Summary
Vi beskriver en metod för att märka proteiner på ytan av levande neuroner med användning av en specifik polyklonal antikropp mot extracellulära epitoper. Protein bundet av antikroppen på cellytan och därefter intern via endocytos kan särskiljas från protein som återstår på eller trafikerade till, ytan under inkuberingen.
Abstract
För att demonstrera den cellyte-lokalisering av en förmodad transmembranreceptor i odlade neuroner, vi märkt protein på ytan av levande neuroner med en specifik primär antikropp som tagits fram mot en extracellulär del av proteinet. Med tanke på att receptorerna är trafikerade till och från ytan, om cellerna permeabiliserades efter fixering då både cellytan och den inre protein kommer att detekteras av samma märkt sekundär antikropp. Här anpassade vi en metod som används för att studera protein trafficking ("antikropp matning") för att differentiellt etikett proteinet som hade blivit internaliseras av endocytos under antikropp inkubationssteg och protein som antingen varit på cellytan eller trafikerades med ytan under denna period . Förmågan att skilja dessa två pooler av protein blev möjligt genom att införliva en övernattning blockeringssteg med hög-koncentrerad omärkt sekundär antikropp efter en initial incubation av unpermeabilized nervceller med en fluorescensmärkt sekundär antikropp. Efter blockeringssteget, permeabilisering av neuronerna som tillåts detektion av det internaliserade poolen med en fluorescerande sekundär antikropp märkt med en annan fluorofor. Med denna teknik kunde vi få viktig information om subcellulära placeringen av denna förmodade receptor, och avslöjar att det var, ja, smugglas till cellytan i nervceller. Denna teknik är allmänt tillämpbar på en rad olika celltyper och cellyteproteiner, som ger en lämplig antikropp mot en extracellulär epitop är tillgänglig.
Introduction
Vid upprättande av funktionen av nyligen identifierade proteiner, kan utredning av subcellulära lokalisering och handel av proteinet i fråga ge viktiga ledtrådar om den troliga roll / s av proteinet 1,2. Bioinformatisk analys av transcriptome av utvecklings neocortex 3 försett oss med en lista av gener som uppvisar förändrat uttryck under mushjärna corticogenesis. Vi antog då en gen knockout tillvägagångssätt för att fastställa att det protein som kodas av en av dessa gener, sez6, spelar en viktig roll i neuronutveckling. Vi observerade att beslag relaterad gen 6, eller Sez6, protein ligger i utvecklings dendriter och är också närvarande i Dendritutskotten, specialiserade strukturer på dendriter som tar emot och integrera excitatoriska signaler. Dessutom, när detta protein saknas, dendriter och retande synapser misslyckas med att bilda korrekt 4. Den troliga dominerande isoformen av proteinet har funktioner i en transmembrane-receptorn även när subcellulära fördelningen av immunolabeled proteinet undersöktes genom konfokalmikroskopi eller immunelektronmikroskopi mikroskopi de flesta, om inte alla, av signalen visades i samband med små blåsor i somatodendritisk fack med liten, eller ingen, protein märkt på plasmamembranet vid cellytan.
För att slutgiltigt visa att detta förmodade receptorn med en förutsedd stor extracellulär domän trafikeras till plasmamembranet, antog vi en live-cell tillvägagångssätt med användning av antiserum som vi hade genererat till en extracellulär del av proteinet för att märka proteinet på cellytan. Genom att kombinera detta "antikropp matning" strategi med två tillämpningar av differentiellt märkt sekundär antikropp åtskilda av en omfattande blockeringssteg och en permeabilization steg, kunde vi identifiera två olika pooler av protein utmärker sig genom att binda till fluorescerande-märkta sekundära antikroppar som bär olika fluorescerent-taggar. Därmed kunde vi urskilja protein som hade internaliseras av endocytos under antikropps inkuberingssteget från protein som antingen varit på cellytan eller blivit offer för människohandel till ytan under denna period. Med användning av denna metod har vi konstaterat att det intressanta proteinet utsätts för handel till och från cellytan i neuroner. Därför denna relativt snabb och enkel teknik visat sig vara mer informativ än traditionella immunocytokemi metoder eller pre-inbäddning immunoguld elektronmikroskopi, trots det faktum att vi använde samma polyklonalt kaninantiserum för alla dessa tekniker. Denna teknik är allmänt tillämpbar på alla transmembranprotein som en bra antikropp som igenkänner den extracellulära domänen epitoper är tillgänglig. Tekniken har tidigare använts för att studera receptor trafficking av glutamatreceptorn GluR1 subenhet 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissocierade hippocampus Neuron Kultur
- Förbered täckglas (borosilikatglas):
- Skölj i 100% etanol.
