Summary
Nous décrivons un procédé pour marquer la protéine à la surface des neurones vivants en utilisant un anticorps polyclonal spécifique à des épitopes extracellulaires. Protéine liée par l'anticorps sur la surface de la cellule et ensuite internalisée par endocytose peut être distinguée de la protéine restante sur, ou à un trafic, de la surface au cours de l'incubation.
Abstract
Afin de démontrer la localisation à la surface cellulaire d'un récepteur transmembranaire putatif dans des neurones en culture, nous avons appelé la protéine sur la surface des neurones vivants avec un anticorps primaire spécifique dirigé contre une portion extracellulaire de la protéine. Étant donné que les récepteurs sont victimes de trafic vers et depuis la surface, si les cellules sont perméabilisées puis après fixation à la fois à la surface cellulaire et la protéine interne sera détecté par le même anticorps secondaire marqué. Ici, nous avons adapté une méthode utilisée pour étudier le trafic de la protéine («d'alimentation d'anticorps») de façon différentielle des protéines de l'étiquette qui a été internalisée par endocytose au cours de l'étape anticorps d'incubation et de protéines qui soit resté sur la surface de la cellule ou est d'un trafic à la surface au cours de cette période, . La capacité de distinguer ces deux groupes de protéines a été rendu possible grâce à l'incorporation d'une étape de blocage pendant la nuit avec l'anticorps secondaire non marqué très concentré après une incubatio initialen des neurones unpermeabilized avec un anticorps secondaire marqué par fluorescence. Après l'étape de blocage, la perméabilisation des neurones admis détection de la piscine internalisée avec un anticorps secondaire fluorescent marqué avec un fluorophore différent. Grâce à cette technique, nous avons pu obtenir des informations importantes sur la localisation subcellulaire de ce récepteur putatif, révélant qu'il était, en effet, de la traite à la surface cellulaire dans les neurones. Cette technique est largement applicable à toute une gamme de types de cellules et des protéines de surface cellulaire, en fournissant un anticorps approprié à un épitope extracellulaire est disponible.
Introduction
En instituant la fonction des protéines nouvellement identifiées, l'enquête de la localisation subcellulaire et le trafic de la protéine en question peut fournir des indices importants sur le rôle probable / s de 1,2 de protéine. L'analyse bioinformatique du transcriptome du néocortex développement 3 nous a fourni une liste de gènes présentant une expression altérée au cours de cerveaux de souris corticogenèse. Nous avons alors adopté une approche de coup de grâce de gène de s'assurer que la protéine codée par l'un de ces gènes, sez6, a un rôle clé dans le développement des neurones. Nous avons observé que le gène lié à la saisie-6, ou Sez6, la protéine se trouve dans les dendrites en développement et est également présent dans les épines dendritiques, des structures spécialisées sur les dendrites qui reçoivent et intègrent les signaux excitateurs. De plus, lorsque cette protéine est absente, les dendrites et les synapses excitateurs ne parviennent pas à former correctement 4. L'isoforme dominante probable de la protéine présente des caractéristiques d'un transmembranrécepteur de l'e, bien que, lors de la distribution subcellulaire de la protéine immuno-a été examinée par microscopie confocale ou par microscopie immuno plupart, sinon la totalité, du signal apparu associé à de petites vésicules dans le compartiment somato-dendritique avec peu ou pas de protéine marquée sur la membrane plasmique à la surface de la cellule.
Afin de montrer définitivement que ce récepteur putatif avec un grand domaine extracellulaire prédit est traite à la membrane plasmique, nous avons adopté une approche de cellules vivantes en utilisant l'antisérum nous avions généré à une portion extracellulaire de la protéine à marquer la protéine à la surface cellulaire. En combinant cette approche "alimentation anticorps" avec deux applications d'anticorps secondaire différentielle marqué séparées par une étape de blocage vaste et une étape de perméabilisation, nous avons pu identifier deux piscines différentes de protéines qui se distinguent par liaison à des anticorps secondaires marqués par fluorescence portant Déess différentetags Ent. Ainsi, nous avons pu distinguer protéine qui avait été intériorisé par endocytose lors de l'étape d'incubation anticorps de la protéine qui soit resté sur la surface de la cellule ou a été victimes de la traite à la surface au cours de cette période. En utilisant cette méthode, nous avons établi que la protéine d'intérêt est un trafic à destination et à partir de la surface cellulaire dans les neurones. Par conséquent, cette technique relativement rapide et simple s'est avéré plus instructif que les méthodes d'immunocytochimie traditionnels ou pré-enrobage microscopie électronique immunologique, malgré le fait que nous avons utilisé le même antisérum polyclonal de lapin pour toutes ces techniques. Cette technique est généralement applicable à n'importe quelle protéine transmembranaire a fourni une bonne anticorps reconnaissant des épitopes de domaines extracellulaires est disponible. La technique a déjà été utilisée pour étudier le trafic de récepteur du récepteur de glutamate GluR1 sous-unité 5.
