Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים

Published: February 12, 2014 doi: 10.3791/51139
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים שיטה לתייג חלבון על פני השטח של תאי עצב חיים באמצעות נוגדן polyclonal ספציפי לאפיטופים תאיים. החלבון קשור בנוגדן על פני התא, ולאחר מכן הפנים באמצעות אנדוציטוזה ניתן להבחין בין החלבון שנותר ב, או נסחרים ל, את פני השטח במהלך הדגירה.

Abstract

על מנת להדגים את הלוקליזציה של הקולטן הטרנסממברני המשוערת בנוירונים בתרבית על פני קרום התא, שכינינו את החלבון על פני השטח של תאי עצב חיים עם נוגדן ראשוני ספציפי שהועלה נגד חלק תאי של החלבון. בהתחשב בכך שקולטנים נסחרים ולמפני השטח, אם תאי permeabilized לאחר קיבוע אז גם על פני קרום התא והחלבון פנימי יזוהו על ידי אותו נוגדנים משני שכותרתו. כאן, אנו מותאמים שיטה המשמשת ללימודי סחר בחלבון ("האכלת נוגדן") לדיפרנציאלי חלבון תווית שהופנם על ידי אנדוציטוזה במהלך שלב הדגירה נוגדנים והחלבונים שגם נשאר על פני התא או נסחר אל פני השטח בתקופה זו . היכולת להבחין בין שתי בריכות של חלבון אלה התאפשרה באמצעות השילוב של צעד חסימת לילה עם נוגדנים משני ללא תווית מרוכזת מאוד לאחר אינקובטורים ראשונייםn של נוירונים unpermeabilized עם נוגדנים משני fluorescently שכותרתו. לאחר חסימת הצעד, permeabilization של נוירונים אפשרו זיהוי של הבריכה הפנימה עם נוגדנים משני ניאון שכותרתו עם fluorophore שונה. השימוש בטכניקה זו היינו יכול לקבל מידע חשוב על מיקום subcellular של קולטן המשוערת זו, חושף כי זה היה, אכן, נסחרים לעל פני קרום התא בתאי עצב. טכניקה זו היא החלים רחבה למגוון של סוגי תאים וחלבונים על פני קרום התא, מתן נוגדן מתאים לאנטיגן תאי הוא זמין.

Introduction

בהקמת הפונקציה של חלבונים שזוהו לאחרונה, חקירה של הלוקליזציה וסחר subcellular של החלבון מדובר יכולה לספק רמזים חשובים על התפקיד / ים הסביר של 1,2 החלבון. ניתוח bioinformatic של transcriptome של הניאוקורטקס פיתוח 3 סיפק לנו רשימה של גנים תערוכת ביטוי השתנה במהלך corticogenesis מוח עכבר. לאחר מכן, אנו אימצנו גישת נוקאאוט הגנטי כדי לוודא שהחלבון מקודד על ידי אחד מהגנים האלה, sez6, יש לו תפקיד מפתח בהתפתחות תאי עצב. אנו הבחנו כי הגן הקשור לתפיסה 6, או Sez6, החלבון ממוקם בדנדריטים פיתוח ונוכח גם בקוצים הדנדריטים, מבנים מיוחדים על דנדריטים שיקבלו ולשלב אותות מעוררים. יתר על כן, כאשר חלבון זה הוא חסר, דנדריטים וסינפסות המעוררות לא מצליחים ליצור בצורה נכונה 4. יש איזופורם הדומיננטי הסביר של חלבון תכונות של transmembranקולט דואר אם כי, כאשר חלוקת subcellular של חלבון immunolabeled נבדקה על ידי מיקרוסקופיה confocal או על ידי מיקרוסקופ immunoelectron רוב, אם לא כולם, של האות הופיעה קשור עם שלפוחיות קטנות בתא somatodendritic עם מעט, או לא, חלבון הנקרא על קרום הפלזמה על פני התא.