- Lufttorka under UV-bestrålning.
- Coat med poly-D-lysin (0,5 mg / ml i 0,15 M boratbuffert, över natten vid 4 ° C).
- På nästa dag (dagen för odling) tvätta 3x i PBS sedan belägga med laminin (2,5 | ig / ml, naturlig muslaminin) + 5% volym / volym värmeinaktiverat fetalt kalvserum (FCS), spädd i PBS under 2 h vid 37 ° C.
- Dissekera embryonala dag 18 (E18) råtta hippocampi och samla in PBS som innehåller kalcium och magnesium, kylda på is. OBS: alla experimentella protokoll som involverar djur godkändes av Animal etikkommitté vid University of Melbourne.
- Förbered papain och DNas I-lösningar från Papain Dissociation Kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Lägg 50 pl DNas lösning till 1 ml papain lösning.
- OBS: En gångframställs först, kan papain lösningen och DNas I-lösningar vara separat dispenserades i alikvoter (0,5 ml och 25 | il alikvoter för papain och DNas I, respektive) och lagrades vid -20 ° C tills de behövdes.
- Avlägsna så mycket PBS som möjligt och inkubera hippocampi (från en kull av embryon) med 1 ml papain / DNas I-lösning vid 37 ° C under 15-20 min. Skaka försiktigt på röret för att blanda innehållet två gånger under inkubationsperioden.
- Mal sönder hippocampus vävnaden försiktigt (undvika bubblor) med en eld-polerat silikoniserad pasteurpipett 10-15x till cellspridning uppnås och få, om några, bitar av odissocierad vävnad kvar.
- Skiktet försiktigt dissocierade cellsuspensionen över en 3 ml kudde bestående av 4% vikt / volym bovint serumalbumin (BSA) i Hanks balanserade saltlösning plus tillsatser (HBSS +, se avsnitt 1.6.1).
- Bered denna steggradient lösning genom att lösa upp BSA vid rumstemperatur utan stirring i HBSS innehållande 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO 4, 4 mM NaHCOs 3 och 40 mM glukos (HBSS +) därefter sterilt filter och förvara vid 4 ° C.
- Centrifug, 100 x g, 7 minuter i en bänkcentrifug med swing-out-rotor.
- Avlägsna supernatanten försiktigt så att inte aspirera cellpelleten.
- Omsuspendera pelleterade cellerna försiktigt med en flamma polerade (silikoniserad) pasteurpipett (eller en 1 ml blå pipettspets) i 1 ml fullständigt Neurobasal-medium (med 2% B27, 0,5 mM L-glutamin kompletterat med 1% FCS).
- Räkna två 10 l alikvoter med hjälp av en hemocytometer (OBS endast räkna fas-ljus celler som "levande" celler).
- Plate primära neuroner på preprepared belagda täckglas (0,75-1 x 10 5/18 mm täckglas i 12-brunnar). Omedelbart före plätering, aspirera överflödig laminin / serumlösning från täckglas och ersätta med primär neuron odlingsmedium (se nedan). OBS krävs numbra av täckglas måste fastställas i förväg som täck förberedelser påbörjas dagen före kultur (se steg 1.1).
- Kultur råtta primära E18 hippocampus nervceller i upp till 21 dagar in vitro (DIV) i Neurobasal medium, 2% B27, 0,5 mM L-glutamin kompletterad med 1% FCS (värmeinaktiverat). Utför en halv medelförändring vid 7 DIV och därefter varje vecka. Den anti-mitotiska fluordeoxiuridin / uridin sättes vid 7 DIV, 1/1 000 spädning av 10 mM stamlösning av varje nukleosid) för att förhindra glial överväxt.