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Protocol
Une. Dissociée de l'hippocampe Neuron Culture
- Préparer des lamelles de verre (borosilicate):
- Laver à l'éthanol à 100%.
- Sécher à l'air sous irradiation UV.
- Manteau de Poly-D-lysine (0,5 mg / ml dans un tampon de borate 0,15 M, pendant une nuit à 4 ° C).
- Le jour suivant (le jour de la culture), laver 3 fois dans du PBS puis enduire de la laminine (2,5 pg / ml, de la laminine de souris normal) + 5% v / v de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur (FCS) dilué dans du PBS pendant 2 h à 37 ° C.
- Disséquer embryonnaires jour 18 (E18) hippocampes de rats et de recueillir dans PBS contenant du calcium et du magnésium, refroidi sur glace. REMARQUE: tous les protocoles expérimentaux impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité d'éthique animale de l'Université de Melbourne.
- Préparer la papaïne et de solutions de DNase I de la papaïne dissociation Kit selon les instructions du fabricant.
- Ajouter la solution de 50 ul DNase I à 1 ml de solution de papaïne.
- REMARQUE: Une foisd'abord préparée, la solution de papaïne et les solutions DNase I peuvent être distribués séparément en portions aliquotes (0,5 ml et 25 uL d'aliquotes de la papaïne et de la DNase I, respectivement) et stockés à -20 ° C jusqu'à utilisation.
- Enlever autant que possible PBS et incuber hippocampe (une litière à partir d'embryons) avec 1 ml de papaïne / solution de DNase I à 37 ° C pendant 15 à 20 min. Tapotez doucement le tube pour mélanger le contenu de deux fois au cours de la période d'incubation.
- Triturer le tissu hippocampique doucement (en évitant la génération de bulles) avec une pipette Pasteur siliconée 10-15x-poli à la flamme jusqu'à ce que la dispersion de la cellule est obtenue et peu, s'il y en a, des morceaux de tissu restent non dissocié.
- Couche avec précaution la suspension cellulaire dissociée sur un coussin de 3 ml de 4% p / v de sérum albumine bovine (BSA) dans la solution de Hanks Balanced Salt plus additifs (HBSS +, voir la section 1.6.1).
- Préparer cette solution de gradient par étape en dissolvant le BSA à température ambiante sans agitationanneau dans HBSS contenant 2 mM de CaCl2, 1 mM MgSO 4, 4 mM NaHCO 3 et 40 mM de glucose (HBSS +), puis filtre stérile et conserver à 4 ° C.
- Centrifugeuse 100 xg, 7 min dans une centrifugeuse de paillasse avec un rotor swing-out.
- Retirer le surnageant en prenant soin de ne pas aspirer le culot cellulaire.
- Remettre en suspension le culot cellulaire en douceur avec une flamme poli (silicone) de pipette Pasteur (ou un bleu pointe de la pipette 1 ml) dans 1 ml de milieu Neurobasal complète (avec 2% de B27, 0,5 mM de L-glutamine supplémenté avec 1% de FCS).
- Comptez deux aliquotes de 10 ul en utilisant un hématimètre (NB seulement compter les cellules en phase de lustrage et cellules "live").
- Plate neurones primaires sur des lamelles de verre revêtues préparées à l'avance (0,75-1 x 10 5/18 mm lamelle en plaque de 12 puits). Immédiatement avant le placage, aspirer l'excès de solution de laminine / sérique de lamelles et le remplacer par un milieu de culture de neurones primaires (voir ci-dessous). NB Le n requisombre de lamelles doit être déterminé à l'avance que la préparation de la lamelle est commencée la veille de la culture (voir l'étape 1.1).
