Summary
Мы опишем способ маркировать белка на поверхности живых нейронов использованием конкретного поликлональные антитела к эпитопам внеклеточных. Белок связаны антитела на поверхности клеток и впоследствии усвоены через эндоцитоз можно отличить от оставшихся на белок, или продают в, поверхности во время инкубации.
Abstract
Для того чтобы продемонстрировать клеточной поверхности локализацию предполагаемого рецептора трансмембранного в культивируемых нейронах, мы меченый белок на поверхности живых нейронов с конкретным первичного антитела против повышенной внеклеточной части белка. Учитывая, что рецепторы продают в и от поверхности, если клетки проницаемыми после фиксации затем оба клеточной поверхности и внутренний белок будет обнаружен тот же меченого вторичного антитела. Здесь мы адаптирован метод, используемый для изучения оборота белка ("кормления антитело") дифференциально метки белок, который был усвоен эндоцитоза во время стадии инкубации антитело и белка, которые либо остались на поверхности клетки или был предметом торговли на поверхность в течение этого периода . Способность различать эти два пула белка стало возможным благодаря включению ночного шага блокирующего с высококонцентрированных немеченного вторичным антителом после начального incubatioп unpermeabilized нейронов с флуоресцентно-меченого вторичного антитела. После стадии блокирования проницаемости нейронов разрешенных обнаружение интернализованной бассейн с флуоресцентным вторичным антителом, меченным другом флуорофора. Используя эту технику, мы смогли получить важную информацию о внутриклеточной локализации этого предполагаемого рецептора, показывая, что это было, действительно, продаются в поверхности клетки в нейронах. Эта методика широко применимы к ряду типов клеток и белков клеточной поверхности, обеспечивая соответствующее антитело с внеклеточным эпитопом доступен.
Introduction
При установлении функцию недавно идентифицированных белков, исследование субклеточном локализации и торговли белка в вопрос может дать важную информацию о вероятной роли / с белковой 1,2. Биоинформационный анализ транскриптома развивающегося неокортекса 3 предоставил нам список генов вл ющие экспрессию во время мыши мозга corticogenesis. Мы тогда приняли ген нокаут подход констатировать, что белок, кодируемый одной из этих генов, sez6, играет ключевую роль в развитии нейронов. Мы наблюдали, что ген, связанных с захватом 6, или Sez6, белок находится в развивающихся дендритов и также присутствует в дендритных шипов, специализированных структур на дендритах, которые получают и интегрируют возбуждающие сигналы. Кроме того, когда этот белок отсутствует, дендриты и возбуждающих синапсов сбоев в 4 образуют. Вероятной доминирующим изоформы белка имеет черты transmembranе рецептор хотя, когда внутриклеточное распределение белка immunolabeled была исследована с помощью конфокальной микроскопии или иммуноэлектронной микроскопии большинство, если не все, из сигнала оказалось, связанный с мелких пузырьков в somatodendritic отсека с небольшим или нет, белка меченного на плазматической мембране на клеточной поверхности.
Для того, чтобы окончательно показать, что это предполагаемый рецептор с предсказанной большой внеклеточного домена продают в плазматической мембране, мы использовали подход живых клеток с использованием антисыворотки мы сгенерированный к внеклеточной части белка для обозначения белка на клеточной поверхности. Объединив эту "антитело кормления" подход с двумя приложениями дифференциально-меченого вторичного антитела, разделенных широким шагом блокирующего и шаг пермеабилизации, мы смогли выделить два различных бассейнов белка, отличающихся путем связывания с флуоресцентной меченные вторичные антитела, помеченные разными fluorescЛОР теги. Таким образом, мы смогли выделить белок, который был усвоен эндоцитоза во время стадии инкубации антитело из белка, который либо оставалась на поверхности клетки или был предметом торговли на поверхность в течение этого периода. С помощью этого метода было установлено, что белок, представляющий интерес, продают в и из клеточной поверхности в нейронах. Таким образом, это относительно быстрый и простой метод оказался более информативным, чем традиционные методы иммуноцитохимии или предварительно вложения immunogold электронной микроскопии, несмотря на то, что мы использовали ту же кролик поликлональной антисыворотки для всех этих методов. Этот метод обычно применимы к любому трансмембранного белка при условии хорошей антитело, распознающее внеклеточные эпитопы домена доступен. Метод был использован ранее для изучения торговлей рецептора рецептора глутамата GluR1 субъединицы 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Диссошиэйтед гиппокампа Нейрон Культура
- Подготовка покровные (боросиликатного стекла):
- Стирать в 100%-ном этаноле.