כדי להראות בודאות כי קולטן המשוערת זה עם תחום תאי גדול ניבא הוא נסחר קרום הפלזמה, אימצנו גישה לחיות תאים באמצעות נסיוב היינו נוצר לחלק החוץ תאי של החלבון לתייג חלבון על פני שטח התא. על ידי שילוב של גישה זו "נוגדני האכלה" עם שני יישומים של נוגדנים משני באופן דיפרנציאלי שכותרתו מופרדים על ידי צעד חסימה נרחב וצעד permeabilization, היינו יכול לזהות שתי בריכות שונות של חלבון מכובד על ידי קשירה לנוגדנים משני fluorescently שכותרתו נושאים fluoresc שונהתגיות אף אוזן גרון. לפיכך, היינו יכול להבחין חלבון שהופנם על ידי אנדוציטוזה במהלך שלב הדגירה נוגדן מחלבון כי גם נשאר על פני התא או נסחר אל פני השטח בתקופה זו. באמצעות שיטה זו, הקמנו שהחלבון של עניין הוא נסחר ומתא השטח בתאי עצב. לכן, טכניקה יחסית מהירה ופשוט זה הוכיחה יותר אינפורמטיבי יותר מאשר שיטות immunocytochemistry מסורתיות או במיקרוסקופ אלקטרונים immunogold מראש הטבעה, למרות שהשתמשנו באותו נסיוב הארנב polyclonal לכל הטכניקות הללו. טכניקה זו היא בדרך כלל החלה על כל חלבון הטרנסממברני סיפקה נוגדן טוב להכיר אפיטופים תחום תאיים הוא זמין. הטכניקה הייתה בשימוש בעבר כדי ללמוד סחר בקולטן של למקטע GluR1 קולטן הגלוטמט 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ניתק בהיפוקמפוס Neuron תרבות

  1. הכן את coverslips (זכוכית ורוסיליקט):
    1. שטוף ב100% אתנול.
    2. אוויר יבש תחת קרינת UV.
    3. מעיל עם פולי-D-ליזין (0.5 מ"ג / מיליליטר ב0.15 M חיץ borate, הלילה בשעה 4 ° C).
    4. ביום למחרת (היום של תרבות) לשטוף 3x ב PBS אז מעיל עם laminin (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר, laminin עכבר טבעי) + 5% בסרום v v / חום מומת עוברי עגל (FCS) מדולל PBS לשעה 2 ב 37 ° C.
  2. לנתח hippocampi חולדה יום 18 (E18) העוברית ולאסוף לתוך PBS המכיל סידן ומגנזיום, מקורר בקרח. הערה: כל פרוטוקולי הניסוי כרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים מאוניברסיטת מלבורן.
  3. הכן את פפאין ופתרונות DNase אני מקיט פפאין דיסוציאציה על פי הוראות היצרן.
    1. הוסף 50 μl אני DNase פתרון לפתרון מיליליטר פפאין 1.
    2. הערה: ברגעהכינו ראשון, פתרון פפאין ופתרוני DNase אני יכול להימכר בנפרד לaliquots (0.5 מיליליטר ו25 aliquots μl לפפאין ואני DNase, בהתאמה) ומאוחסנים ב -20 ° C עד צורך.
  4. להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר ודגירת hippocampi (מהמלטה אחת של עוברים) עם פפאין 1 מיליליטר / DNase אני פתרון ב37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות. בעדינות קפיצית הצינור לערבב את התוכן פעמיים בתקופת הדגירה.
  5. Triturate הרקמות בהיפוקמפוס בעדינות (הימנעות הדור של בועות) עם טפטפת 10-15x פסטר siliconized להבה מלוטשת עד פיזור תאים מתקבל וכמה, אם בכלל, נתחים של רקמת undissociated יישארו.
  6. שכבה בזהירות את ההשעיה התא ניתק מעל כרית 3 מיליליטר של 4% w / אלבומין בסרום שור v (BSA) בפתרון הנקס מלח מאוזן בתוספת תוספים (HBSS +; ראה סעיף 1.6.1).
    1. הכן פתרון הדרגתי שלב זה על ידי המסת BSA בטמפרטורת חדר ללא מערבביםטבעת בHBSS המכילה 2 מ"מ CaCl 2, 1 מ"מ MgSO 4, 4 מ"מ NaHCO 3 ו40 גלוקוז מ"מ (HBSS +) ואז סינון סטרילי ולאחסן ב 4 ° C.
  7. צנטריפוגה, 100 XG, 7 דקות בצנטריפוגה ספסל העליונה עם הרוטור את הנדנדה.
  8. הסר את supernatant נזהר שלא לשאוב את התא גלולה.
  9. Resuspend תאי pelleted בעדינות עם מלוטש להבה (siliconized) פיפטה פסטר (או קצה פיפטה כחול 1 מיליליטר) ב 1 מיליליטר בינוני Neurobasal מלא (עם 2% B27, L-גלוטמין 0.5 מ"מ בתוספת 1% FCS).
  10. לספור שני aliquots 10 μl באמצעות hemocytometer (NB רק לספור תאי שלב בהיר כמו תאים "חיים").
  11. פלייט נוירונים עיקרי על coverslips preprepared המצופה הזכוכית (.75-1 x 10 5/18 coverslip מ"מ ב12 גם צלחת). מייד לפני ציפוי, לשאוב עודף פתרון laminin / סרום מcoverslips ולהחליף עם מדיום תרבות נוירון העיקרי (ראה בהמשך). נ.ב. n הנדרשחום אדמדם של coverslips צריך להיקבע מראש כהכנת coverslip היא החלה היום לפני התרבות (ראה שלב 1.1).
  12. עכברוש התרבות העיקרי E18 נוירונים בהיפוקמפוס עד 21 ימים במבחנה (DIV) במדיום Neurobasal, 2% B27, L-גלוטמין 0.5 מ"מ בתוספת 1% FCS (חום מומת). לבצע שינוי בינוני חצי שעת 7 DIV ושבועי לאחר מכן. Fluorodeoxyuridine / uridine אנטי mitotic מתווסף ב7 DIV; 1/1, 000 דילול של 10 מניית מ"מ של כל נוקלאוזידים) כדי למנוע צמיחת יתר גליה.