2. Antikropp Inkubation med Live Nervceller
- Under den första veckan i kulturen, är nervceller utvecklar dendritiska hållare och med vecka 2-3, har nervceller mognat tillräckligt för att genomgå synaptogenesis 6,7.
- Vid utvalda försöks tidpunkt / s, tillämpa den primära antikroppen att triplikatbrunnar innehållande primära embryonala nervceller på täckglas. Tillsätt en mängd av antikroppen direkt till odlingsmediet avde primära neuroner till den önskade slutliga utspädning Not: I vårt exempel en kanin polyklonalt antiserum som tagits fram mot en rekombinant utsöndrad form av proteinet späddes ut 1/500 genom att tillsätta 2 ^ il till 1 ml odlingsmedium i brunn, en centrifugering under 10 min , 13.000 xg, RT kan införlivas innan man tar ett prov av antikropp som detta kommer att ta bort eventuella partiklar och kan bidra till att minska bakgrunden.
- För preimmunserum kontroller, tillsätt en ekvivalent mängd av preimmunserum (till samma slutlig utspädning). Om ingen preimmunserum är tillgänglig, till motsvarande volymen av Neurobasal medium eller PBS (ingen primär antikroppskontroll). Alternativt, om en lämplig primär antikropp är tillgänglig som känner igen intracellulära region / s av proteinet, denna antikropp kan tillsättas till en kontrollbrunn för att testa specificiteten av ytfärgning.
- Återgå cellerna till odlingsinkubator under 1-4 h (kan denna inkubationsperiod bestämmas empiriskt). I vår experiments, antikroppen var närvarande hela tiden, trots att experimentell design kan innehålla en puls av antikropp följt av ytterligare en inkubationstid efter wash-out (en puls-chase experiment) för att bedöma tidsförloppet för internalisering.
Valfritt steg: Denna inkubation kan utföras vid rumstemperatur eller till och med på is för att sänka takten för basala protein intemalisering, om nödvändigt. Om det utförs i en icke-CO2 kontrollerad miljö, bör mediet ändras till en som inte är bikarbonatbuffrad före tillsats av antikropp / antiserum. VARNING: Mogna neuron kulturer (> 14 dagar, och speciellt odlade mus embryonala nervceller) tolererar inte fullt medium ändras väl.
- Vi har använt inkubationstider för denna primära antikropp intemalisering steget av en timme, 2 timmar och 4 timmar med goda resultat, även om den optimala tiden beror på överflöd av proteinet av intresse, liksom dynamiken av protein trafficking i cells som studeras.
ANMÄRKNING: De dubbla färgbilder visas i Representativa resultat erhölls med en inkubation av 1 h vid 37 ° C i en vävnadsodlingsinkubator. - Efter inkubation under den önskade perioden, aspirera bort antikroppsinnehållande mediet. Tvätta brunnarna försiktigt men snabbt en gång med PBS vid rumstemperatur.
3. Sekundär antikropp Ansökan till fasta, Unpermeabilized celler
- Fix nervceller med 4% paraformaldehyd i fosfatbuffert pH 7,2, 5 minuter i rumstemperatur Obs: för bästa resultat, använd nygjord fixativ, alternativt använda fix som har förvarats vid -20 ° C och smält fullständigt så att ingen utfällda paraformaldehyd är uppenbart . VARNING: Paraformaldehyd fixativ bör förberedas och hanteras i ett dragskåp.
- Ta bort fix från brunnar (överföring till behållare flytande avfall i dragskåp) och skölj 3x med PBS.
- Valfritt steg: Om så önskas, för att spara på antikroppsreagens, täckglasen kannoggrant avlägsnas från 12-brunnsplatta med pincett och placerades cell-sida-upp, på ett ark av Parafilm läggs på basen av en engångs-odlingsplatta.