- Воздух сухой при УФ-облучении.
- Coat с Poly-D-лизина (0,5 мг / мл в 0,15 М боратного буфера в течение ночи при 4 ° С).
- На следующий день (день культуры) промыть 3 раза в PBS затем слой с ламинина (2,5 мкг / мл, природный мышь ламинин) + 5% объем / объем инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FCS) разводили в PBS в течение 2 ч при 37 ° С.
- Проанализируйте эмбриональных день 18 (E18) крыса гиппокампа и собирать в PBS, содержащий кальций и магний, охлажденные на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: все экспериментальные протоколы с участием животных были одобрены этическим комитетом животного из Университета Мельбурна по.
- Подготовьте папаин и решения ДНКаза I из комплекта Папаин диссоциации в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Добавить 50 мкл ДНКазы I решение до 1 мл раствора папаина.
- ПРИМЕЧАНИЕ: После того, каксначала получают раствор папаин и растворы ДНКазы I могут быть отдельно разливали в виде аликвот (0,5 мл и 25 мкл аликвоты для папаина и ДНКазой I, соответственно) и хранили при -20 ° С до использования.
- Удалить столько, насколько это возможно PBS и инкубируют гиппокампе (от одного помета эмбрионов) с 1 мл папаин / ДНКазы I растворе при 37 ° С в течение 15-20 мин. Аккуратно вылить трубку для перемешивания содержимого дважды в течение инкубационного периода.
- Растирают ткани гиппокампа нежно (избегая поколение пузырьков) с огненно-полированной силицированного пипетки Пастера 10-15х, пока дисперсия клетка не получается, и лишь немногие, если таковые имеются, куски недиссоциированной ткани остаются.
- Осторожно слой диссоциированной клеточной суспензии в течение 3 мл подушке 4% вес / об бычьего сывороточного альбумина (BSA) в сбалансированном растворе соли Хэнка плюс добавки (HBSS +, см. раздел 1.6.1).
- Подготовьте ступенчатого градиентного раствора путем растворения BSA при комнатной температуре с перемешиванием безкольцо в HBSS, содержащем 2 мМ CaCl 2, 1 мМ MgSO 4, 4 мМ NaHCO3 и 40 мМ глюкозы (HBSS +), то стерильный фильтр и хранят при температуре 4 ° С.
- Центрифуга 100 XG, 7 мин в лабораторной центрифуге с колебательного ротора.
- Удалить супернатант стараясь не аспирации осадок клеток.
- Ресуспендируют осажденные клетки осторожно пламени полированный (силиконизированный) пипетки Пастера (или 1 мл синий наконечника пипетки) в 1 мл полной Neurobasal среды (2% B27, 0,5 мМ L-глутамина с добавлением 1% FCS).
- Всего два 10 мкл аликвоты с помощью гемоцитометра (NB рассчитывать только клетки поэтапного ярко, как «живых» клеток).
- Plate первичных нейронов на preprepared покрытием покровные стекла (0.75-1 х 10 5/18 мм покровное в 12-луночный планшет). Непосредственно перед покрытием, аспирации избыточного ламинин / сыворотки раствор из покровных и заменить первичной культуре нейронов среды (см. ниже). NB требуется нхариус из покровных должна быть определена заранее, так как подготовка Покровное началась за день до культуры (см. шаг 1.1).