2. נוגדן דגירה עם Live נוירונים

  1. במהלך השבוע בתרבות הראשון, נוירונים מתפתחים סוכות הדנדריטים ועד השבוע 2-3, הנוירונים הבשילו מספיק כדי להיות עוברים 6,7 synaptogenesis.
    1. בשלב / s זמן ניסוי שנבחרה, להחיל את הנוגדן הראשוני לעותק משולש בארות המכילות נוירונים עובריים ראשוניים על coverslips. הוספת aliquot של הנוגדן ישירות לתוך מדיום התרבותנוירונים העיקרי להערת הדילול הסופית הרצויה: בדוגמא שלנו, נסיוב ארנב polyclonal הועלה נגד צורה מופרשת רקומביננטי של החלבון היה מדולל 1/500 על ידי הוספת 2 μl עד 1 מיליליטר של מדיום התרבות היטב; צנטריפוגה עבור 10 דקות , 13,000 XG, RT ניתן לשלב לפני נטילת aliquot של נוגדנים כמו זה יהיה להסיר כל חומר חלקיקים ויכול לעזור להפחית את הרקע.
    2. לפקדי סרום preimmune, להוסיף כמות שווה של סרום preimmune (לאותו דילול סופי). אם לא סרום preimmune זמין, להוסיף הנפח שווה של מדיום Neurobasal או PBS (אין שליטת נוגדן ראשונית). לחלופין, אם נוגדן ראשוני מתאים זמין שמכיר אזור תאית / s של החלבון, נוגדן זה ניתן להוסיף לפקד גם על מנת לבדוק ספציפי של צביעת פני השטח.
    3. להחזיר את התאים לתרבות החממה ל1-4 שעות (תקופת דגירה זה עשויה להיקבע באופן אמפירי). בexperimeNTS, הנוגדן היה נוכח לכל התקופה אם כי עיצוב ניסיוני יכול לשלב דופק של נוגדן ואחרי תקופה נוספת דגירה לאחר לשטוף החוצה (ניסוי דופק צ'ייס) כדי להעריך את מהלך הפנמת הזמן.
      שלב אופציונלי: דגירה זה יכול להתבצע בטמפרטורת חדר או אפילו על קרח כדי להאט את קצב הפנמת חלבון בסיסי, במידת צורך. אם מבוצע בסביבה שאינו CO 2 מבוקרת, הבינוני צריך להיות שונה לאחד שאינו ביקרבונט שנאגרו לפני תוספת של הנוגדן / נסיוב. זהירות: למבוגרים תרבויות נוירון (> 14 ימים, ונוירונים עכבר במיוחד בתרבית עוברית) לא לסבול שינויים בינוניים היטב.
  2. יש לנו בשימוש פעמים דגירה של שלב זה ראשוני נוגדן הפנמה של 1 שעות, 2 שעות, 4 שעות ועם תוצאות טובות אם כי הזמן האופטימלי יהיה תלוי בשפע של החלבון של עניין, כמו גם הדינמיקה של סחר בחלבון בcells תחת מחקר.
    הערה: התמונות כפול הצבע שמוצגים בנציג התוצאות התקבלו עם דגירה של השעה 1 ב37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת חממה.
  3. לאחר דגירה לתקופה הרצויה, לשאוב את המדיום המכיל נוגדנים. לשטוף את הבארות בעדינות אך במהירות פעם עם PBS בטמפרטורת חדר.