- Culture rat primaire E18 Les neurones de l'hippocampe pour jusqu'à 21 jours in vitro (DIV) en milieu Neurobasal, 2% B27, 0,5 mM de L-glutamine additionné de 1% de FCS (inactivé par la chaleur). Effectuer un changement de la moitié de moyenne à 7 DIV et hebdomadaire par la suite. L'anti-mitotique fluorodésoxyuridine / uridine est ajouté à 7 DIV; 1/1, 000 dilution de 10 mM de chaque nucléoside) pour empêcher la prolifération des cellules gliales.
2. Incubation de l'anticorps avec Live neurones
- Au cours de la première semaine de la culture, les neurones se développent tonnelles dendritiques et par semaine 2-3, les neurones ont suffisamment mûri pour être soumis à la synaptogenèse 6,7.
- Au temps expérimental points / s, appliquer l'anticorps primaire des puits en triple contenant les neurones embryonnaires primaires sur des lamelles. Ajouter une fraction aliquote de l'anticorps directement dans le milieu de culture deles neurones primaires de la dilution finale désiré Remarque: Dans notre exemple, un antisérum polyclonal de lapin dirigé contre une forme sécrétée recombinante de la protéine ont été dilués au 1/500 en ajoutant 2 ul à 1 ml de milieu de culture dans les puits, une centrifugation pendant 10 min , 13 000 xg, RT peut être incorporé avant de prendre une aliquote d'anticorps que cela va enlever toute matière particulaire et peut aider à réduire le fond.
- Pour les témoins de sérum pré-immun, ajouter une quantité équivalente de sérum pré-immun (à la même dilution finale). Si pas de sérum pré-immun est disponible, ajouter le volume équivalent de milieu Neurobasal ou PBS (pas de contrôle de l'anticorps primaire). En variante, si un anticorps primaire approprié est disponible qui reconnaît la région intracellulaire / s de la protéine, cet anticorps peut être ajouté à un contrôle de puits dans le but de tester la spécificité de la coloration de la surface.
- Remettre les cellules dans l'incubateur de culture pendant 1-4 h (cette période d'incubation peut être déterminée empiriquement). Dans notre experiments, l'anticorps était présent pendant toute la période, bien que la conception expérimentale pourrait incorporer une impulsion d'anticorps suivie d'une autre période d'incubation après lavage de départ (une expérience pulse-chase) afin d'évaluer l'évolution dans le temps de l'internalisation.
Facultatif: Cette incubation peut être réalisée à température ambiante ou même sur de la glace pour ralentir le taux basal de l'internalisation de la protéine, si nécessaire. Si elle est effectuée dans un environnement non-contrôlé de CO 2, le milieu doit être remplacé par celui qui n'est pas en mémoire tampon bicarbonate avant l'addition de l'anticorps / antisérum. ATTENTION: Les cultures de neurones matures (> 14 jours, et en particulier en culture des neurones embryonnaires de souris) ne tolèrent pas bien les changements de moyennes complets.
- Nous avons utilisé des temps d'incubation pour cette première étape de l'internalisation des anticorps de 1 h, 2 h et 4 h avec de bons résultats bien que le temps optimal dépend de l'abondance de la protéine d'intérêt ainsi que la dynamique de la traite des protéines dans la cells à l'étude.
REMARQUE: Les images à deux couleurs représentées sur résultats représentatifs ont été obtenus avec une incubation de 1 heure à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire. - Après incubation pendant la période désirée, aspirer hors du milieu contenant l'anticorps. Laver les puits en douceur mais rapidement une fois avec du PBS à température ambiante.
3. Demande d'anticorps secondaire de cellules fixes, Unpermeabilized
- Fixer les neurones avec du paraformaldéhyde 4% dans un tampon phosphate pH 7,2, 5 min à température ambiante Remarque: pour de meilleurs résultats, utilisez fixateur fraîchement préparé; également utiliser correctif qui a été stocké à -20 ° C et complètement décongelés afin que personne ne paraformaldéhyde précipité est évident . ATTENTION: fixateur Paraformaldéhyde doit être préparé et manipulé dans une hotte.
- Retirer correctif à partir de puits (transfert de conteneur de déchets liquides dans une hotte) et rincer 3 fois avec PBS.
- Facultatif: Si vous le souhaitez, pour économiser sur les réactifs d'anticorps, les lamelles peuventêtre soigneusement retirée de la plaque de 12 puits avec une pince et placé du côté de la cellule-haut, sur une feuille de Parafilm prévue sur la base d'une plaque de culture jetable.