- Культура крыса первичной E18 нейроны гиппокампа на срок до 21 дней в пробирке (DIV) в Neurobasal среды, 2% B27, 0.5 мм L-глутамина с добавлением 1% FCS (инактивированной нагреванием). Выполните половину изменение средней в 7 DIV и неделю после него. Антимитотический fluorodeoxyuridine / уридин добавлен в DIV 7, 1/1, 000 разбавление 10 мМ исходного каждого нуклеозида), чтобы предотвратить чрезмерно быстрый рост глиальных.
2. Антитела Инкубационный с живой нейронов
- В течение первой недели в культуре, нейроны развиваются дендритные беседки и недели 2-3, нейроны созрели достаточно, переживает синаптогенеза 6,7.
- На отдельных экспериментальных момент времени / с, применить первичное антитело в тройные лунки, содержащие первичные эмбриональные нейроны на покровные. Добавить аликвоту антитела непосредственно в культуральной средепервичные нейроны до нужной конечной разбавления Примечание: В нашем примере кроличьи поликлональные антисыворотки против рекомбинантного секретируемого формы белка разводили 1/500 добавлением 2 мкл на 1 мл культуральной среды в хорошо; центрифугирование в течение 10 мин , 13000 XG, РТ могут быть включены до принятия аликвоты антитела, как это будет удалить все твердые частицы и может помочь уменьшить фон.
- Для предиммунной сыворотки управления, добавить эквивалентное количество преиммунной сывороткой (к одинаковому конечному разбавлению). Если нет неиммунную сыворотки не доступен, добавьте эквивалентный объем Neurobasal среды или PBS (без управления первичное антитело). Кроме того, если подходит первичное антитело доступно, который распознает внутриклеточную область / сек белка, это антитело может быть добавлен к элементу управления также с целью проверки специфичности окрашивания поверхности.
- Вернуться клетки в питательную инкубатор для 1-4 часов (это инкубационный период может быть определена эмпирически). В нашем experimeНТС, антитело присутствовал в течение всего периода, хотя опытно-конструкторских может включать пульс антител с последующим дальнейшим инкубационного периода после вымывания (эксперимент импульсно-погони) для оценки временной ход интернационализации.
Необязательной стадии: Эта инкубации можно проводить при комнатной температуре или даже на льду, чтобы замедлить скорость базального интернализации белка, если это необходимо. Если выполняется в не-СО 2 контролируемой среде, среда должна быть изменена, чтобы тот, который не бикарбонат буферном перед добавлением антител / антисыворотки. ВНИМАНИЕ: Зрелые нейронные культуры (> 14 дней, и в частности, культивируемые мышиных эмбриональных нейронов) не терпят полный изменения средних хорошо.
- Мы использовали времени инкубации в течение этого первичного антитела интернализации шагом 1 ч, 2 ч и 4 ч с хорошими результатами, хотя оптимальное время будет зависеть от избытка белка, представляющего интерес, а также динамика оборота белка в CELлс в стадии изучения.
Примечание: двойной цветные изображения, показанные на репрезентативные результаты были получены при инкубации в течение 1 часа при 37 ° С в инкубаторе для тканевых культур. - После инкубации в течение желаемого периода, аспирация от антител, содержащих среду. Промыть лунки осторожно, но быстро один раз ЗФР при комнатной температуре.
3. Вторичным антителом Применение к фиксированной, Unpermeabilized клеток
- Fix нейроны 4% параформальдегидом в фосфатного буфера рН 7,2, 5 мин при комнатной температуре Примечание: для достижения наилучших результатов используйте свежеприготовленный фиксатором; альтернативно использовать исправление, которая хранилась при -20 ° С и полностью размороженной, чтобы ни осажденный параформальдегиде не видно . ВНИМАНИЕ: Параформальдегид фиксатор должны быть подготовлены и обработаны в вытяжной шкаф.
- Удалить исправление из колодцев (перенос в контейнере жидких отходов в вытяжной шкаф) и промыть 3 раза с PBS.
- Необязательный шаг: При желании сэкономить на реагентов антител, покровные можетбыть тщательно удалена из 12-луночного планшета щипцами и помещали клеток стороной вверх, на листе Parafilm, установленной на основе одноразового культурального планшета.