3. יישום שני נוגדנים לתאים קבועים, Unpermeabilized

  1. תקן את הנוירונים עם paraformaldehyde 4% בpH חיץ פוספט 7.2, 5 דקות בטמפרטורת חדר הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמשו מקבע מוכנים טרי, או לחלופין להשתמש בתיקון שכבר מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס ולגמרי מופשרים, כך שאף paraformaldehyde זירז ניכר . זהירות: מקבע Paraformaldehyde צריך להיות מוכן וטפל במנדף.
  2. הסר לתקן מבארות (העברה למכל פסולת נוזלית במנדף) ולשטוף 3x עם PBS.
    1. שלב אופציונלי: אם תרצו, כדי לחסוך בחומרים כימיים נוגדן, coverslips יכוללהסיר בזהירות מהצלחת 12 גם עם מלקחיים והניח את תא בצד למעלה, על גיליון של Parafilm הניח על הבסיס של צלחת תרבות חד פעמית.
    2. אז יכולים להיות pipetted פתרונות בעדינות על coverslips כך שהם מכוסים לגמרי בלי הצפת הפתרון מעבר לקצה coverslip לParafilm.
    3. טכניקה זו מתאימה לincubations לטווח קצר (1-2 hr) לעומת זאת כבר incubations (למשל בלילה) צריכה להתבצע בתא humidified. לחלופין, ניתן להציב את coverslips בחזרה לתוך הבארות של צלחת 12 גם לדגירת הלילה ונפח מספיק יש להוסיף על מנת להבטיח את coverslips לא יתייבש.
  3. בלוק ל30 דקות בטמפרטורת חדר עם BSA 5% ב-PBS (שים לב: אל תוסיף חומר ניקוי לפתרון החסימה בשלב זה כפי שהוא חשוב כי התאים אינם permeabilized).
  4. כדי לתייג חלבון פני השטח לפני שתמשיך עם גלאיםtion של חלבון מופנם, להחיל 2 ° הנוגדן שכותרתו הראשון fluorescently של בחירה.
    הערה: בדוגמא שתוארה כאן, נסיוב העיקרי גדל בארנב (נוגדן בתוך הבית) לאיזופורם המופרש רקומביננטי 4. כך, משני הנוגדנים הראשונים לזהות את האזור תאי של איזופורם הטרנסממברני על פני השטח של תאי עצב unpermeabilized, השתמשנו DyLight נגד ארנב חמור 649 (1/200 מדוללים PBS המכיל BSA 5%). מומלץ צנטריפוגות פתרונות מדולל נוגדנים משני (10 דקות, 13,000 XG, RT) לפני השימוש.
  5. דגירה coverslips עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר.
  6. לשטוף coverslips (בבארות), 2x 5 דקות עם PBS.

4. חסימה עם נוגדן 2 ° ללא תווית עודף

  1. חסום את הנוירונים unpermeabilized עם ריכוז גבוה (> 0.1 מ"ג / מיליליטר) של נוגדן 2 ° ללא תווית.
    1. נוגדן 2 ° ללא תווית צריך להיות מורם נגד המינים שביהנוגדן הראשוני הועלה (במקרה זה ארנב) על ידי לילה דגירה בטמפרטורת חדר.
    2. עבור פרוטוקול זה, שבר AffiniPure F ab IgG עיזים נגד ארנב (L H +) היה בשימוש בריכוז של 0.13 מ"ג / מיליליטר.
      הערה: הדגירה הלילה נמצאה כחיוני כתקופה קצרה יותר דגירה (2 שעות) לא הספיקה לחסימה של נוגדן ראשוני שלא היה קשור באופן מלא על ידי הנוגדנים משני שכותרתו מלאה.
  2. לשטוף coverslips (בבארות), 2x 5 דקות עם PBS.
  3. לאחר שלב חסימה זו, שלאחר לתקן את התאים עם paraformaldehyde 4% בpH פוספט חיץ 7.2, 5 דקות בטמפרטורת חדר. יש לשטוף עם PBS (2x) לאחר הסרת המקבע (מקבע העברה למכל פסולת נוזלית במנדף).