- Lösningar kan sedan pipetteras försiktigt på täckglas så att de är helt täckta utan lösningen översvämningar över kanten av täckglaset på Parafilm.
- Denna teknik lämpar sig för kortsiktiga inkubationer (1-2 tim) men längre inkubationer (t.ex. över natten) bör utföras i en fuktig kammare. Alternativt kan täckglasen placeras tillbaka in i brunnarna i 12-brunnsplatta för inkubering över natten och tillräcklig volym bör tilläggas för att säkerställa att täckglasen inte torkar ut.
- Block 30 min vid rumstemperatur med 5% BSA i PBS (OBS: Lägg inte till diskmedel i blockerande lösningen i detta skede eftersom det är viktigt att cellerna inte permeabilized).
- För att märka ytprotein innan du fortsätter med upptäcktning av internaliserad protein, tillämpa första fluorescerande 2 ° antikropp val.
Obs: I exemplet som beskrivs här, var den primära antiserum i kanin (in-house-antikropp) till en rekombinant utsöndrat isoform 4. Sålunda kan den första sekundära antikroppen för att detektera den extracellulära regionen av transmembran isoformen på ytan av unpermeabilized neuroner använde vi åsne-anti-kanin-Dylight 649 (1/200 utspätt i PBS innehållande 5% BSA). Det rekommenderas att centrifugera utspädda lösningar sekundär antikropp (10 min, 13.000 xg, RT) före användning. - Inkubera täckglasen i 2 h vid rumstemperatur.
- Tvätta täckglas (i brunnar), 2x 5 min med PBS.
4. Blockering med överskott av omärkt 2 ° Antibody
- Blockera unpermeabilized neuroner med en hög koncentration (> 0,1 mg / ml) av omärkt 2 °-antikropp.
- Den omärkta 2 ° antikropp bör höjas mot de arter därden primära antikroppen togs upp (i detta fall kanin) genom inkubation över natten vid rumstemperatur.
- För detta protokoll, var AffiniPure F ab-fragment get anti-kanin IgG (H + L), som används vid en koncentration av 0,13 mg / ml.
OBS: inkubation över natten befanns vara avgörande eftersom en kortare inkubationstid (2 hr) var otillräcklig för fullständig blockering av den primära antikroppen som inte var fullständigt bundet av den märkta sekundära antikroppen.
- Tvätta täckglas (i brunnar), 2x 5 min med PBS.
- Efter denna blockeringssteg, post fixera cellerna med 4% paraformaldehyd i fosfatbuffert pH 7,2, 5 min vid rumstemperatur. Skölj med PBS (2x) efter avlägsnande av fixeringsmedel (transfer fixativ till behållare för flytande avfall i dragskåp).
5. Permeabilization och tillämpning av Andra Fluorescerande konjugerad 2 ° Antibody
- Permeabilisering och blockera cellerna med 5% BSA i PBS innehållande 0,1% Triton-X-100 vid rums tempeperatur under 30 min.
- Avlägsna den blockerande lösningen (se till att täckglasen inte torkar ut). Lägg den andra fluorescerande-konjugerade 2 ° antikropp märkt med en annan fluorofor.
- OBS: Det måste vara möjligt att skilja denna fluorofor tagg från den som tidigare använts, beroende på tillgängliga excitation / emissionsfilter på konfokalmikroskop (se nedan).
- För exemplet som presenteras i detta protokoll, var en Alexa Fluor 488-konjugerad åsne-anti-kanin-2 °-antikropp som används (1/200 i PBS, 5% BSA och 0,1% Triton-X-100). Inkubera 2 timmar vid rumstemperatur sedan bort 2 ° antikroppslösningen.
- Tvätta täck 3x 5 min med PBS och slutligen tvätta kortvarigt med avjoniserat vatten.
6. Montering och bildbehandling
- Montera täckglas på objektglas med ett vattenbaserat monteringsmedium innehållande antifade (t.ex. Vectashield) och låt torka. Förvaras i mörker vid 4 ° C för opTIMAL bevarandet av fluorescerande signal intensitet.
- Image immunofärgades cellerna på ett konfokalt mikroskop.