- Растворы могут быть пипеткой осторожно на покровные так, чтобы они были полностью покрыты без раствора затопления через край покровного стекла на парафильмом.
- Этот метод подходит для краткосрочных инкубации (1-2 ч), однако больше инкубации (например, на ночь) следует проводить во влажной камере. Альтернативно, покровные может быть помещен обратно в лунки 12-луночного планшета для инкубации в течение ночи и достаточного объема должны быть добавлены для того, чтобы покровные не высыхают.
- Блок течение 30 мин при комнатной температуре с 5% БСА в PBS (Примечание: Не следует добавлять моющее средство в блокирующем растворе на этой стадии, поскольку важно, что клетки не проницаемыми).
- Для того, чтобы маркировать поверхностный белок, прежде чем приступить детекторовТион интернализованных белка, нанесите сначала дневно с надписью 2 ° антитела выбора.
Примечание: В примере, описанном здесь, первичный Антисыворотку вырос в кролика (в доме антител) к рекомбинантной секретированного изоформы 4. Таким образом, для первого вторичного антитела для выявления внеклеточной области трансмембранного изоформы на поверхности нейронов unpermeabilized мы использовали осла против кроличьего DyLight 649 (1/200 разводили в PBS, содержащего 5% бычий сывороточный альбумин). Рекомендуется центрифуге разбавленных растворов вторичными антителами (10 мин, 13 000 XG, РТ) перед использованием. - Инкубируйте покровные в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Вымойте покровные (в скважинах), 2x 5 мин с PBS.
4. Блокировка с избытка немеченого 2 ° антитела
- Блок по unpermeabilized нейроны с высокой концентрацией (> 0,1 мг / мл) немеченого 2 ° антитела.
- Немеченый 2 ° антитела должны быть подняты против видов, у которыхПервичные антитела повышали (в данном случае кролика) путем инкубации в течение ночи при комнатной температуре.
- Для этого протокола, AffiniPure F AB фрагмент козьих антител против кроличьего IgG (H + L) была использована в концентрации 0,13 мг / мл.
Примечание: инкубации в течение ночи было установлено, что важно, поскольку более короткий период инкубации (2 ч) недостаточно для полной блокировки первичного антитела, которые не были полностью связанного меченого вторичного антитела.
- Вымойте покровные (в скважинах), 2x 5 мин с PBS.
- После этой стадии блокирования после фиксации клеток с 4% параформальдегидом в фосфатном буфере с рН 7,2, 5 мин при комнатной температуре. Промыть PBS (2 раза) после удаления фиксатора (передача фиксирующего к емкости жидких отходов в вытяжной шкаф).
5. Пермеабилизации и применение антитела Во-вторых флуоресцентно Конъюгированные 2 °
- Проницаемыми и блокировать клетки с 5% БСА в PBS, содержащем 0,1% Тритон-X-100 при комнатной температура в течение 30 мин.
- Снимите блокирующий раствор (следите, чтобы покровные не высыхают). Добавьте второй флуоресцентной-сопряженную 2 ° антитела теги отдельной флуорофором.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Должна быть возможность отличить этот флуорофора тег из одного ранее использовались, в зависимости от доступных фильтров возбуждения / эмиссии на конфокальной микроскопии (см. ниже).
- Для примера, представленного в этом протоколе было использовано Alexa Fluor 488-конъюгированного осел анти-кролик 2 ° антитело (1/200 в PBS, 5% BSA и 0,1% Triton-X-100). Выдержите 2 часа при комнатной температуре, затем убрать решение 2 ° антител.
- Wash покровные 3x 5 мин с PBS и, наконец, кратко промыть деионизированной водой.
6. Монтаж и обработка изображений
- Гора покровные на стеклах с водным монтажа среде, содержащей antifade (например Vectashield) и дать высохнуть. Хранить в темном месте при температуре 4 ° С в течение опtimal сохранение интенсивности флуоресцентного сигнала.
- Изображение иммуноокрашиванию клеток на конфокальной микроскопии.