5. Permeabilization ויישום של הנוגדן השני fluorescently שמצומדת 2 °

  1. Permeabilize ולחסום את התאים עם BSA 5% ב-PBS מכיל 0.1% Triton-X-100 בטמפה החדרrature ל30 דקות.
  2. הסר את הפתרון לחסימה (מטפל שcoverslips לא יתייבש). מוסיף את 2 ° הנוגדן השני fluorescently מצומדות מתויג עם fluorophore שונה.
    1. הערה: זה יכול להיות אפשרי כדי להבדיל את תג fluorophore זו מזו ששמשה בעבר, בהתאם למסנני עירור / פליטה נגיש במיקרוסקופ confocal (ראה להלן).
    2. לדוגמא שהוצגה בפרוטוקול זה, נוגדני אלקסה פלואוריד חמור 488 מצומדות נגד הארנב 2 ° שימשו (1/200 ב-PBS, BSA 5% ו0.1% Triton-X-100). דגירה 2 שעות בטמפרטורת חדר ולאחר מכן להסיר את פתרון נוגדן 2 מעלות.
  3. לשטוף coverslips 3x 5 דקות עם PBS, ולבסוף, לשטוף בקצרה עם מים deionized.

6. הרכבה והדמיה

  1. הר coverslips על שקופיות זכוכית עם antifade מימיים הרכבה בינונית מכיל (למשל Vectashield) ולאפשר לו להתייבש. חנות בחושך ב C ° 4 לאופשימור timal של עוצמת אות ניאון.
  2. תמונת immunostained תאים במיקרוסקופ confocal.
    1. מסנני עירור והפליטה מתאימים לזיהוי של שני אותות fluorophore חייבים להיות זמינים.
    2. אם תנאי ניסוי שונים הם להיות בהשוואה (לדוגמא, שיעורי הפנמה תחת 8,9 או שליטת תנאי depolarized), להבטיח כי כל לשכפל coverslips מהתנאים השונים הם צילמו עם אותם הפרמטרים רכישת התמונה. הצפיפות המשולבת של אזורים סטנדרטיים של עניין או תכונות puncta (לדוגמא מספר, גודל) מהתמונות שהתקבלו לאחר מכן ניתן למדוד באמצעות תוכנת ניתוח תמונה סטנדרטית (למשל פיג'י / ImageJ, Metamorph).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

טכניקת immunostaining הניאון כפול צבע המוצגת כאן היא שימושית לתיוג תחומים תאיים של חלבונים הטרנסממברני בתאים חיים (המוצג באופן סכמטי באיור 1). במהלך תקופת הדגירה, נוגדנים נקשרים אפיטופים נגישים ושיעור האוכלוסייה של מולקולות חלבון, יחד עם נוגדן מאוגד, הוא endocytosed. בנוסף, חלבון מסונתז חדש עשוי להגיע לתא השטח באמצעות סחר בקדימה ומולקולות חלבון ממוחזרות ניתן להחזיר קרום הפלזמה 10.

שיטה זו כבר מותאמת לצורך זיהוי של שתי בריכות חלבון שונות, על פני קרום תא והפנימה, באמצעות אותו הנוגדן הראשוני ספציפי לחלבון הנחקר. על ידי יישום שני נוגדנים מתויגים fluorescently אחד לתאים קבועים לפני permeabilization, ניתן לאתר החלבון מקומי על פני קרום התא בעת הקיבוע. השילוב של Thorough חסימת צעד לאסור על כל מחייב של מתחמי משטח נוגדנים שנותרו בחלבון עיקרי שלא היה מחויב לשני הנוגדנים הראשוניים מאפשרת זיהוי שלאחר מכן (עם נוגדנים משני מצומדת לfluorophore שונה) של קומפלקסי חלבוני נוגדנים שendocytosed במהלך הדגירה תקופה (איור 1).