- Les solutions peuvent alors être déposés à la pipette doucement sur les lamelles couvre-objet de sorte qu'elles soient complètement couvertes sans l'injection d'une solution sur le bord de la lamelle couvre-objet sur le Parafilm.
- Cette technique est appropriée pour des incubations à court terme (1-2 h), cependant plus incubations (par exemple la nuit) devraient être effectuées dans une chambre humidifiée. En variante, les lamelles peuvent être placés de nouveau dans les puits de la plaque à 12 puits pour l'incubation pendant une nuit et un volume suffisants doivent être ajoutés afin de s'assurer que les lamelles ne se dessèchent pas.
- Bloc pendant 30 min à température ambiante avec 5% de BSA dans du PBS (Remarque: Ne pas ajouter de détergent à la solution de blocage à ce stade, car il est important que les cellules ne sont pas perméabilisées).
- Afin de marquer la protéine de surface avant de procéder à la détectiontion de la protéine intériorisée, appliquer le premier marqué par fluorescence 2 ° anticorps de choix.
Remarque: Dans l'exemple décrit ici, l'antisérum primaire a été soulevée dans le lapin (anticorps en interne) à une isoforme sécrétée recombinante 4. Ainsi, pour le premier anticorps secondaire pour détecter la région extracellulaire de l'isoforme transmembranaire à la surface des neurones unpermeabilized, nous avons utilisé âne anti-lapin DyLight 649 (1/200 dilué dans du PBS contenant 5% de BSA). Il est recommandé de centrifuger les solutions d'anticorps secondaire dilué (10 min, 13 000 xg, RT) avant de les utiliser. - Incuber les lamelles pendant 2 h à température ambiante.
- Lavez lamelles (dans les puits), 2x 5 min avec du PBS.
4. Blocage avec excès vierge 2 ° anticorps
- Bloquer les neurones unpermeabilized avec une forte concentration (> 0,1 mg / ml) de non marqué anticorps 2 °.
- L'anticorps 2 ° sans étiquette devrait être soulevée contre l'espèce dans laquellel'anticorps primaire a été élevée (dans ce cas le lapin) par incubation pendant une nuit à température ambiante.
- Pour ce protocole, un fragment F ab AffiniPure Chèvre anti-lapin IgG (H + L) a été utilisé à une concentration de 0,13 mg / ml.
NOTE: L'incubation d'une nuit a été jugé essentiel comme une période d'incubation plus court (2 heures) était insuffisante pour permettre un blocage complet de l'anticorps primaire qui n'a pas été entièrement fixé par l'anticorps secondaire marqué.
- Lavez lamelles (dans les puits), 2x 5 min avec du PBS.
- Après cette étape de blocage, après la fixation des cellules avec du paraformaldéhyde 4% dans un tampon phosphate pH 7,2, 5 min à température ambiante. Rincer avec du PBS (2x) après élimination du fixateur (transfert fixateur de réservoir de déchets liquides dans une hotte).
5. Perméabilisation et l'application de la deuxième fluorescence conjugué 2 ° anticorps
- Et bloquer perméabiliser les cellules avec 5% de BSA dans du PBS contenant 0,1% de Triton-X-100 à la chambre temperature pendant 30 min.
- Retirer la solution de blocage (en prenant soin de ce que les lamelles ne se dessèchent pas). Ajouter la 2 ° anticorps deuxième fluorescence conjugué marqué avec un fluorophore différent.
- REMARQUE: Il doit être possible de distinguer ce tag fluorophore de celui précédemment utilisé, en fonction des filtres d'excitation / émission disponibles sur le microscope confocal (voir ci-dessous).
- Pour l'exemple présenté dans ce protocole, un Alexa Fluor 488 âne conjugué anti-lapin 2 ° anticorps a été utilisé (1/200 dans du PBS, 5% de BSA et 0,1% de Triton-X-100). Incuber 2 heures à température ambiante, puis retirer la solution d'anticorps de 2 °.
- Lavage des lamelles couvre-3x 5 min avec du PBS et, enfin, se laver rapidement à l'eau déminéralisée.
6. Montage et imagerie
- Mont lamelles couvre sur des lames de verre avec un milieu contenant de montage antifade aqueuse (par exemple Vectashield) et laisser sécher. Conserver dans l'obscurité à 4 ° C pour oppréservation de timal de l'intensité du signal fluorescent.
