Overview
Chemotaxis es un proceso en el que las células u organismos se mueven en respuesta a un estímulo químico. En la naturaleza, chemotaxis es importante para organismos percibir y moverse hacia fuentes de alimento y alejarse de los estímulos que pueden ser tóxicos o perjudiciales. Quimiotaxis también es importante a nivel celular. Por ejemplo, quimiotaxis se requiere para el movimiento de los espermatozoides hacia el óvulo antes de la fertilización. En el laboratorio, quimiotaxis se examinan con frecuencia en el nematodo, C. elegans, que se conoce a migrar hacia fuentes de alimento en el suelo, pero lejos de las toxinas tales como metales pesados, sustancias con un pH bajo y detergentes. Este video muestra cómo realizar un ensayo de quimiotaxis, que incluye la preparación de las placas de quimiotaxis y los gusanos, ejecutando el análisis y análisis de los datos. A continuación, se discuten ejemplos de cómo ensayos de quimiotaxis pueden ser utilizados en C. elegans como una herramienta para entender el aprendizaje y la memoria, la adaptación olfativa y enfermedades neurológicas como el Alzheimer "enfermedad. Experimentos de quimiotaxis en C. elegans tienen cerca de ilimitadas posibilidades para aprender más sobre los mecanismos celulares y genéticos de muchos procesos biológicos y pueden conducir a una mayor comprensión de la biología humana, el desarrollo y la enfermedad.
Procedure
El movimiento de una célula u organismo como respuesta a un estímulo químico es un comportamiento llamado quimiotaxis. En este video vamos a aprender cómo realizar un ensayo de quimiotaxis utilizando el nematodo, C. elegans. También discutiremos cómo se aplican los ensayos de quimiotaxis en C. elegans para estudiar el aprendizaje y memoria, adaptación olfativa y la enfermedad de Alzheimer.
Primero hablemos de dos tipos diferentes de quimiotaxis. Movimiento hacia un estímulo químico se llama chemotaxis positivos. Por el contrario, aleja de un estímulo químico se llama quimiotactismo negativo, permitiendo que organismos alejarse de productos químicos nocivos.
Quimiotaxis pueden ocurrir a nivel del organismo, como organismos moverse hacia una fuente de alimento. Quimiotaxis también ocurre a nivel celular, dentro de los organismos. Por ejemplo, las células inmunes migrarán hacia sitios de inflamación o patógenos. En otro ejemplo, células de la esperma se mueva hacia el huevo en respuesta a un quimio-atrayente por el huevo. Chemotaxis es también un proceso importante durante el desarrollo, en el que las células migran en respuesta a un estímulo químico, formación de tejidos y órganos en el organismo en desarrollo.
Para C. elegans salvajes, habitan en el suelo, chemotaxis es importante para la detección y el movimiento hacia las bacterias, su principal fuente de alimento. En contraste, C. elegans son repelidos por los metales pesados, sustancias con un pH bajo y detergentes, que son tóxicos para el organismo.
Ensayos de quimiotaxis típicamente comienzan preparando placas de quimiotaxis. Usando una regla y un marcador, una placa de 5 cm con medio de cultivo de nematodos se dividen en cuatro cuadrantes iguales. A continuación, dibuje un círculo con un radio de 0.5 cm alrededor del centro del cuadrante. Este será el punto de partida para los gusanos. Marca y marca un punto en cada cuadrante, tal que cada punto es equidistante del centro y unos de los otros.
Preparación de gusanos para el análisis, es fundamental usar gusanos adultos jóvenes edad sincronizado para que las diferencias en la quimiotaxis no son un artefacto de la etapa de desarrollo. Una vez que los gusanos están sincronizados, Colecciónalos por primera pipetear 2 ml de tampón S-basal en un plato con adultos jóvenes. Remolino e incline el plato para limpiar los gusanos de la placa.
A continuación, pipetear la solución gusano S-basal en un tubo de microcentrífuga. Lave los gusanos por brevemente centrifugar la solución gusano S-basal, retirar el sobrenadante y agregar otro mililitro de la solución S-basal a la pelotilla de gusano. Invertir el tubo y repetir el lavado dos veces más. Después de lavar, quitar todo pero aproximadamente 100 μl de la solución S-basal. A continuación, añadir 2 μl de la mezcla de gusano S-basal a una placa NGM. Utilizando un microscopio, contar el número de gusanos presentes. Lo ideal será entre 50-250 lombrices por 2 μl de S-basal.