- Lämpliga excitation och emissionsfilter för detektion av de två fluoroforenheter signalerna måste vara tillgängliga.
- Om olika experimentella förhållanden skall jämföras (t.ex. interna priser enligt depolariserade 8,9 eller kontrollförhållanden), se till att alla replikera täck från de olika villkoren är avbildas med samma bild förvärvet parametrar. Den integrerade täthet av standard regioner av intresse eller puncta attribut (t.ex. antal, storlek) från de resulterande bilderna kan sedan mätas med standard bildanalys mjukvara (t.ex. Fiji / ImageJ, metamorfa).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tvåfärgad fluorescerande immunfärgning teknik som presenteras här är användbar för märkning av extracellulära domäner av transmembranproteiner i levande celler (som visas schematiskt i figur 1). Under inkubationstiden är immunoglobuliner binder tillgängliga epitoper och en del av befolkningen av proteinmolekyler, tillsammans med bunden antikropp, är endocyteras. Dessutom kan nysyntetiserad protein når cellytan via framåt människohandel och återvunna proteinmolekyler kan återföras till plasmamembranet 10.
Denna metod har optimerats för detektionen av två distinkta proteinpooler, på cellytan och internaliseras, med användning av samma primära antikroppen som är specifik för proteinet som studeras. Genom att applicera en fluorescensmärkta sekundära antikroppen till fixerade celler före permeabilisering kan proteinet lokaliserade på cellytan vid tiden för fixering detekteras. Införlivandet av en thorgrundlig blockerar steg att förbjuda bindning av kvarvarande protein-primär antikropp ytkomplex som inte har bundna av den initiala sekundära antikroppen gör den efterföljande detektion (med sekundär antikropp konjugerad till en annan fluorofor) av protein-antikroppskomplex som endocyteras under inkubationstiden period (figur 1).
Representativa bilder av tvåfärgad märkning erhölls med denna metod visas i Figur 2. Införlivandet av en blockerande steg med lång varaktighet (över natten inkubation) med relevant omärkt sekundär antikropp, som syftar till mättnad bindning av eventuella kvarvarande yta protein / primära antikroppskomplex, visade sig vara avgörande för framgången för denna strategi. Effektiviteten i denna blockeringssteg med omärkt sekundär antikropp före permeabilisering demonstreras av frånvaron av dubbel färgades puncta (med undantag för den lilla cellen markerad med en pilspetssom uppvisar karakteristisk morfologi av en döende cell, som förekommer avrundad och kondenseras, fig. 2). Optimering av de villkor och kombinationer för de två märkta sekundära antikroppar kan vara nödvändigt och det no-primär antikropp tillstånd är en viktig kontroll. Under arbetet upp detta protokoll, fann vi att det inte var möjligt att helt blockera icke-specifik bindning av vissa märkta sekundära antikroppar, särskilt med blockerande perioder kortare än den över natten inkubation som beskrivs här.
Exempel på enfärgad märkning av internaliserade proteiner i odlade nervceller (Figur 3) markera det karakteristiska punktat färgningsmönstret av protein i endosomala utrymmet 10,11. För att bekräfta att protein intern under antikropps utfodring inkubation och visning punktat färgning lokaliserades i endosomes, nervceller som uttrycker en tidig / återvinning endosome markör (transferrin-mCherry; TfR-MCH) 12 immunofärgades efter permeabilisering. Den omfattande överlappningen av punktformig färgning med TfR-MCH expression visas i figur 4.