- Соответствующие возбуждения и излучения фильтры для обнаружения двух флуорофоров сигналов должны быть доступны.
- Если различные экспериментальные условия должны быть сравнены (например, интернализация ставки по деполяризованных 8,9 или контрольных условиях), убедитесь, что все повторить покровные от различных условий которые изображаются с теми же параметрами захвата изображений. Интегрированный плотность стандартных регионах, представляющих интерес или атрибутов Puncta (например, количество, размер) от полученных изображений, то можно измерить с помощью стандартного программного обеспечения для анализа изображений (например, Фиджи / ImageJ, Metamorph).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Методика флуоресцентный иммунное окрашивание двух цветов, представленные здесь полезно для маркировки внеклеточные домены трансмембранных белков в живых клетках (схематически показано на фиг.1). Во время инкубационного периода, иммуноглобулины связать доступные эпитопы и доля населения, белковых молекул, а также связанного антитела, подвергается эндоцитозу. Кроме того, вновь синтезированный белок может достигать поверхности клеток с помощью переднего торговли и переработанные белковые молекулы могут быть возвращены в плазматической мембране 10.
Этот метод был оптимизирован для обнаружения двух различных пулов белка, клеточной поверхности и интернализации, с помощью того же первичного антитела специфический белок при исследовании. Применяя один флуоресцентно меченый вторичного антитела с фиксированными клетками до проницаемости, белок локализован на клеточной поверхности в момент фиксации могут быть обнаружены. Включение в Тортельное блокировки шаг, чтобы запретить любое связывания оставшихся белковых первичной поверхности антитело, которые не были связаны начального вторичного антитела позволяет последующее обнаружение (с вторичным антителом, конъюгированным с другом флуорофора) белок-антитело, которые были эндоцитарных во время инкубации период (рис. 1).
Представитель изображения двойного цвета маркировки, полученной с помощью этого метода показаны на рисунке 2. Включение блокирующего шаг большой длительности (инкубации в течение ночи) с соответствующим немеченного вторичным антителом, направленной на насыщение связывания ни остальная поверхность белка / первичных комплексов антител, оказалось решающее значение для успеха этого подхода. Эффективность этой стадии блокирования с вторичным антителом немеченого до проницаемости свидетельствует отсутствие двойной окрашенных Puncta (за исключением небольшого клетки обозначенному стрелкойкоторый проявляет характерную морфологию умирающей клетке, появляясь округляемой и конденсируется, рисунок 2). Оптимизация условий и комбинаций двух меченых вторичных антител может быть необходимо и условие не-первичное антитело является важным контроль. Во время работы этот протокол, мы обнаружили, что это не было возможно, чтобы полностью блокировать неспецифического связывания определенных меченых вторичных антител, в частности, блокируя периоды короче инкубации в течение ночи, описанной здесь.
Примеры одноцветной маркировки интернализованной белка в культивируемых нейронов (рис. 3) выделить характерную окрашивания точечный рисунок белка в эндосомный отсека 10,11. Чтобы подтвердить, что белок интернализованную во время инкубации антител вскармливания и отображения окрашивание точечные был локализован в эндосомах, нейроны, экспрессирующие рано / утилизации эндосом маркер (трансферрин-mCherry; СКР-MCH) 12, связывающие после пермеабилизации. Обширная перекрытие точечного окрашивания выражения TfR-МЧ показано на рисунке 4.