Ahora que las placas de quimiotaxis y los gusanos están listos, nosotros podemos empezar en el ensayo de quimiotaxis. En primer lugar, mezclar volúmenes iguales de la solución de prueba con azida de sodio de 0,5 M, un anestésico que se paraliza los gusanos una vez que lleguen a su destino. Hacer lo mismo con la solución de control. A continuación, pipetear 2 μl de mezcla de gusano S-basal en el centro de su plato de quimiotaxis. Luego, tomar con pipeta 2 μl de la solución de prueba o de control y el lugar debidamente etiquetado puntos en la placa de quimiotaxis. Una vez que han sido absorbidas las soluciones de prueba y de control, volver a colocar la tapa, invertir la placa y ajuste un temporizador de 1 hora.
Después de que los gusanos han dado una hora para responder a los estímulos químicos sobre la placa, pueden analizarse los datos. Contar manualmente el número de gusanos dentro de cada cuadrante. Si los gusanos son atraídos a la sustancia de ensayo, habrá más gusanos presentes en los cuadrantes. Si son neutrales hacia ese producto químico, gusanos estará presentes en cada cuadrante igualmente.
Utilice estos datos para calcular el índice quimiotáctico, que es el número de gusanos en los cuadrantes de prueba menos el número de gusanos en el cuadrante de control, dividido por el número total de lombrices. Un índice quimiotáctico cerca de + 1 indica atracción, mientras que un índice quimiotáctico cerca de -1 indica repulsión.
Ahora que hemos aprendido a establecer un ensayo de quimiotaxis, echemos un vistazo a cómo se aplican estos experimentos para responder preguntas científicas.
Una de las formas se han aplicado los ensayos de quimiotaxis en C. elegans es para estudiar el aprendizaje y la memoria. Por ejemplo, gusanos pueden estar condicionados a asociar un estímulo químico a una fuente de alimento. Well-FED gusanos están hambrientos de una hora, y luego están condicionados con alimentos, así como un químico como butanona.
A continuación, los gusanos se llevan a cabo en un plato con comida, pero sin butanona. Ejecutar una voluntad de ensayo de quimiotaxis y determinar si los gusanos aprendieron a asociar butanona con alimentos. Muchas variaciones de este experimento pueden realizarse para determinar otra información como que los genes o las neuronas son importantes para el aprendizaje y la memoria.
Adaptación olfativa es un fenómeno que se produce cuando las neuronas sensoriales disminuyen su respuesta a un estímulo con el tiempo, permitiendo al animal responder a otros, posiblemente más importantes, estímulos. Por ejemplo, tipo salvaje C. elegans expuestos a un olor durante un período de tiempo, se ignoran ese olor durante un ensayo de quimiotaxis debido a la adaptación olfativa, en lugar de ser atraídos a él. Por lo tanto, se pueden realizar pantallas genéticas de alto rendimiento para revelar los reguladores genéticos de adaptación olfativa, como egl-4. Además, se observan gusanos transgénicos expresando proteínas fluorescencia de etiquetado para los cambios en la localización durante la adaptación olfatoria.
Por último, ensayos de quimiotaxis pueden utilizarse en C. elegans para estudiar la enfermedad de Alzheimer. Los científicos pueden expresar péptido beta amiloide humano etiquetado fluorescente - un rasgo distintivo de la enfermedad de Alzheimer - en las neuronas de C. elegans. Interesante, ensayos de quimiotaxis revelaron que gusanos expresando beta amiloide en una población de neuronas muestran quimiotaxis reducida a un quimio-atrayente en comparación con el control. Se podrían realizar muchas variaciones de este experimento, incluyendo expresar beta amiloideo en otras poblaciones de neuronas o tejidos, o para determinar si cualquier compuestos pueden aliviar los efectos de la expresión de beta amiloide, en última instancia conduce a una terapia potencial .
Sólo ha visto la introducción de Zeus quimiotaxis en C. elegans. En primer lugar, definimos qué chemotaxis es y por qué es importante en la naturaleza de los organismos y las células. Entonces demostramos cómo realizar un ensayo de quimiotaxis con C. elegans. Finalmente, discutimos cómo quimiotaxis pueden ser aplicado para entender el aprendizaje y memoria, adaptación olfativa y la enfermedad de Alzheimer. ¡Gracias por ver!
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