Figur 1. Schematisk visar tvåfärgad märkning av cellytan och internaliserade proteiner efter antikropps utfodring av levande odlade nervceller. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. LaBeling av cellytprotein (cyan, EXT) och internalis protein (grön, INT). på en odlad råtta hippocampus neuron tillsammans med den sammanslagna bilden (MERGE) Dubbel färgning (pilspets) observerades endast i en cell som var tydligen ohälsosamt. Skala bar = 10 mikrometer. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Högre makt syn på enfärgade (internaliserad protein) immunfärgning som visar typiska punktat mönster av endocyteras proteiner. Skala bar = 10 mikrometer. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. En region av den dendritiska arbor av en neuron som uttrycker en fluorescerande markör för återvinning endosomen (en expressionskonstruktion för en transferrinreceptor-mCherry fusionsprotein, TfR-MCH, transfekterades med användning av Lipofectamine 2000 [Invitrogen] enligt tillverkarens instruktioner ). Dagen efter transfektion, neuroner färgades (efter permeabilization) för endocyteras protein (kandidat receptor), som visar överlappning med återvinning endosome facket. Skala bar = 20 nm. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den teknik som beskrivs här är komplementär till den hos cellyte-biotinylering (översikt av Arancibia-Carcamo et al.) 12 och det är den metod som föredras för bevarande av information om den subcellulära lokaliseringen av det internaliserade proteinet, förutsatt att en lämplig primär antikropp till en extracellulär epitop är tillgänglig. Dessutom kan utföras kvantifiering av protein trafficking / interna med tiden (genom att fixera täckglas vid olika tidpunkter under hela levande cell inkubation med primär antikropp), utan att det är nödvändigt för att framställa proteinextrakt.
Färgning intensitet eller antal och storlek på puncta i områden av intresse (t.ex. de apikala regioner pyramidal neuronal somata eller proximala apikala Dendrite på ett visst avstånd från soma) kan i konfokala bilder mätas och jämföras under olika förhållanden (t.ex. , stimulerade kontra basala nivåer 8,9). Internaliserad receptor SIGnal intensitet kan då normaliseras till det av ytreceptorer. Alternativt kan tekniken anpassas för kvantifiering av receptor återvinning tillbaka till cellytan genom infogandet av en strippningssteg för att avlägsna kvarvarande antikroppen från cellytan, följt av en inkubering för att tillåta tidigare internaliseras, antikroppsbundna proteinet för att återgå till yta 13.
Med denna metod kunde vi bekräfta att Sez6, den förmodade membranreceptor av intresse, når och är lokaliserad på cellytan i nervceller. Alltså, denna teknik lyckats där mer vanligt förekommande immunofluorescens eller immunelektronmikroskopi mikroskopi (pre-inbäddning immunogold) protokoll hade tidigare misslyckats. Trots förutsägelser baserade på den primära aminosyrasekvensen av detta protein, hade definitiva bevis för dess närvaro vid cellytan varit svårt att få. Proteinet vi detekteras på ytan av nonpermeabilized celler var lätt synliga som åtskillnadt puncta som har liknande egenskaper till de närvarande intracellulärt i de somatodendritiska och axonal fack. En möjlig förklaring till denna yta punktat färgning är det kanske den bindning av antikroppar stimulera internalisering och därmed göra det möjligt att upptäcka klustrade last i begynnande clathrin belagda gropar 14. Överlappningen av färgningsmönstret av internaliserad protein puncta med den för tidiga / återvinning endosome reporter TfR-mCherry ger indirekt stöd till detta koncept. Dessutom har vi bevis (opublicerad) att en del av proteinet är närvarande i lipid flottar, som också står för den klustrade fördelning på ytan.
Samtidigt som vi har koncentrerat oss på nervceller i det nuvarande protokollet, observerade vi bevis för upptag av immunreaktivt protein (troligen för att representera de utsöndras och / eller kluvna versioner av proteinet) i gliaceller morfologiskt liknar astrocyter. Detta fynd är av interest, för det första eftersom det tyder på att metoden kan anpassas för att studera de parakrina effekter av utsöndrade faktorer (t.ex. i samodlingar) och för det andra, eftersom det innebär att metoden kan tillämpas på andra celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar Teele Palumaa för hjälp med figurerna. Finansierat av projektbidrag 1008046 från det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet, Australien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| Fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| Uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm Round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC - handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen - Molecular Probes | A21206 |
References
- Lewis, T. L. Jr, Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
- von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
- Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
- Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
- Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
- Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).
- Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
- Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
- Kennedy, M. J. &, Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
- Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
- Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. Kittler, J. T., Moss, S. J. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).
- Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
- Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).