נציג תמונות של התיוג כפול צבע המתקבל בשיטה זו מוצגות באיור 2. השילוב של צעד חסימה של משך זמן ארוך (דגירה הלילה) עם הנוגדנים משני ללא תווית הרלוונטי, במטרת הרוויה המחייבת של כל חלבון פני השטח שנותר / מתחמי נוגדן ראשוניים, התברר כחיוני להצלחתה של גישה זו. היעילות של צעד חסימה זו עם נוגדנים משני ללא תווית לפני permeabilization באה לידי ביטוי בהעדר puncta המוכתם הכפול (למעט התא הקטן מסומן בחץאשר מציג מורפולוגיה אופיינית לתאים למות, מופיע מעוגל למעלה ומרוכז; איור 2). אופטימיזציה של התנאים ושילובים לשני נוגדנים משני שהכותרת עשויה להיות נחוצה ומצב הנוגדנים ללא העיקרי הוא שליטה חשובה. בעת שעבד את פרוטוקול זה, מצאנו כי לא ניתן היה לחסום לחלוטין ספציפי מחייב של נוגדנים מסוימים שכותרתו משנית, במיוחד עם חסימת תקופות קצרות יותר מאשר הדגירה הלילה שתוארה כאן.

דוגמאות לתיוג יחיד צבע של חלבון הפנים בנוירונים בתרבית (איור 3) להדגיש את הדפוס מכתים punctate האופיינית של חלבון בתא endosomal 10,11. כדי לאשר את החלבון שהפנים במהלך הדגירה האכלה-הנוגדן מכתים punctate מוצגות היה מקומי בendosomes, נוירונים להביע סמן מוקדם / מחזור endosome (transferrin-mCherry; TFR-MCH) 12 היו immunostained לאחר permeabilization. החפיפה הנרחבת של כתמי punctate עם ביטוי TFR-MCH מוצגת באיור 4.

איור 1
איור 1. סכמטי המציג את התיוג כפול צבע על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן של נוירונים בתרבית חיים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. לה beling חלבון על פני קרום התא (ציאן; EXT) של חלבון והפנים (ירוק; INT). בנוירון בתרבית בהיפוקמפוס חולדה יחד עם התמונה הממוזגת (מיזוג) מכתים זוגי (ראש חץ) נצפה רק בתא שהיה בריא לכאורה. בקנה מידה בר = 10 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. כוח מבט גבוה יותר של צבע יחיד (חלבון הפנים) immunostaining מראה את דפוס punctate הטיפוסי של חלבוני endocytosed. Scale בר = 10 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

הין-page = "תמיד"> איור 4
איור 4. אזור של סוכת הדנדריטים של נוירון להביע סמן פלואורסצנטי לendosome המיחזור (לבנות את ביטוי של חלבון transferrin receptor-mCherry היתוך, TFR-MCH, היה transfected באמצעות Lipofectamine 2000 [Invitrogen] על פי הוראות היצרן ). היום לאחר transfection, תאי עצב היו מוכתמים (לאחר permeabilization) לחלבון endocytosed (קולטן מועמד), מראה חפיפה עם תא endosome המיחזור. בר = 20 מיקרומטר קנה המידה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הטכניקה המתוארת כאן היא משלימה לזו של biotinylation על פני קרום התא (נסקר על ידי Arancibia-Càrcamo et al.) 12 וזה שיטת בחירה של שמירת מידע על לוקליזציה subcellular של החלבון הפנים, ובלבד נוגדן ראשוני מתאים ל epitope תאי הוא זמין. בנוסף, לכמת את סחר חלבון / הפנמה לאורך זמן יכול להתבצע (על ידי תיקון coverslips בזמנים שונים במהלך הדגירה התא החי עם נוגדן ראשוני) ללא הצורך להכין תמציות חלבון.