Рисунок 1. Схематическое изображение с двойного цвета маркировки клеточной поверхности и усвоенные белки после кормления антител живых культивируемых нейронов. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. ЛяBeling из клеточной поверхности белка (голубой; EXT) и интернализованной белка (зеленый; INT). на культурно гиппокампа крысы нейрона вместе с объединенного изображения (MERGE) Двойное окрашивание (стрелка) наблюдалось только в клетке, которая была, по-видимому нездоровым. Шкала бар = 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Высшее вид сила одноцветной (интернализованной белка) иммуноокрашивания показывая типичный точечный рисунок эндоцитарных белков Масштаб. Бар = 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Область дендритов нейрона, экспрессирующих флуоресцентный маркер для эндосомы вторичной переработки (экспрессирующая конструкция для рецептора трансферрина-mCherry слитого белка, ТФР-МЧ, трансфицировали с использованием Липофектамина 2000 [Invitrogen] в соответствии с инструкциями изготовителя ). На следующий день после трансфекции, нейроны были окрашены (после пермеабилизации) для эндоцитарных белка (кандидат рецепторов), показывая перекрытие с рециркуляции эндосом отсека. Шкала бар = 20 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Техника, описанная здесь дополняет, что из клеточной поверхности биотинилирования (обзор Arancibia-Carcamo др..) 12, и это является методом выбора для сохранения информации о субклеточном локализации интернализованной белка, при условии подходящей первичное антитело к внеклеточный эпитоп доступен. Кроме того, количественное определение торговли людьми белок / интернализации в течение долгого времени может быть выполнена (с помощью фиксации покровные в разное время на протяжении всего живого инкубации клеток с первичным антителом) без необходимости подготовки белковые экстракты.
Окрашивание интенсивность или количество и размер Puncta в регионах, представляющих интерес (например, апикальные регионы пирамидальной нейронов somata или проксимального верхушечного дендрита на заданном расстоянии от сомы) в конфокальных изображений можно измерить и сравнить в различных условиях (например , стимулировали против основных уровней 8,9). Интернализованная сигнал рецептораАнал интенсивность может затем быть нормализованы, что и поверхностных рецепторов. Альтернативно, способ может быть адаптирован для количественного определения рецептора утилизации обратно к клеточной поверхности за счет включения в стадии десорбции, чтобы удалить остатки антитела от поверхности клетки с последующей инкубацией чтобы позволить ранее усвоены, белок антиген-антитело для возврата поверхность 13.
Используя этот метод, мы смогли подтвердить, что Sez6, предполагаемый мембранный рецептор интерес, достигает и локализуется на клеточной поверхности в нейронах. Таким образом, этот метод успеха там, где более часто используемых иммунофлюоресценции или иммуноэлектронной микроскопии (предварительно вложения immunogold) протоколы ранее не удалось. Несмотря на прогнозы, основанные на первичной аминокислотной последовательности этого белка, окончательных доказательств о его присутствии на поверхности клетки было трудно получить. Белок мы обнаружили на поверхности nonpermeabilized клеток была хорошо видна, как различениет Puncta обладающих сходными характеристиками присутствующим внутри клетки в somatodendritic и аксонов отсеков. Возможным объяснением этого окрашивания точечной поверхности является то, что связывание антител может стимулировать интернационализации и, следовательно, позволяют регистрировать кластерного груза в зарождающихся клатрином покрытием ямы 14. Перекрытие окрашивания рисунком интернализованных Puncta белка с тем из раннего / эндосом переработка репортера TfR-mCherry придает косвенную поддержку этой концепции. Кроме того, у нас есть доказательства (неопубликованный), что часть белка присутствует в липидного плоты, которые также обусловливает его кластерного распределения по поверхности.
В то время как мы сосредоточили наше внимание на нейроны в текущем протоколе, мы наблюдали доказательства поглощения иммунореактивной белка (вероятно, чтобы представлять, выделяемые и / или дрова версии белка) в глиальных клетках морфологически напоминающие астроцитов. Это открытие имеет Intereй, во-первых, потому что это указывает на то, что способ может быть адаптирован для изучения паракринных эффектов секретируемых факторов (например, в совместных культурах) и, во-вторых, потому что это означает, что метод будет применим к другим типам клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы благодарят Teele Palumaa за помощь в цифрах. При финансовой поддержке Проекта Грант 1008046 от национального здравоохранения и медицинских исследований Совета, Австралия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| Fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| Uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm Round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC - handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen - Molecular Probes | A21206 |
References
- Lewis, T. L. Jr, Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
- von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
- Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
- Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
- Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
- Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).
- Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
- Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
- Kennedy, M. J. &, Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
- Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
- Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. Kittler, J. T., Moss, S. J. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).
- Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
- Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).