- Image en immunocolorée cellules sur un microscope confocal.
- Excitation et d'émission des filtres appropriés pour la détection des deux signaux de fluorophores doivent être disponibles.
- Si différentes conditions expérimentales doivent être comparés (par exemple, les taux d'internalisation de moins de 8,9 dépolarisés ou les conditions de contrôle), veiller à ce que tous reproduisent des lamelles de différentes conditions sont imagées avec les mêmes paramètres d'acquisition d'images. La densité intégrée des régions standards d'intérêt ou les attributs de punctas (nombre, taille) des images résultant peut alors être mesurée en utilisant un logiciel d'analyse d'image standard (par exemple Fidji / ImageJ, Metamorph).
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Representative Results
La technique d'immuno-coloration fluorescente bicolore présenté ici est utile pour le marquage des domaines extracellulaires des protéines transmembranaires dans des cellules vivantes (représenté schématiquement sur la figure 1). Au cours de la période d'incubation, les immunoglobulines se lient les épitopes accessibles et une proportion de la population de molécules de protéine, conjointement avec l'anticorps lié, est endocytose. En outre, la protéine nouvellement synthétisé peut atteindre la surface de la cellule par l'intermédiaire de la traite vers l'avant et des molécules de protéines recyclés peut être retourné à la membrane plasmique 10.
Ce procédé a été optimisé pour la détection de deux ensembles de protéines distinctes, la surface cellulaire et internalisé, en utilisant le même anticorps primaire spécifique de la protéine à l'étude. En appliquant un anticorps secondaire marqué par fluorescence de cellules fixées à la perméabilisation préalable, une protéine localisée à la surface cellulaire au moment de la fixation peut être détectée. L'incorporation d'un thorough étape de blocage pour interdire toute liaison du reste des complexes de surface d'anticorps de protéines primaires qui n'ont pas été liées par l'anticorps secondaire initiale permet la détection ultérieure (avec un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore différent) de complexes protéine-anticorps qui ont été endocytosés pendant l'incubation période (figure 1).
Des images représentatives de l'étiquetage à double couleur obtenue avec cette méthode sont présentés dans la figure 2. L'incorporation d'une étape de blocage de longue durée (nuit d'incubation) avec l'anticorps secondaire non marqué pertinents, visant à la liaison de tous les complexes anticorps / primaires restant de protéines de surface saturation, s'est avérée cruciale pour le succès de cette approche. Le rendement de cette étape de blocage avec un anticorps secondaire non marqué avant la perméabilisation est démontrée par l'absence de points lacrymaux double-souillé (à l'exception de la petite cellule marquée d'une flèchequi présente une morphologie caractéristique d'une cellule mourante, apparaissant arrondi et condensé; figure 2). Optimisation des conditions et des combinaisons pour les deux anticorps secondaires marqués peut être nécessaire et la condition d'anticorps non-primaire est un contrôle important. Tout en travaillant jusqu'à ce protocole, nous avons constaté que ce n'était pas possible de bloquer complètement la liaison non spécifique de certains anticorps secondaires marqués, notamment en bloquant des périodes plus courtes que la nuit d'incubation décrit ici.
Des exemples de marquage d'une seule couleur de protéines internalisées dans des neurones en culture (figure 3) mettent en évidence le modèle ponctuée de coloration caractéristique de la protéine dans le compartiment endosomal 10,11. Pour confirmer que la protéine intériorisé pendant l'incubation d'anticorps alimentation et l'affichage de la coloration ponctuée a été localisée dans les endosomes, les neurones exprimant un endosome marqueur précoce / recyclage (transferrine mCherry; TfRMCH) 12 ont été immunocoloré après perméabilisation. Le chevauchement étendue de la coloration ponctuée d'expression TfR-MCH est illustré à la figure 4.
Figure 1. Schéma montrant l'étiquetage double-couleur de la surface des cellules et des protéines internalisées après anticorps alimentation des neurones cultivés en direct. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Labeling de protéine de surface cellulaire (cyan, EXT) et la protéine intériorisé (vert, INT). sur un rat en culture de l'hippocampe neurones avec l'image fusionnée (MERGE) Double coloration (pointe de flèche) n'a été observée que dans une cellule qui était apparemment malsaine. Barre d'échelle = 10 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Vue supérieur de puissance d'une seule couleur (protéine intériorisé) immunohistochimique montrant le schéma ponctuée typique de protéines endocytose. Barre d'échelle = 10 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. Une région de l'arbre dendritique d'un neurone exprimant un marqueur fluorescent pour l'endosome de recyclage (une construction d'expression d'un récepteur de la transferrine mCherry protéine de fusion, TfR-MCH, a été transfecté en utilisant la Lipofectamine 2000 [Invitrogen] selon les instructions du fabricant ). L'jours après la transfection, les neurones ont été colorés (après perméabilisation) pour la protéine endocytose (récepteur de candidat), montrant le chevauchement avec le compartiment de recyclage endosome. Barre d'échelle = 20 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
La technique décrite ici est complémentaire de celle de la biotinylation de la surface cellulaire (passé en revue par ARANCIBIA-carcamo et al.) 12 et elle est la méthode de choix pour la conservation de l'information au sujet de la localisation subcellulaire de la protéine internalisé, pourvu d'un anticorps primaire approprié pour une épitope extracellulaire est disponible. En outre, la quantification du trafic de protéines / internalisation au fil du temps peut être effectué (en fixant des lamelles à différents moments tout au long de l'incubation de cellules vivantes avec un anticorps primaire) sans la nécessité de préparer des extraits de protéines.
Intensité ou le nombre et la taille des points lacrymaux dans les régions d'intérêt (par exemple, les régions apicales des corps cellulaires des neurones pyramidaux ou la dendrite apicale proximale à une distance déterminée du soma) en images confocales peuvent être mesurés et comparés dans des conditions différentes (coloration par exemple , stimulée par rapport aux niveaux de base 8,9). Signal du récepteur internaliséintensité nal peut alors être étalonnée par rapport à celle des récepteurs de surface. En variante, la technique peut être adaptée à la quantification des récepteurs de recyclage en arrière de la surface de la cellule par l'inclusion d'une étape de décapage pour éliminer l'anticorps qui reste à partir de la surface cellulaire suivie par une incubation pour permettre précédemment internalisé, la protéine liée à l'anticorps pour revenir à l' surface 13.
En utilisant cette méthode, nous avons été en mesure de confirmer que Sez6, le récepteur membranaire putatif d'intérêt, atteint et est localisée sur la surface cellulaire dans les neurones. Ainsi, cette technique a réussi là où immunofluorescence plus couramment utilisé ou immunomicroscopie (immunomarquage pré-enrobage) des protocoles avaient précédemment échoué. En dépit des prédictions basées sur la séquence primaire d'acides aminés de cette protéine, la preuve définitive de sa présence à la surface cellulaire a été difficile à obtenir. La protéine nous avons détecté sur la surface des cellules non perméabilisés était facilement visible comme distinctiont puncta possédant des caractéristiques similaires à celles présentes dans les compartiments intracellulaire somatodendritiques et axonales. Une explication possible de cette coloration ponctuée superficielle, c'est que la liaison de l'anticorps pourrait stimuler l'internalisation et, donc, de permettre la détection des marchandises regroupées dans des puits revêtus de clathrine 14 naissantes. Le chevauchement du motif de coloration de intériorisée puncta de protéine avec celle du début recyclage endosome / journaliste TfR-mCherry apporte un soutien indirect à ce concept. En outre, nous avons des preuves (non publié) qu'une partie de la protéine est présente dans des radeaux lipidiques qui représente aussi pour sa distribution en cluster sur la surface.
Alors que nous avons concentré notre attention sur les neurones dans le protocole actuel, nous avons observé des preuves de l'absorption de protéine immunoréactive (susceptibles de représenter les versions sécrétées et / ou clivées de la protéine) dans les cellules gliales astrocytes morphologiquement ressemblants. Cette constatation est d'interest, d'abord parce qu'elle indique que la méthode peut être adaptée pour l'étude des effets paracrines des facteurs sécrétés (par exemple, en co-cultures) et, d'autre part, parce qu'elle implique que la méthode sera applicable à d'autres types de cellules.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Teele Palumaa d'assistance avec les chiffres. Financé par le projet Grant 1008046 du Conseil de recherches médicales, en Australie Santé nationale et du.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| Fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| Uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm Round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC - handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen - Molecular Probes | A21206 |
References
- Lewis, T. L. Jr, Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
- von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
- Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
- Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
- Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
- Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).
- Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
- Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
- Kennedy, M. J. &, Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
- Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
- Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. Kittler, J. T., Moss, S. J. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).
- Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
- Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).