מכתים את עוצמת או מספר והגודל של puncta באזורים של עניין (לדוגמא, אזורי הקודקוד של הפירמידה somata העצבי או דנדריט הפסגה הפרוקסימלי במרחק קבוע מסומה) בתמונות confocal ניתן למדוד והשוואה בתנאים שונים (לדוגמא , מגורה לעומת רמות בסיס 8,9). sig קולט הפניםעוצמת nal עשויה אז להיות מנורמל לזה של קולטנים על פני שטח. לחלופין, הטכניקה יכולה להיות מותאמת לכימות של קולט המיחזור חזרה לתא השטח באמצעות הכללת צעד הפשטה להסיר נוגדנים שנותרו מתא השטח ואחריו דגירה כדי לאפשר לחלבון הפנים בעבר, בכריכת נוגדן כדי לחזור משטח 13.

באמצעות שיטה זו, היינו יכול לאשר כי Sez6, קולט הקרום המשוער של עניין, מגיע והוא מקומי על פני קרום התא בתאי עצב. לכן, טכניקה זו הצליחה במקום בו פרוטוקולים (immunogold מראש הטבעה-) immunofluorescence יותר נפוץ בשימוש או במיקרוסקופ immunoelectron נכשלו בעבר. למרות תחזיות המבוססות על רצף חומצות אמינו העיקרי של חלבון זה, ראיות מוחלטות של נוכחותה בתא השטח היו קשה להשיג. החלבון שזיהינו על פני השטח של תאי nonpermeabilized היה בקלות גלוי כdistincpuncta לא בעל מאפיינים דומים לאלו בהווה intracellularly בתאי somatodendritic ועצב. הסבר אפשרי להכתמת punctate משטח הזה הוא שהכריכה של נוגדנים עלולה לעורר הפנמה, ולכן מאפשרת זיהוי של מטענים התקבצו בבורות clathrin מצופים המתהוות 14. החפיפה של דפוס צביעת puncta חלבון המופנם עם זה של הכתב / endosome מחזור מוקדם TFR-mCherry מעניקה תמיכה עקיפה למושג הזה. בנוסף, יש לנו ראיות (לא פורסם), כי חלקם של החלבון נמצא ברפסודות שומנים בדם אשר בחשבון גם את חלוקת אשכולות שלה על פני השטח.

אמנם יש לנו מיקדנו את תשומת לבנו על נוירונים בפרוטוקול הנוכחי, אנו נצפו עדות לספיגה של חלבון immunoreactive (עשוי לייצג את הגרסאות המופרשים ו / או ביקע של החלבון) בתאי גליה האסטרוציטים מורפולוגית דומים ל. ממצא זה של interest, ראשית משום שהיא מצביעה על כך שהשיטה עשויה להיות מותאמת לחקר ההשפעות אוטוקריני גורמים מופרשים (לדוגמא, בcocultures), ושנית, כי זה מרמז על כך שהשיטה תהיה ישימה לסוגי תאים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים Teele Palumaa לסיוע עם הדמויות. פרויקט ממומן על ידי מענק מ1008046 הבריאות הלאומית מועצה למחקר רפואית, אוסטרליה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS with Ca and Mg Invitrogen 14040182
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049
B27 supplement Invitrogen 17504-044
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation PDS
Bovine Serum Albumin  Sigma Aldrich Australia A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red Invitrogen (Gibco) 14175-079
Poly-D-Lysine Sigma Aldrich Australia P0899
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015 Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone Thermo Fisher
Fluorodeoxyuridine Sigma Aldrich Australia F0503
Uridine Sigma Aldrich Australia U3003
18 mm Round glass coverslips Menzel Gläser CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium Vector Laboratories H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649  Jackson ImmunoResearch Laboratories 711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-007-003
Paraformaldehyde Sigma Aldrich Australia P6148 TOXIC - handle in fume hood
Triton-X-100 Sigma Aldrich Australia T8787
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody Invitrogen - Molecular Probes A21206

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, T. L. Jr, Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
  2. von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
  3. Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
  4. Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
  5. Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
  6. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  7. Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).
  8. Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
  9. Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
  10. Kennedy, M. J. &, Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
  11. Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
  12. Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. Kittler, J. T., Moss, S. J. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).
  13. Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
  14. Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).

Tags

Neuroscience גיליון 84 immunocytochemistry הקרינה בשני צבעים סחר אנדוציטוזה endosome מחזור נוירונים
תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carrodus, N. L., Teng, K. S. L.,More

Carrodus, N. L., Teng, K. S. L., Munro, K. M., Kennedy, M. J., Gunnersen, J. M. Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons. J. Vis. Exp. (84), e51139, doi:10.3791/51139 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter