den dual-fargemerking oppnådd med denne metoden er vist i figur 2.. Inkorporering av en blokkerende trinn av lang varighet (inkubering over natten) med den aktuelle umerket sekundært antistoff, rettet mot metningsbinding av eventuelle gjenværende overflate protein / primære antistoffkomplekser, viste seg å være avgjørende for suksess for denne tilnærming. Effektiviteten av denne blokkerende trinnet med umerket sekundært antistoff før permeabilization er demonstrert ved fravær av dobbelt-farget puncta (med unntak av den lille celle merket med et pilhodesom oppviser karakteristiske morfologi en døende celler, vises avrundet opp og kondenseres, Fig. 2). Optimalisering av forholdene og kombinasjoner for de to merkede sekundære antistoff kan være nødvendig, og den ikke-primære antistoff tilstanden er en viktig kontroll. Under arbeidet opp denne protokoll har vi funnet at det ikke var mulig å fullstendig blokkere spesifikk binding av visse merkede sekundære antistoffer, spesielt med blokkerende perioder som er kortere enn den over natten inkubering beskrevet her.
Eksempler på ensfarget merking av internalisert protein i dyrkede nerveceller (figur 3) markere den karakteristiske punctate flekker mønster av protein i endosomal rommet 10,11. For å bekrefte at protein internalisert i løpet av antistoff-fôring inkubasjon og vise punctate farging ble lokalisert i endosomes, nevroner uttrykker en tidlig / resirkulering endosome markør (transferrin-mCherry; TfR-MCH) 12 ble immunostained etter permeabilization. Den omfattende overlapping av de punktformet farging med TfR-MCH uttrykk er vist på figur 4..
Figur 1. Skjematisk viser dual-farge merking av celle-overflate og internalisert proteiner etter antistoff fôring av levende dyrkede nerveceller. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. LaBeling av celle-overflateprotein (cyan, EXT) og internalisert protein (grønn; INT). på en kultivert rotte hippocampus nevron sammen med det sammenslåtte bildet (Merge) Double farging (pilspiss) ble kun observert i en celle som var tilsynelatende usunn. Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Høyere makt visning av én farge (internalisert protein) farging viser typiske punctate mønster av endocytosed proteiner Scale. Bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 4 En region av dendrittiske arbor av et nevron uttrykker et fluoriserende fargestoff for resirkulering endosome (et uttrykk konstruere for en transferrin reseptor-mCherry fusjonsprotein, TfR-MCH, ble tilført ved hjelp Lipofectamine 2000 [Invitrogen] i henhold til produsentens instruksjoner. ). Dagen etter transfeksjon, nevronene ble farget (etter permeabilization) for endocytosed protein (kandidat reseptor), som viser overlapping med resirkulering endosome rommet. Scale bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikken som beskrives her er komplementær til den av celle-overflate biotinylering (gjennomgått av Arancibia-Carcamo et al.) 12 og det er den foretrukne metode for å bevare informasjon om de subcellulære lokalisering av internalisert protein, forutsatt at et egnet primært antistoff til en ekstracellulære epitop er tilgjengelig. I tillegg kan kvantifisering av protein handel / internalisering over tid utføres (ved å feste dekkglass på forskjellige tidspunkter i løpet av levende celle inkubasjon med primært antistoff) uten behov for å forberede proteinekstrakter.
Fargeintensitet eller antall og størrelse av puncta i regioner av interesse (for eksempel de apikale regioner av pyramide neuronal somata eller den proksimale apikal dendrite på en fast avstand fra soma) kan i confocal bilder bli målt og sammenlignet under forskjellige betingelser (f.eks , stimulert versus basalnivåer 8,9). Internalisert reseptor signal intensitet kan så normalisert til den av overflatereseptorer. Alternativt kan teknikk tilpasses for kvantifisering av reseptoren resirkulering tilbake til celleoverflaten gjennom inkludering av en strippetrinnet for å fjerne gjenværende antistoff på celleoverflaten, etterfulgt av en inkubasjon for å tillate tidligere er internalisert, antistoff-bundet protein for å returnere til flate 13..
Ved hjelp av denne metoden, var vi i stand til å bekrefte at Sez6, den antatte membran reseptoren av interesse, når og er lokalisert på celleoverflaten i nevroner. Dermed lyktes denne teknikken der mer vanlig brukte immunfluorescens eller immunoelectron mikroskopi (pre-embedding immungull) protokoller tidligere hadde mislyktes. Til tross forutsigelser basert på den primære aminosyre-sekvens for dette protein, hadde definitive bevis på dets nærvær på celleoverflaten vært vanskelig å oppnå. Proteinet vi oppdaget på overflaten av nonpermeabilized celler var lett synlig som skillett puncta inneha tilsvarende egenskaper til de tilstedeværende intracellulært i de somatodendritic og aksonale avdelinger. En mulig forklaring på denne overflaten punctate farging er at binding av antistoff kan stimulere internalisering, og derfor muliggjøre deteksjon av samlet last i begynnende clathrin belagte groper 14. Overlappingen av flekker mønster av internalisert protein puncta med at av de tidlige / resirkulering endosome reporter TfR-mCherry gir indirekte støtte til dette konseptet. I tillegg har vi bevis (upublisert) at en del av proteinet er til stede i lipid flåter som også står for dens gruppert fordeling på overflaten.
Mens vi har fokusert vår oppmerksomhet på nerveceller i den aktuelle protokollen, observerte vi bevis for opptak av immunoreactive protein (sannsynligvis til å representere de skilles ut og / eller kløyvde versjoner av protein) i gliacellene morfologisk likner astrocytes. Dette funnet er av interest, for det første fordi det indikerer at fremgangsmåten kan tilpasses for studiet av den parakrine effekter av utskilte faktorer (for eksempel i cocultures) og for det andre fordi det innebærer at metoden vil være anvendbar på andre celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Teele Palumaa for å få hjelp med tallene. Finansiert av Project Grant 1008046 fra National Health and Medical Research Council, Australia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| Fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| Uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm Round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC - handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen - Molecular Probes | A21206 |
References
- Lewis, T. L. Jr, Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
- von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
- Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
- Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
- Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
- Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).
- Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
- Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
- Kennedy, M. J. &, Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
- Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
- Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. Kittler, J. T., Moss, S. J. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).
- Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
- Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).
